基于發(fā)病機(jī)制分析2 型糖尿病周圍神經(jīng)病變的關(guān)鍵基因及重要通路

陳曉毓，馬匠心，張海濱，陳旎瑤，劉清權(quán)

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，福建泉州 362000；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，福建泉州 362000

據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)估計(jì)，2021 年全球成年糖尿病患者數(shù)為5.37 億[1]。我國(guó)糖尿病患病率居全球首位[2]，患病率為12.4%[3]，糖尿病前期患病率達(dá) 35.7%[4]。糖尿病可發(fā)生多種并發(fā)癥，糖尿病周圍神經(jīng)病病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）為常見(jiàn)并發(fā)癥，但DPN 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。到目前為止，具體機(jī)制尚不清楚。隨著二代測(cè)序技術(shù)發(fā)展，DPN相關(guān)基因調(diào)控受到關(guān)注。研究表明Toll 樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)是2 型糖尿病神經(jīng)病變（type 2 diabetic peripheral neuropathy,T2DPN）的候選保護(hù)基因，與患病率密切相關(guān)[5]。但對(duì)DPN 缺乏系統(tǒng)性調(diào)控機(jī)制的研究，通過(guò)生物信息學(xué)分析探索疾病機(jī)制是有效手段。本研究從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)下載了包含正常人、DPN 患者外周血的基因芯片，利用生物信息學(xué)技術(shù)，分析得到兩者相關(guān)的差異表達(dá)基因，篩選出關(guān)鍵核心基因，并對(duì)2021 年6—12 月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的T2DPN患者20 例和體檢中心健康人18 名的外周血淋巴細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，為DPN 發(fā)生機(jī)制以及治療提供新的思路。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載GSE95849 數(shù)據(jù)集，該芯片數(shù)據(jù)包括6 例2型DPN 患者和6 名正常人。

1.2 DEG 識(shí)別和功能富集

用R 語(yǔ)言對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再用limma 包分析正常樣本和DPN 樣本的差異表達(dá)基因，差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）的篩選標(biāo)準(zhǔn)是：|logFC|≥2 及P＜0.05。

對(duì)獲得的差異基因，利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 和KEGG 功能富集分析，富集通路定義為P＜0.05。

1.3 核心基因篩選

利用STRING 在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.string-db.org/）預(yù)測(cè)DEG 對(duì)應(yīng)蛋白的互作關(guān)系，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（設(shè)置combined score＞0.4）。STRING 分析結(jié)果用Cytoscape 3.8.0.軟件進(jìn)行可視化，并使用Cytohubba 對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)再次分析核心基因的篩選，具體為：通過(guò)Cytohubb 確定Betweenness、Degree、Closeness、EPC、MCC 5 種計(jì)算法獲得top10 的基因，并取這些基因的交集獲得關(guān)鍵基因。

1.4 一般資料

選取本院內(nèi)分泌科住院的T2DPN 患者18 例和體檢中心健康人名20 名，分為疾病組和對(duì)照組。其中疾病組即DPN 組，男13 例，女5 例；平均年齡（57.9±8.3）歲。對(duì)照組即健康組，男16 名，女4 名；平均年齡（47.7±9.8）歲。所有患者均簽署了研究知情同意書，且研究通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.5 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：知情同意；明確診斷T2DPN；能夠積極配合調(diào)查與試驗(yàn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他嚴(yán)重糖尿病并發(fā)癥者；精神疾病者；惡性腫瘤者；1 型糖尿病者；家族遺傳疾病者；基因缺陷病者。

1.6 RNA 提 取與qRT-PCR 驗(yàn)證

收集年齡與性別相匹配的DPN 及健康人外周血標(biāo)本18 例和20 名。所有參與者均簽署了知情同意書后采集血樣，再遵循protocal 試劑制造商的協(xié)議加入人外周血淋巴細(xì)胞分離液后離心，將提取出的PBMC 加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液后存于-80℃冰箱，再提取出人外周血淋巴細(xì)胞總RNA，再用TAKARA試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后按照TB Green Premix EX Taq（Tli RNaseH）均勻加樣、離心、標(biāo)記后放入PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增后電泳檢測(cè)，再以GAPDH 為內(nèi)參，用2-ΔΔCT 相對(duì)定量法分析待測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄水平。所用引物序列，見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR 使用引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以中位數(shù)和四分位距（25%和75%位數(shù)）表示，采用秩和檢驗(yàn)（雙側(cè)）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 數(shù)據(jù)預(yù)處理及DEGs 的篩選

預(yù)處理結(jié)果如下：共包含12 例樣本，其中正常外周血樣本6 例，2 型糖尿病外周血樣本6 例，基于篩選標(biāo)準(zhǔn) |logFC|≥2 及P＜0.05，見(jiàn)圖1。

圖1 627 個(gè)DEGs 基因表達(dá)火山圖。

2.2 DEGs 的功能富集分析

KEGG 分析結(jié)果顯示差異表達(dá)基因主要和PI3K-Akt 信號(hào)通路等過(guò)程有關(guān)，基因比例與數(shù)目均明顯高于其他途徑。見(jiàn)圖2。

圖2 KEGG 分析結(jié)果顯示DEGs 所涉及的信號(hào)通路

2.3 DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及核心基因的確定

基于DEGs 分析結(jié)果利用PPI 網(wǎng)絡(luò)在其中挑選出了TLR4 核心基因，并經(jīng)qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)證實(shí)TLR4核心基因在周圍神經(jīng)病變后表達(dá)升高（P=0.038）。見(jiàn)圖3，4。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖形

韋恩圖最終確定了PPI 網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置的4 個(gè)核心基因分別是CSF1R、SELL、TLR4、TNF。

2.4 qRT- PCR 驗(yàn)證核心基因（TLR4）

疾病組與正常組各18 和20 個(gè)樣本，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.038）。結(jié)果與前述分析結(jié)果相一致。見(jiàn)圖5。

圖5 TLR4 qRT-pcr 驗(yàn)證結(jié)果

圖4 核心基因韋恩圖

3 討論

有研究表明TLR4 是2 型糖尿病和相關(guān)神經(jīng)病變的候選保護(hù)基因，與T2DPN 患病率降低密切相關(guān)，但都缺乏系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析。因此，重點(diǎn)運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)構(gòu)成核心基因的為TLR 家族成員的TLR4，并進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR 驗(yàn)證核心基因。

本研究發(fā)現(xiàn)，與健康組相比，DPN 患者在單核細(xì)胞中TLR4 的表達(dá)明顯升高(P=0.038)。結(jié)果表明，TLR4 關(guān)鍵基因?qū)2DPN 的發(fā)病機(jī)制有著巨大的意義。TLR4 基因是被廣泛研究的TLR 家族的代表，近幾年研究表明TLR4 是促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化、細(xì)胞因子釋放和組織損傷的主要受體。這種受體的存在可能表明先天調(diào)節(jié)的異常調(diào)節(jié)免疫，它有助于促炎介質(zhì)的產(chǎn)生和疾病的發(fā)展。其具體機(jī)制包括：TLR4 觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)，產(chǎn)生趨化因子，啟動(dòng)和控制關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，并觸發(fā)和放大炎癥因子反應(yīng)，介導(dǎo)腸腔內(nèi)抗原作為脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的識(shí)別[6]，隨后LPS 與TLR4 結(jié)合后，誘導(dǎo)TLR4 的下游信號(hào)通路可激活其下游髓系分化初級(jí)反應(yīng)蛋白88(MyD88)和核因子-κB(nuclear factor-kappaB,NFκB)[7]，并通過(guò)MyD88 的募集抑制PI3K-Akt 通路[8]，而PI3K/AKT 通路有助于脊髓損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)[9]，通過(guò)抑制其恢復(fù)作用使炎癥過(guò)程持續(xù)下去。也有越來(lái)越多的證據(jù)表明，TLR4/Myd88/NF-κB 和PI3K-Akt 信號(hào)通路之間存在串?dāng)_，激活PI3K/AKT信號(hào)通路可以抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路[10]。神經(jīng)毒性可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和凋亡，并最終引起神經(jīng)病變，但這種作用可以通過(guò)激活PI3K-Akt 信號(hào)通路而得到抑制，因此可預(yù)測(cè)：TLR4 基因與T2DPN 的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[11]。

近幾年來(lái)，關(guān)于TLR4 基因的研究越來(lái)越受到關(guān)注，很多研究者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TLR4 基因作為高遷移率組盒-1(high-mobility group box 1,HMGB1)警報(bào)蛋白的關(guān)鍵受體形成的HMGB1/TLR4 信號(hào)通路軸通過(guò)釋放的細(xì)胞外HMGB1 與TLR4 相互作用，激活炎癥通路，刺激體內(nèi)的炎癥反應(yīng)[12]。此次研究預(yù)測(cè)HMGB1/TLR4 信號(hào)通路與DPN 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

結(jié)合前述研究和驗(yàn)證本文可得出結(jié)論：HMGB1/TLR4 信號(hào)通路與DPN 的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)。但未對(duì)此信號(hào)通路的完整通路進(jìn)行研究和驗(yàn)證，可能是尚未發(fā)掘新的發(fā)病機(jī)制，若進(jìn)一步深入研究可為T2DPN 精準(zhǔn)治療提供新的診療方向。