不同血糖控制狀態(tài)的2型糖尿病患者腸道菌群的差異和預(yù)測價值

閆 肅，秦 遷，陳靜鋒，楊 陽，閆 航，李田田，高鑫鑫，王佑翔，丁素英

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院健康管理中心 鄭州 450052

隨著經(jīng)濟水平的發(fā)展，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的發(fā)病率逐年上升。2020年的流行病學(xué)調(diào)查[1]顯示我國糖調(diào)節(jié)受損患病率達15.5%，T2DM患病率達11.2%，T2DM中血糖控制不理想者超過60%。長期處于高血糖狀態(tài)會引發(fā)冠心病、腦卒中、腎動脈硬化和狹窄、肢端動脈硬化等疾病，給家庭和社會帶來沉重負擔(dān)[2]。但T2DM的發(fā)病機制復(fù)雜，至今尚未完全闡明。除了經(jīng)典的胰島素抵抗學(xué)說，近年來研究[3]發(fā)現(xiàn)“人體第二基因組”——腸道菌群，在肥胖、糖尿病等代謝疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。腸道菌群參與了人體的消化吸收、糖脂代謝、能量轉(zhuǎn)運、免疫等過程[4]，腸道菌群的紊亂還會影響代謝疾病(肥胖、糖尿病等)的發(fā)生發(fā)展[5]。目前的研究[6-9]發(fā)現(xiàn)T2DM患者腸道菌群中乳酸桿菌增加，而雙歧桿菌減少；在服用了二甲雙胍之后，腸桿菌科細菌、酵母菌減少，雙歧桿菌、擬桿菌增多。以上研究主要著重于T2DM腸道菌群變化及相關(guān)的藥物干預(yù)研究。本研究著重于從α多樣性、β多樣性以及物種差異等多方面分析不同血糖控制狀態(tài)的T2DM患者腸道菌群特征，并基于差異腸道菌群數(shù)據(jù)建立T2DM患者血糖控制情況的預(yù)測模型，探討基于腸道菌群來干預(yù)血糖代謝和強化血糖控制的可行性。

1 對象與方法

1.1 研究對象研究對象來源于2018至2019年在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢的人群，參與者均已簽署知情同意書，該研究由該院倫理委員會審核批準(2018-KY-90)。納入標準：具備完整的問卷調(diào)查結(jié)果和體檢結(jié)果；年齡在20～70歲；體檢顯示頸部血管彩超、心臟彩超、腹部彩超、泌尿系統(tǒng)彩超無明顯異常；診斷為T2DM，糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)大于6.5%。根據(jù)微生物α多樣性計算樣本量[10]，以檢驗水準為0.05、把握度為80%，通過PASS軟件計算可知至少需要60例樣本。最終共納入72例，其中27例血糖控制理想(HbA1c<7%)，45例血糖控制不理想(HbA1c≥7%)。

1.2 數(shù)據(jù)收集由接受過統(tǒng)一培訓(xùn)的人員進行健康風(fēng)險評估問卷調(diào)查及健康體檢，收集人口學(xué)特征、病史、生活習(xí)慣、身高、體重、腰圍、收縮壓、舒張壓等資料。禁食12 h后抽血檢測空腹血糖(fasting blood-glucose,FBG)、HbA1c、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)，使用羅氏全自動生化分析儀(Cobas-8000)進行檢測。采集糞便標本，單獨分裝后放入-80 ℃冰箱冷凍待測。

1.3 腸道菌群宏基因組測序使用糞便DNA提取試劑盒(Magen中國)提取糞便標本中微生物群落DNA。使用Qubit dsDNA BR試劑盒(美國Invitrogen公司)與Qubit熒光計對DNA進行定量，并檢測提取質(zhì)量。基因組DNA被超聲破碎形成隨機化片段并進行挑選，挑選的片段經(jīng)擴增、純化等步驟后得到單鏈環(huán)狀DNA，格式化后形成最終文庫，并通過質(zhì)量控制鑒定。合格文庫在BGISQ-500平臺(BGI-深圳，中國)上測序。對測序數(shù)據(jù)進行定性控制，去除混雜序列，包括人體基因組序列、食物基因組序列、低質(zhì)量序列等。通過Metaphlan2對測序文庫進行宏基因組分類和注釋，得到各層次物種的標準相對豐度值。

1.4 統(tǒng)計分析使用R4.0.2、STAMP2.1.3和PASS 15進行統(tǒng)計分析。采用兩獨立樣本t檢驗或χ2檢驗比較2組人口學(xué)、實驗室檢測指標和人體測量指標的差異。使用STAMP軟件分析組間菌群相對豐度的差異，2組間比較采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗，多變量校正采用Benjamini-Hochberg FDR；計算每組的菌群陽性率并去除陽性率低于10%的數(shù)據(jù)以去除可能的假陽性。根據(jù)微生物種類及其相對豐度，使用R語言“vegan”包分別計算每個樣本的shannon指數(shù)和obs指數(shù)、樣本間的bray距離和Spearman距離，用于分別判斷α、β多樣性，然后采用兩獨立樣本t檢驗比較2組α多樣性，采用“ade4”包進行主坐標分析比較β多樣性。預(yù)測模型采用Logistic回歸模型，將得到的差異菌群的相對豐度作為自變量，以血糖控制情況為因變量，采用逐步法進行Logistic回歸分析，構(gòu)建預(yù)測模型，利用“pROC”包繪制預(yù)測模型的ROC曲線，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組患者一般資料的比較2組患者在性別、年齡、腰圍、BMI、收縮壓、舒張壓、TC、TG、HDL、LDL、規(guī)律飲食、飲食習(xí)慣、食用全谷物、飲用酸奶、吸煙、飲酒、運動情況、服用降糖藥等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與血糖控制理想組相比，血糖控制不理想組的FBG和HbA1c較高(P<0.05)。見表1。

表1 2組患者一般資料的比較

2.2 2組腸道菌群多樣性的差異由圖1可知，在α、β多樣性上，血糖控制理想組與血糖控制不理想組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 2組腸道菌群相對豐度的差異在種水平上，對比2組間菌群豐度的差異，發(fā)現(xiàn)有17個種的相對豐度存在差異，其中有4個種富集于血糖控制理想組，分別為Coprococcuscomes、Fusobacteriumulcerans、Bacteroidesintestinalis、Ruminococcusgnavus，13個種富集于血糖控制不理想組，分別為Mitsuokellamultacida、Acidaminococcusunclassified、Klebsiellapneumoniae、Bacteroidesfinegoldii、Bacteroidescoprophilus、Citrobacterunclassified、Parabacteroidesunclassified、Lactobacillusruminis、Megamonasrupellensis、Bacteroidesuniformis、Enterococcusfaecalis、Megamonashypermegale、Dialistersuccinatiphilus(圖2)。

2.4 T2DM患者血糖控制情況預(yù)測模型的建立與評價基于前文中的差異菌群，擬合Logistic回歸模型用于疾病的預(yù)測，采用逐步法，進入概率0.05，排除概率0.1，最后Ruminococcusgnavus、Bacteroidesintestinalis和Enterococcusfaecalis納入模型。根據(jù)回歸模型繪制ROC曲線，結(jié)果顯示ROC曲線的AUC為0.770(95%CI：0.665～0.875)，靈敏度為0.655，特異度為0.852，約登指數(shù)為0.507，見圖3。

A、B:α多樣性評價；C、D：β多樣性評價；good：血糖控制理想組；bad：血糖控制不理想組；PCoA1(21.59%)表示第一主成分能夠解釋總體可變性的21.59%；PCoA2(11.12%)表示第二主成分能夠解釋總體可變性的11.12%

圖2 2組患者菌群相對豐度的差異

圖3 腸道菌群預(yù)測T2DM患者血糖控制情況的ROC曲線

3 討論

眾所周知，T2DM治療主要依靠生活方式干預(yù)及藥物治療，但仍然有部分人群的血糖控制不理想。研究[5]表明腸道菌群可以通過影響人體的多糖分解代謝來調(diào)控血糖穩(wěn)態(tài)，這為T2DM的防治提供了新思路。因此，本研究分析了T2DM人群中血糖控制情況與菌群分布情況，為調(diào)控血糖提供新的思路。

在本研究中，血糖控制理想和不理想組年齡、性別、BMI、腰圍、血壓、血脂、生活習(xí)慣差異無統(tǒng)計學(xué)意義。進一分析腸道菌群的α與β多樣性，發(fā)現(xiàn)2組間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究將優(yōu)勢菌定義為至少在10%的樣本中出現(xiàn)，以去除可能的假陽性，菌群豐度分析結(jié)果表明，4個菌種富集于血糖控制理想組，13個富集于血糖控制不理想組。其中Coprococcuscomes、Ruminococcusgnavus、Bacteroidesintestinalis等富集在血糖控制理想組。Graessler等[11]發(fā)現(xiàn)減肥手術(shù)后患者Coprococcuscomes的豐度增加，并且伴隨著血糖水平的降低與血脂的改善，這可能是由于Coprococcuscomes能夠利用果糖與葡萄糖產(chǎn)生丁酸鹽，從而增加了短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFA)的水平[12]。此外，有研究[13]表明富集在血糖控制理想組的Ruminococcusgnavus能夠利用巖藻糖基化聚糖增加SCFA的水平。SCFA具備調(diào)節(jié)免疫、改善系統(tǒng)性炎癥及調(diào)節(jié)血糖代謝等功能[14]。這可能是由于SCFA一方面能夠抑制腫瘤壞死因子、干擾胰島素信號通路的蛋白質(zhì)，從而增加骨骼肌葡萄糖攝取[15]，另一方面還可以通過促進脂肪細胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4基因表達來增加肝細胞對葡萄糖攝取，最終達到調(diào)節(jié)血糖的作用[16]；動物研究[17]還表明，SCFA可以提高糖尿病動物胰島素敏感性，改善血糖控制情況。在使用小麥肽和巖藻多糖組合治療成人慢性淺表性胃炎時發(fā)現(xiàn)Bacteroidesintestinalis明顯增加，胃痛、腹脹等癥狀顯著減少，同時糞便中鈣衛(wèi)蛋白水平降低，SCFA水平增加[18]。另一項菌群培養(yǎng)實驗[19]發(fā)現(xiàn)，Bacteroidesintestinalis能夠降解膳食纖維中常見的阿拉伯木聚糖而產(chǎn)生阿魏酸。阿魏酸是一種酚類化合物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抗炎活性。綜上可知，這些菌作為益生菌，主要是SCFA的生產(chǎn)者，可以改善肥胖和T2DM的宿主代謝，降低炎癥反應(yīng)，減輕免疫紊亂。

而在血糖控制不理想組中，Enterococcusfaecalis的豐度較血糖控制理想組高。研究[20]表明Enterococcusfaecalis可以將三甲基賴氨酸代謝為TMAVA(N,N,N-三甲基-5-氨基戊酸)，從而減少SCFA的分泌，促進肝臟脂肪積累，導(dǎo)致肝臟脂肪變性和誘發(fā)胰島素抵抗，提示在血糖控制不理想的狀態(tài)下，Enterococcusfaecalis可能加重了胰島素抵抗。除了降低SCFA的水平，我們在血糖控制不理想組還發(fā)現(xiàn)條件致病菌Bacteroidescoprophilus，Citrobacterunclassified，Lactobacillusruminis和Klebsiellapneumoniae。它們很少引起嚴重感染，但卻是導(dǎo)致菌血癥等疾病的機會病原體[21]。研究[22]表明：它們能夠促進炎癥因子表達，包括白介素1β、腫瘤壞死因子α和白介素17等；此外，還能夠編碼特異性抗原，刺激B淋巴細胞分泌特異性抗體與之結(jié)合從而引起腸道異常炎癥變化等。值得一提的是，大約5%的健康人腸道內(nèi)存在Klebsiellapneumoniae。其導(dǎo)致炎癥反應(yīng)主要是通過產(chǎn)生豐富的莢膜多糖(CPS)，從而引起侵襲性綜合征[23]，而高血糖水平可能會刺激CPS生物合成和cps基因表達，進一步導(dǎo)致Klebsiellapneumoniae對中性粒細胞的吞噬作用耐受，最終促進侵襲性綜合征的發(fā)生發(fā)展，這可能進一步輔證了T2DM血糖控制不理想容易并發(fā)各種感染性疾病及傷口不容易愈合。綜上可知，富集在血糖控制不理想組的菌群一方面通過減少SCFA的分泌導(dǎo)致胰島素抵抗，促進慢性炎癥，導(dǎo)致脂肪沉積，加重脂毒性和胰島素抵抗；另一方面，通過條件致病菌導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，加速T2DM感染性疾病的發(fā)生發(fā)展。

最后，基于菌群差異分析的結(jié)果，采用Logistic逐步回歸法構(gòu)建血糖控制情況預(yù)測模型，其AUC值為0.770，這表明基于腸道菌群可以輔助預(yù)測人體血糖控制情況。

總之，本研究系統(tǒng)分析探究了T2DM人群中血糖控制理想者和血糖控制不理想者腸道菌群的差異，基于這些差異建立了腸道菌群血糖控制情況預(yù)測模型并取得了良好的預(yù)測效果，為基于腸道菌群精準膳食和精準醫(yī)療提供了新思路。