PPAR-α的激活對(duì)心力衰竭早期心肌功能的機(jī)制研究

王理亞，單艷華，劉永萍，孫丁

能量代謝的改變?cè)谛牧λソ撸╤eart failure，HF）的進(jìn)展中起重要作用［1］，在健康人群中，脂肪酸的氧化作用提供了心臟所需ATP 的70%，其余的大部分來自丙酮酸的氧化，而丙酮酸的氧化作用與糖酵解和乳酸的氧化作用大致相等［2-3］。而晚期心力衰竭患者的心臟喪失其代謝靈活性，并且在很大程度上依賴于葡萄糖氧化，而不是依賴于作為優(yōu)先代謝底物的脂肪酸氧化（FAO）［4］。但是，目前尚不清楚這種代謝重塑是導(dǎo)致HF 發(fā)生和發(fā)展的適應(yīng)性機(jī)制還是適應(yīng)不良的過程。

過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是配體激活的核受體超家族的成員，并且是控制心肌線粒體FAO 能力的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［5］。PPAR 包含PPAR-α，PPAR-β/和PPAR-γ的三個(gè)成員，其中PPAR-α 在心肌細(xì)胞中高表達(dá)，并通過該途徑中編碼關(guān)鍵蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄激活來調(diào)節(jié)脂肪酸攝取、酯化和氧化等關(guān)鍵成分的表達(dá)［6-7］。已有研究表明，PPAR-α 的缺乏會(huì)導(dǎo)致對(duì)慢性壓力超負(fù)荷心衰肥大性生長(zhǎng)和心臟功能障礙，這表明PPAR-α 會(huì)減輕壓力超負(fù)荷后的心臟重構(gòu)［8］。相反，PPAR-α（MHPPAR-α）的過度表達(dá)會(huì)引起脂質(zhì)蓄積，尤其是在糖尿病心臟中，進(jìn)而導(dǎo)致心肌病的發(fā)生［9］。有研究表明，壓力過載HF后PPAR水平下降［10］。

2018 年1 月至2020 年1 月，我們使用誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因模型，使用橫向主動(dòng)脈縮窄（TAC）手術(shù)造模壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心臟肥大和HF 的小鼠模型，研究PPAR-α的表達(dá)的對(duì)HF進(jìn)展期的影響及初步機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 小鼠造模將C57BL/6 雄性小鼠用作野生型，將血凝素標(biāo)記的小鼠PPAR-α cDNA 亞克隆到pTet-Splice（Invitrogen）的HindⅢ位點(diǎn)，切下DNA 片段并用于原核注射。通過PCR 鑒定為陽性后，將其繁殖到C57BL/6小鼠以產(chǎn)生穩(wěn)定的Tg系（TRE-PPAR-α），以模擬在心力衰竭早期PPAR-α 的激活。同時(shí)準(zhǔn)備C57BL/6α-MHC-四環(huán)素反式激活因子（tTA）小鼠作為陰性對(duì)照。對(duì)十周齡的小鼠進(jìn)行TAC 手術(shù)，使用小型動(dòng)物呼吸器（SN-480-7）對(duì)動(dòng)物進(jìn)行氣管插管和通氣，并添加1.0%的異氟烷吸入以維持麻醉狀態(tài)。于胸部左側(cè)第二肋間處開胸，將一條7-0的絲線穿過無名頸動(dòng)脈和左頸總動(dòng)脈之間的橫向胸主動(dòng)脈，并用28號(hào)針頭在主動(dòng)脈周圍打結(jié)。結(jié)扎后，迅速拔出針頭并閉合皮膚。假手術(shù)組行同樣操作，但不結(jié)扎。將20 只C57BL/6 小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為TAC-DTG 組（行TAC 手術(shù)的雙轉(zhuǎn)基因小鼠）、TACtTA組（行TAC手術(shù)的tTA單轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照小鼠）、Sham-DTG組（假手術(shù)的雙轉(zhuǎn)基因小鼠）、Sham-tTA組（假手術(shù)的tTA 單轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照小鼠），每組5 只。研究起止時(shí)間為2018年1月至2020年1月。

1.2 經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖吸入1%異氟烷麻醉后，使用配備18～38 MHz 探頭的Visual Sonics Vevo 2100進(jìn)行超聲心動(dòng)圖分析。在胸骨旁短軸視圖中評(píng)估左心室收縮末期或舒張末期分別定義為左心室面積最小或最大的階段。從乳頭肌以LVM 型描記法測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）、舒張期LV 后壁（LVPWd）及射血分?jǐn)?shù)（EF）。

1.3 RT-PCR使用TRIzol 從心臟中分離總RNA。使用Prime Script RT 試劑盒對(duì)總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）和Thermal Cycler Dice 實(shí)時(shí)系統(tǒng)進(jìn)行定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）。根據(jù)轉(zhuǎn)錄起始因子的表達(dá)水平將靶基因的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化。RT-PCR 的引物序列如表1所示。

表1 RT-PCR中引物序列

1.4 Western blotting 檢測(cè)使用RIPA 裂解液獲得心肌總蛋白，通過BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定法確定心肌樣品的蛋白質(zhì)濃度。取40 μg 蛋白與上樣緩沖液混合均勻后與沸水中加熱5 min，在5%Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，150 V 電泳分離1 h 后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，清洗數(shù)次，于4 ℃下與各一抗溶液（1∶1 000）共孵育過夜。以TBST清洗三次，每次5 min，清洗完成后，于室溫下同二抗（1∶2 000）共孵育兩小時(shí)，以TBST 清洗3 次，每次10 min，除去二抗殘留液后，使用ECL Western blotting 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)化學(xué)發(fā)光并于Image J 進(jìn)行檢測(cè)。使用的抗體有PPAR-α，GAPDH及肌動(dòng)蛋白抗體。

1.5 心肌高能磷酸鹽測(cè)定將心臟組織用冷凍鉗于液氮中預(yù)冷。將冷凍樣品保存在液氮中并凍干過夜。然后將10 mg 凍干的組織加入0.6 N 冰冷的高氯酸溶液（適量），勻漿，并在4 ℃下以500 g 離心10 min。上清液以氫氧化鉀中和至pH 為5.0～7.0。10 min 后將提取物離心以除去高氯酸鉀，并將上清液用于檢測(cè)。磷酸肌酸，肌酸，三磷酸腺苷（ATP），二磷酸腺苷（ADP）和單磷酸腺苷（AMP）采用高效液相色譜法測(cè)定，分析柱為STR ODS-M C-18色譜柱。

1.6 離體心臟灌流以1.0%的異氟烷吸入麻醉小鼠，取下心臟并浸入預(yù)冷的Krebs-Henseleit 緩沖液中，隨后進(jìn)行主動(dòng)脈插管。離體的小鼠心臟在Langendorff 模式下于37 ℃在80 mmHg 的恒定灌注壓力下進(jìn)行灌注。灌注液為Krebs-Henseleit 緩沖液，其中含有1 mmol 乳酸、5 mmol 葡萄糖、1.2 mmol 棕櫚酸酯、3%的牛血清白蛋白和2.5 mmol 的游離鈣離子，以95%氧氣和5%二氧化碳（pH 為7.4）平衡。用含有［U-14C］葡萄糖和［9，10-3H］棕櫚酸酯的灌注液對(duì)心臟灌注20 min。通過分別從［U-14C］葡萄糖和［9，10-3H］棕櫚酸中定量收集14CO2和3H2O 來確定葡萄糖的氧化和棕櫚酸的氧化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。觀測(cè)資料主要是計(jì)量數(shù)據(jù)，以表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組比較。對(duì)單時(shí)間點(diǎn)的多組比較采用one-way ANOVA分析，對(duì)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的多組比較進(jìn)行重復(fù)測(cè)量ANOVA分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPAR-a表達(dá)對(duì)壓力超負(fù)荷所致HF心臟功能的影響為了確定PPAR-α 是否能夠減輕壓力超負(fù)荷HF中的心臟功能障礙，在10周齡時(shí)對(duì)tTA單轉(zhuǎn)基因小鼠和PPAR-α DTG小鼠進(jìn)行TAC手術(shù)。在12周齡時(shí)，多西環(huán)素（DOX）不再添加到飲用水中。我們?cè)u(píng)估了TAC術(shù)后0、4、6和8周時(shí)TAC心臟中PPAR-α誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間過程。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，TAC手術(shù)后PPAR-α表達(dá)的降低在PPAR-α雙轉(zhuǎn)基因（TG）小鼠中顯著減弱［術(shù)后0、4、6、8周分別為（1.00±0.03）、（0.90±0.08）、（0.66±0.09）、（0.58±0.05）］。TAC手術(shù)后8周，DTG小鼠中PPAR-α及其靶基因的mRNA表達(dá)顯著升高。tTA和DTG小鼠在TAC手術(shù)后第8周的收縮壓相似（98.7/2.9 mmHg 比95.8/3.0 mmHg）。超聲心動(dòng)圖分析顯示，與tTA小鼠相比，TAC后8周，DTG小鼠的LV收縮功能得到了顯著保留。左室擴(kuò)張也通過誘導(dǎo)PPAR-α的表達(dá)而明顯減弱。這些結(jié)果表明，在壓力超負(fù)荷HF期間PPAR-α的激活可改善心臟收縮力并減少LV擴(kuò)張。表2、表3、圖1。

表2 TAC術(shù)后8周時(shí)TAC組與Sham組小鼠PPAR-α及其靶基因的mRNA表達(dá)水平比較/

表2 TAC術(shù)后8周時(shí)TAC組與Sham組小鼠PPAR-α及其靶基因的mRNA表達(dá)水平比較/

注：PPAR-α為過氧化物酶體增殖物激活受體-α，CPT1為肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1，F(xiàn)ATP1為脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1。

圖1 PPAR-α的激活改善壓力超負(fù)荷心力衰竭中的心臟功能障礙：A為PPAR-α的激活；B為TAC手術(shù)后PPAR-α的表達(dá)與時(shí)間關(guān)系

表3 TAC術(shù)后8周TAC組與Sham組小鼠LVDd、LVPWd、EF水平比較/

表3 TAC術(shù)后8周TAC組與Sham組小鼠LVDd、LVPWd、EF水平比較/

注：LVDd為左心室舒張末期內(nèi)徑，LVPWd為舒張期LV后壁，EF為射血分?jǐn)?shù)。①與術(shù)后4 W時(shí)比較，P＜0.05。②與術(shù)后6 W時(shí)比較，P＜0.05。

2.2 PPAR-α 的表達(dá)對(duì)壓力超負(fù)荷HF 心臟重塑的影響TAC 手術(shù)后8 周，與tTA 心臟相比，DTG 小鼠的心臟質(zhì)量與體質(zhì)量之比和心臟質(zhì)量與脛骨長(zhǎng)度之比的增長(zhǎng)趨勢(shì)減弱。在DTG 心臟中，肺質(zhì)量與體質(zhì)量之比的增加也減弱（表4），表明誘導(dǎo)PPAR-α 表達(dá)可減輕壓力超負(fù)荷肥大并改善了壓力超負(fù)荷HF。通過在DTG 小鼠中TAC 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞橫截面積增加的減少確定組織肥大的減少（表5、圖2A 和2B）。為了測(cè)試PPAR-α 表達(dá)對(duì)心肌纖維化的作用，采用Masson Trichrome 染色，并通過LV 切片的組織學(xué)分析表明，在DTG 小鼠中，TAC 誘導(dǎo)的心肌纖維化明顯減少（表5、圖2C），同時(shí)分析纖維化相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)，觀察到PPAR-α 的表達(dá)顯著減弱了TAC 誘導(dǎo)的I 型膠原α1（Col1a1）和Col3a1 mRNA 水平。PPAR-α 的表達(dá)也改善了B 型利鈉肽和心鈉素的增加（表6）。總體而言，這些結(jié)果表明壓力超負(fù)荷HF 期間的PPAR-α 的表達(dá)可明顯減弱心臟重塑并改善了HF的進(jìn)展。

表4 TCA術(shù)后8周tTA組與DTG組小鼠HB/BW、HW/TL、LW/TL水平比較/

表4 TCA術(shù)后8周tTA組與DTG組小鼠HB/BW、HW/TL、LW/TL水平比較/

注：HB/BW 為心臟質(zhì)量/體質(zhì)量，HW/TL 為心臟質(zhì)量/脛骨長(zhǎng)度，LW/TL為肺部質(zhì)量/脛骨長(zhǎng)度。①與Sham-tTA 組比較，P＜0.05。②與Sham-DTG 組比較，P＜0.05。③與TAC-tTA組比較，P＜0.05。

表5 TCA術(shù)后8周tTA組與DTG組小鼠心肌細(xì)胞橫截面積、心肌纖維化程度水平比較/

表5 TCA術(shù)后8周tTA組與DTG組小鼠心肌細(xì)胞橫截面積、心肌纖維化程度水平比較/

注：①與Sham-tTA 組比較，P＜0.05。②與Sham-DTG 組比較，P＜0.05。③與TAC-tTA組比較，P＜0.05。

表6 TCA術(shù)后8周tTA組與DTG組小鼠BNP、Col1a1、Col3a1 mRNA水平比較/

表6 TCA術(shù)后8周tTA組與DTG組小鼠BNP、Col1a1、Col3a1 mRNA水平比較/

注：BNP為腦鈉肽，Col1a1為Ⅰ型膠原α1，Col3a1為Ⅲ型膠原α1。①與Sham-tTA 組比較，P＜0.05。②與Sham-DTG 組比較，P＜0.05。③與TAC-tTA組比較，P＜0.05。

2.3 PPAR-α 對(duì)心臟FAO 及心肌能量的影響進(jìn)一步考察PPAR-α 表達(dá)誘導(dǎo)的底物利用率和心肌能量的變化。TAC 手術(shù)后5 周，對(duì)心臟組織進(jìn)行了HPLC 分析，以確定由PPAR-α 表達(dá)引起的高能磷酸鹽代謝的變化。與tTA 單轉(zhuǎn)基因小鼠相比，具有PPAR-α 誘導(dǎo)作用的DTG 小鼠在TAC 誘導(dǎo)的HF 中，其ATP 濃度和磷酸肌酸與ATP 比率顯著提高（表7）。通過離體心臟灌注研究體外TAC 心臟中PPAR-α 表達(dá)對(duì)底物利用率的影響。在基線時(shí)，與tTA 單轉(zhuǎn)基因小鼠相比，DTG 小鼠的FAO 表達(dá)量顯著增加，同時(shí)葡萄糖氧化也相應(yīng)降低。TAC 手術(shù)后8 周，兩組的FAO 和葡萄糖氧化均有所降低，但與tTA組相比，DTG組的FAO比率顯著保留（表8）。綜上所述，HF 期間的PPAR-α 的激活可調(diào)節(jié)HF 心臟的代謝利用，特別是增強(qiáng)FAO和改善心肌能量。

表7 TCA術(shù)后5周tTA組與DTG組小鼠ATP、磷酸肌酸/ATP水平比較/

表7 TCA術(shù)后5周tTA組與DTG組小鼠ATP、磷酸肌酸/ATP水平比較/

注：ATP為三磷酸腺苷。①與Sham-tTA 組比較，P＜0.05。②與Sham-DTG 組比較，P＜0.05。③與TAC-tTA組比較，P＜0.05。

表8 TCA術(shù)后8周tTA組與DTG組小鼠棕櫚酸氧化速率、葡萄糖氧化速率水平比較/

表8 TCA術(shù)后8周tTA組與DTG組小鼠棕櫚酸氧化速率、葡萄糖氧化速率水平比較/

注：①與Sham-tTA 組比較，P＜0.05。②與Sham-DTG 組比較，P＜0.05。③與TAC-tTA組比較，P＜0.05。

3 討論

在本研究中我們通過誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因小鼠模型評(píng)估了PPAR-α 過表達(dá)在HF 進(jìn)展期影響，發(fā)現(xiàn)HF期間PPAR-α 的激活減弱了心臟功能障礙和HF 進(jìn)展，導(dǎo)致心臟重塑的減弱，HF 期間PPAR-α 的活化維持了FAO和心肌的能量。

除缺血性心臟病外，高血壓或主動(dòng)脈瓣狹窄引起的壓力超負(fù)荷仍是心衰的最常見原因［11］。在成年心臟中，F(xiàn)AO 是ATP 產(chǎn)生中大部分碳底物的來源［4］。相反，肥大的心臟比FAO 更依賴于葡萄糖氧化，因?yàn)槠咸烟茄趸男室菷AO 高，對(duì)于等量的ATP，所需的氧氣要少11%～12%，然而FAO 生產(chǎn)的三磷酸腺苷比葡萄糖氧化產(chǎn)生的三磷酸腺苷要多得多，補(bǔ)償性肥厚性HF 向無補(bǔ)償性肥厚性HF 的演變所致對(duì)葡萄糖氧化的更大依賴［12］。本研究表明在肥大心臟中調(diào)節(jié)FAO 可以延遲其發(fā)展為無代償性HF，肥厚性HF 期間由PPAR-α 過表達(dá)誘導(dǎo)引起的FAO輕度增強(qiáng)可維持心臟功能和心肌能量。

PPAR-α 是控制參與FAO 的基因表達(dá)的核受體，是心臟底物利用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑［13-14］。研究表明，在壓力過載HF 期間，PPAR-α 表達(dá)水平會(huì)降低。同時(shí)，用PPAR-α 激動(dòng)劑非諾貝特治療可顯著改善壓力超負(fù)荷HF 中的左室肥大和心臟功能［15-16］，但對(duì)PPAR-α 轉(zhuǎn)基因小鼠的研究表明，增強(qiáng)的FAO 對(duì)心肌有害［17］。因此，我們假設(shè)在晚期心力衰竭（FAO期減少）中誘導(dǎo)PPAR-α 會(huì)對(duì)心臟產(chǎn)生積極影響。PPAR-α，PPAR-β 和PPAR-γ 這三個(gè)PPAR 亞型具有相似的功能，并且彼此存在相互作用。因此，我們使用了四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，而不是使用其他方法來僅激活小鼠心臟中的PPAR-α。

使用特定的PPAR-α 激動(dòng)劑WY-14643 對(duì)大鼠壓力超負(fù)荷的心臟進(jìn)行的研究表明，肥大心臟中的PPAR-α 激活會(huì)嚴(yán)重?fù)p害心臟功能［18］。在本研究中，在HF 進(jìn)展階段，PPAR-α 的激活有利于維持心肌的FAO 和高能磷酸鹽的代謝，從而降低了葡萄糖的氧化，DTG 小鼠中維持的能量能改善心臟收縮力和HF 的進(jìn)展。這些結(jié)果表明，在HF 的進(jìn)展階段（能量饑餓階段）PPAR-α 的慢性活化可以維持心肌的FAO 和能量，從而對(duì)肥大HF 的進(jìn)展具有積極作用。

β 受體阻滯劑被證實(shí)可以顯著改善HF 患者的左室功能和預(yù)后，并且還可能對(duì)心臟產(chǎn)生間接代謝作用［19］。調(diào)節(jié)底物利用率可能是治療HF 患者的有前途的策略。在臨床試驗(yàn)中，PPAR-α 激動(dòng)劑貝特類藥物對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化有積極作用［20］，降低了發(fā)生重大心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)，但對(duì)HF 的風(fēng)險(xiǎn)沒有影響［21］。我們?cè)谛∈笾械难芯拷Y(jié)果表明，PPAR-α的輕度激活，特別是在通過誘導(dǎo)PPAR-α 表達(dá)，可能對(duì)HF有積極作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在心力衰竭期間激活PPAR-α 可以通過調(diào)節(jié)FAO 維持早期心肌能量，并減輕壓力超負(fù)荷心力衰竭的心臟重塑，因此在肥厚性HF 患者中，使用心肌閃爍顯像或超聲心動(dòng)圖確定能量饑餓階段并在此階段激活PPAR-α，進(jìn)而激活FAO可能是治療HF有效策略。

（本文圖2見插圖4-2）

圖2 PPAR-α的激活對(duì)HF心臟重塑的影響：2A為蘇木精曙紅染色的代表性圖像；2B為心肌細(xì)胞橫截面代表性圖像（小麥胚芽凝集素染色×500）；2C為Masson Trichrome染色的代表性圖像（Masson Trichrome染色×200）