基于DNA條形碼的向日葵田彎管列當(dāng)種群遺傳多樣性研究

張毅笑 魏守輝 姜翠蘭 黃兆峰 蘇杰天 孟帥帥 云曉鵬 白全江 吳文龍 黃紅娟

摘要 彎管列當(dāng)是危害我國向日葵最嚴(yán)重的寄生雜草。為了明確我國向日葵田彎管列當(dāng)種群的遺傳多樣性，本試驗(yàn)利用rbcL、matK、ITS2條形碼序列對采自我國向日葵主產(chǎn)區(qū)的58份彎管列當(dāng)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序，采用Vector NTI軟件對測序結(jié)果進(jìn)行剪切比對，利用MEGA 6.0軟件計(jì)算種內(nèi)遺傳距離并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用掃描電鏡觀察其種子的顯微形態(tài)特征。結(jié)果表明，3個(gè)DNA 條形碼序列中僅ITS2片段擴(kuò)增測序結(jié)果理想并表現(xiàn)出較好的聚類結(jié)果。各樣品ITS2序列剪切比對后長度為453 bp，種內(nèi)遺傳距離為0.002～0.007，通過比較各樣品ITS2序列的堿基組成和差異位點(diǎn)，能將不同彎管列當(dāng)種群區(qū)分開。ITS2聚類結(jié)果表明58份彎管列當(dāng)樣品聚為3類，分別為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。形態(tài)分類結(jié)果表明，不同類型彎管列當(dāng)在植株形態(tài)、種子形狀及微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面存在差別。由于不同彎管列當(dāng)種群的生境、寄主（向日葵栽培品種）不同，其種群遺傳進(jìn)化差異顯著。基于ITS2 條形碼和掃描電鏡形態(tài)學(xué)觀察相結(jié)合的方法可用于彎管列當(dāng)種群遺傳多樣性研究。

關(guān)鍵詞 彎管列當(dāng); DNA條形碼; ITS2序列; 種子形態(tài); 遺傳多樣性

中圖分類號： S453

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021039

Abstract Orobanche cernua Loefling is the most serious parasitic weed that threats the production of sunflower in China. To clarify the genetic diversity of different O.cernua populations in sunflower fields， barcode fragments of rbcL， matK and ITS2 were used for PCR amplification and sequencing of 58 samples of O.cernua collected from main sunflower-producing areas. The sequencing results were assembled using the Vector NTI software. MEGA 6.0 was used to calculate the intraspecific genetic distance and construct phylogenetic trees. The microscopic morphological characteristics of O.cernua seeds were observed by scanning electron microscope. The results showed that， among the three DNA barcodes， only the results of amplification and sequencing of ITS2 fragments were satisfactory and showed better clustering effect. The length of ITS2 sequences after shear alignment was 453 bp. The intraspecific genetic distance was 0.002-0.007. By comparing the base composition and differential sites of ITS2 sequences of each sample， different O.cernua populations could be distinguished. The clustering results of ITS2 showed that 58 samples of O.cernua were divided into three groups， which could be classified as type Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ. The results of morphological classification showed that there were differences in plant morphology， seed shape and micro-morphological structure among different types. There were significant differences in the population genetic evolution among different O.cernua populations originated from different habitats and hosts （sunflower cultivars）. The method based on ITS2 barcoding and morphological observation by scanning electron microscope could be used to study the population genetic diversity of O.cernua.

Key words Orobanche cernua; DNA barcoding; ITS2 sequence; seed morphology; genetic diversity

彎管列當(dāng)Orobanche cernua Loefling是列當(dāng)科Orobanchaceae列當(dāng)屬Orobanche的根部全寄生性雜草，廣泛分布于世界各地。在我國主要分布在吉林、內(nèi)蒙古、河北、山西、陜西、甘肅、青海和新疆等地，可寄生在向日葵根上對其產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重危害[14]。彎管列當(dāng)被認(rèn)為是起源于保加利亞，寄主為菊科Asteraceae蒿屬Artemisia植物或禾谷類植物。20世紀(jì)50年代隨著向日葵廣泛種植、引種，其寄主發(fā)生適應(yīng)性改變[5]。1957年彎管列當(dāng)首次在我國河北省懷來縣向日葵Helianthus annuus L.上被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道[6]。近年來，由于向日葵播種面積不斷擴(kuò)大，該雜草已擴(kuò)散至我國向日葵主要產(chǎn)區(qū)內(nèi)蒙古、新疆等地[3]，嚴(yán)重阻礙了向日葵生產(chǎn)，被列為國家進(jìn)境檢疫性雜草[7]。由于彎管列當(dāng)在中國分布范圍廣，不同地區(qū)向日葵種源復(fù)雜、生境不同，造成彎管列當(dāng)遺傳背景復(fù)雜且存在不同致病力生理小種的分化[810]，從而導(dǎo)致不同彎管列當(dāng)種群的形態(tài)、遺傳進(jìn)化程度存在一定差異。在對我國向日葵田彎管列當(dāng)?shù)奈：M(jìn)行調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同彎管列當(dāng)種群形態(tài)上存在明顯差別，主要表現(xiàn)在植株大小、花序形態(tài)和花朵數(shù)目等方面，但不同種群的致病力、生理小種以及之間的親緣關(guān)系仍不清楚。而明確不同形態(tài)彎管列當(dāng)種群遺傳多樣性及親緣關(guān)系，對防治彎管列當(dāng)和向日葵抗性育種具有重要的科學(xué)意義。

由于彎管列當(dāng)在植株大小、花序長度、花萼裂片分裂度及花的顏色和大小等方面有變化，其命名較為混亂。根據(jù)《中國植物志》的描述，在《蘇聯(lián)植物志》和《內(nèi)蒙古植物志》中，將彎管列當(dāng)鑒定為O.cumana。實(shí)際上，O.cumana是O.cernua的一個(gè)變種，在《中國植物志》和《巴基斯坦植物志》中，已經(jīng)將O.cumana及O.cernua var. cumana（Wallr.）G. Beck作為O.cernua的異名處理[11]。目前，這兩個(gè)名字在文獻(xiàn)中都有記載，因此有關(guān)其分類鑒定及遺傳多樣性分析至關(guān)重要。國內(nèi)外已有從形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳多樣性方面研究列當(dāng)屬植物分類鑒定的報(bào)道。王定國等[12]和Pujadas-Salvà等[13]采用形態(tài)學(xué)分類方法，通過植株外部形態(tài)特征和種子電鏡掃描顯微形態(tài)特征對O.cumana和O.cernua進(jìn)行分類，結(jié)果表明二者親緣關(guān)系較近，但在植株大小、花序形狀、花朵數(shù)目以及種子顯微形態(tài)特征等方面存在明顯的區(qū)別。其中，O.cumana植株細(xì)高，穗狀花序松散，有20～50朵花，花冠白色或者淡藍(lán)色，種子形狀不規(guī)則，種臍不明顯，種皮表面有脊?fàn)钔黄鸬姆叫未缶W(wǎng)紋，網(wǎng)紋里有形狀規(guī)則的小網(wǎng)眼;而O.cernua植株比O.cumana植株矮，花序較密集，有50～70朵花，花冠藍(lán)色、深紫色或紫色，種子橢圓形，種臍明顯，種皮表面有長方形大網(wǎng)紋，網(wǎng)紋里有形狀不規(guī)則的小雕痕。Pineda-Martos等[14]利用共顯性SSR分子標(biāo)記研究了西班牙向日葵田O.cumana群體的遺傳多樣性，結(jié)果表明在同一種群中同時(shí)存在兩個(gè)基因庫，并且它們之間發(fā)生了基因重組。遠(yuǎn)緣基因庫之間的基因重組是產(chǎn)生新變異的重要機(jī)制，也可能導(dǎo)致該物種進(jìn)化。Benharrat等[15]利用rbcL（葉綠體1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基編碼基因rubisco large subunit）質(zhì)體基因進(jìn)行核苷酸序列分析，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征對采自法國西部的120多份列當(dāng)屬樣品進(jìn)行鑒定，提出了將分子鑒定和形態(tài)特征分析相結(jié)合來確定物種的新方法，并討論了rbcL在分類學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值。Kirilova等[16]基于核糖體ITS （internal transcribed spacer，核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）序列的種屬區(qū)分方法，對從保加利亞不同地區(qū)土壤樣品中分離的Phelipanche ramosa L.、P.mutelii、O.cumana種子進(jìn)行分類鑒定，研究3個(gè)物種的種群結(jié)構(gòu)和種內(nèi)變異，結(jié)果表明O.cumana種群目前是穩(wěn)定的，P.mutelii種群正處于活躍擴(kuò)張時(shí)期，而P.ramosa種群正在收縮。雖然國內(nèi)外已有列當(dāng)種群分類鑒定的相關(guān)報(bào)道[1213]，但形態(tài)學(xué)上有差異的彎管列當(dāng)種群分化和進(jìn)化關(guān)系以及種群內(nèi)的遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性尚不明確。近年來，隨著分子技術(shù)的飛速發(fā)展，DNA 條形碼技術(shù)（DNA barcoding）在生物多樣性評估和物種鑒定中的應(yīng)用越來越廣泛[1720]。DNA 條形碼（DNA barcode）是利用生物體內(nèi)一段標(biāo)準(zhǔn)的、高度保守的、易擴(kuò)增且相對較短的DNA 片段對物種進(jìn)行快速分類的技術(shù)，是對傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法的有效補(bǔ)充[21]。利用DNA條形碼技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)分類學(xué)方法，可從形態(tài)、分子水平對不同彎管列當(dāng)種群進(jìn)行分類鑒定及遺傳多樣性分析。

目前，國內(nèi)針對彎管列當(dāng)?shù)难芯恐饕性诩纳鷻C(jī)理、生物學(xué)特性、生理小種鑒定、危害和防除等方面，有關(guān)彎管列當(dāng)群體內(nèi)遺傳多樣性的研究鮮見報(bào)道，尚無人采用DNA條形碼技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)分類學(xué)方法對彎管列當(dāng)種群進(jìn)行分類鑒定及遺傳多樣性分析。本研究利用rbcL、matK（tRNA成熟酶編碼基因maturase K）、ITS2保守區(qū)段的序列特征和變異特點(diǎn)對采自我國向日葵主產(chǎn)區(qū)的58份彎管列當(dāng)樣品進(jìn)行遺傳進(jìn)化差異分析，同時(shí)結(jié)合彎管列當(dāng)種子掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）形態(tài)差異分析結(jié)果，探討不同彎管列當(dāng)種群的遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，分析我國彎管列當(dāng)種群的遺傳進(jìn)化程度，以期為防治彎管列當(dāng)和向日葵抗性育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料彎管列當(dāng)于2017年-2019年每年8月、9月從北京、河北、吉林、內(nèi)蒙古和新疆向日葵田采集，共計(jì)58份樣品。其中，北京延慶樣品1份（BJ1）;河北省涿鹿縣、蔚縣樣品3份（HB1，HB2，HB3）;吉林省農(nóng)安縣、長嶺縣、大安市、通榆縣、洮南區(qū)樣品14份（JL1，JL2，JL3，JL4，JL5，JL6，JL7，JL8，JL9，JL10，JL11，JL12，JL13，JL14）;內(nèi)蒙古開魯縣、武川縣、四子王旗、察哈爾右旗、達(dá)茂旗、烏拉特前旗、五原縣、臨河區(qū)樣品20份（NM1，NM2，NM3，NM4，NM5，NM6，NM7，NM8，NM9，NM10，NM11，NM12，NM13，NM14，NM15，NM16，NM17，NM18，NM19，NM20）;新疆新源縣、鞏留縣、北屯市、布爾津縣、哈巴河縣、吉木乃縣樣品20份（XJ1，XJ2，XJ3，XJ4，XJ5，XJ6，XJ7，XJ8，XJ9，XJ10，XJ11，XJ12，XJ13，XJ14，XJ15，XJ16，XJ17，XJ18，XJ19，XJ20）。采集的彎管列當(dāng)植株和種子樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取及檢測

稱取彎管列當(dāng)頂端幼嫩組織或苞片30 mg于2 mL離心管中，同時(shí)加入2粒直徑3 mm的無菌鋼珠，裝入適配器后液氮冷凍2 min，使用TissueLyser Ⅱ樣品破碎儀（北京天根生化科技有限公司）30 Hz破碎45 s，將樣品破碎至粉狀，利用新型植物基因組DNA提取試劑盒（DP320-03，天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品DNA的完整性，使用NanoDrop One超痕量UV分光光度計(jì)（基因有限公司）檢測DNA的濃度和純度，并將DNA稀釋至工作濃度30 ng/μL，置于-20℃冰箱保存。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測序

參考國際DNA條形碼通用引物[2224]進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序及分析（表1）。PCR反應(yīng)采用30 μL體系，包括DNA模板1 μL、上、下游引物各1 μL、2×TSINGKE Master Mix 15 μL、ddH2O 12 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，最適退火溫度退火30 s，72℃延伸相應(yīng)時(shí)間，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。置于T100TM PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司）完成擴(kuò)增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。最后利用Tanon-3500凝膠圖像分析系統(tǒng)（北京原平皓生物技術(shù)有限公司）觀察，選取條帶清晰、單一的PCR產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Vector NTI軟件對各個(gè)樣品測序峰圖進(jìn)行質(zhì)量分析，通過逐一檢查、校對堿基去除低質(zhì)量的序列區(qū)并將正反序列拼接。利用MEGA 6.0軟件對拼接后的序列進(jìn)行多重序列比對，計(jì)算樣品間的遺傳距離以獲取DNA條形碼序列變異信息[25]。利用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析各樣品間的親緣關(guān)系，各個(gè)分支的bootstrap置信值以1 000次重復(fù)來檢驗(yàn)。

以“ITS2”、“Orobanche”為關(guān)鍵詞在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索并下載國內(nèi)外相關(guān)序列37條，利用MEGA 6.0軟件將本研究中3種代表型ITS2序列與國內(nèi)外相關(guān)序列進(jìn)行同源序列比對，構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析本研究彎管列當(dāng)種群與國內(nèi)外彎管列當(dāng)?shù)挠H緣關(guān)系。

1.3 種子外觀形態(tài)觀察

1.3.1 種子形態(tài)測定

利用100目、120目篩選出成熟飽滿的種子，依次用2%次氯酸鈉和75%乙醇超聲清洗2 min后用無菌水沖洗3遍以上至無色，放置2 d脫水干燥。在超景深三維顯微鏡（KEYENCE，日本）下觀察各種群種子形態(tài)，每個(gè)種群測量30粒種子的長、寬值。利用R語言3.5.2中的兩獨(dú)立樣本t測驗(yàn)來比較不同類型間種子的長度、寬度、大小（長×寬）、形狀（長/寬）的差別。

1.3.2 種子的掃描電鏡觀察

將上述消毒處理后完全干燥的種子作為SEM觀察材料。將待觀察的種子粘在涂有導(dǎo)電碳素標(biāo)簽的鋁存根上，用雙面膠固定在樣品臺上，涂覆金鈀后在日立SU-8010型掃描電鏡下觀察種子顯微形態(tài)特征并拍照。

參考文獻(xiàn)中的專業(yè)術(shù)語[12， 26]，對不同彎管列當(dāng)種子進(jìn)行形態(tài)特征描述。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征

將58份彎管列當(dāng)樣品的rbcL、matK、ITS2片段測序結(jié)果進(jìn)行剪切比對，結(jié)果表明不同DNA條形碼片段在序列長度、PCR擴(kuò)增及測序成功率、核苷酸差異位點(diǎn)數(shù)上均有明顯差異（表2）。由于參試樣品的rbcL、matK片段無核苷酸差異，種內(nèi)遺傳距離均為0，且matK序列片段的PCR擴(kuò)增成功率太低（17%），因此不適用于后續(xù)分析。58份彎管列當(dāng)?shù)腎TS2片段存在3個(gè)核苷酸差異位點(diǎn)，種內(nèi)遺傳距離為0.002～0.007，通過ITS2序列能將不同彎管列當(dāng)種群區(qū)分開，后續(xù)將對ITS2片段的差異位點(diǎn)、遺傳多樣性等進(jìn)行分析。

2.2 基于ITS2序列的遺傳聚類分析

使用Vector NTI和MEGA 6.0軟件分析各樣品的ITS2序列，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示58份彎管列當(dāng)樣品聚為3類（圖1）。其中，采自北京（BJ1）、河北（HB1、HB2、HB3）與吉林（JL4、JL6、JL8）的7份樣品親緣關(guān)系較近，聚為一類，定為Ⅰ型;采自新疆、內(nèi)蒙古與吉林的樣品中有50份樣品聚為一類，定為Ⅱ型;采自內(nèi)蒙古開魯縣的NM1介于兩者之間，定為Ⅲ型。

2.3 基于ITS2序列的差異位點(diǎn)、遺傳距離分析

58份彎管列當(dāng)樣品的ITS2序列存在3個(gè)差異位點(diǎn)，分別是106位C/T、175位C/T、及273位G/T差異。在106位和175位Ⅰ型和Ⅲ型堿基為C，Ⅱ型堿基為T;在273位Ⅰ型堿基為G，Ⅱ型和Ⅲ型堿基為T（圖2）。由于同一類型堿基序列相同，故選用3個(gè)類型計(jì)算遺傳距離，結(jié)果表明Ⅰ型與Ⅱ型親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳距離為0.006 7，Ⅰ型與Ⅲ型親緣關(guān)系最近，遺傳距離為0.002 2，Ⅱ型與Ⅲ型遺傳距離為0.004 4。

2.4 彎管列當(dāng)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將3種類型彎管列當(dāng)?shù)腎TS2序列測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中相關(guān)序列進(jìn)行比對，聚類結(jié)果表明采集到的58份樣品均為彎管列當(dāng)。其中，Ⅰ型、Ⅲ型與中國、美國、西班牙、格魯吉亞、澳大利亞報(bào)道的O.cernua（NCBI登錄號AY911235.1、EU655624.1、AY960726.1、AY209230.1、AY209231.1、AY209232.1、AY209233.1）親緣關(guān)系較近聚為一類;Ⅱ型與以色列、中國報(bào)道的O.cernua var. cumana、O.cernua （NCBI登錄號EU655627.1、KC811238.1）親緣關(guān)系最近聚為一類（圖3）。

2.5 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

田間采樣過程中發(fā)現(xiàn)Ⅰ、Ⅱ型植株形態(tài)存在顯著差異，其中Ⅰ型花序密集，有50～80朵花;Ⅱ型植株花序疏松，有20～50朵花。由于個(gè)別樣品采集到的是植株并未采集到種子，因此采取抽樣法從Ⅰ型的7份材料中抽取4份，Ⅱ型的50份材料中抽取15份，Ⅲ型1份，共計(jì)20份材料進(jìn)行種子形態(tài)鑒定。在顯微鏡下對其形態(tài)進(jìn)行觀察和測量，結(jié)果表明（圖4），3種類型彎管列當(dāng)種子在長、寬、大小、形態(tài)上均存在差異。Ⅰ型彎管列當(dāng)種子長267～457 μm，寬121～218 μm，多為卵圓形，Ⅱ型種子長260～578 μm，寬104～360 μm，多為長橢圓形，Ⅲ型種子長236～419 μm，寬141～212 μm，多為倒卵形。種子大小（長×寬）依次為Ⅱ型>Ⅲ型>Ⅰ型，其中，Ⅰ型種子大小顯著小于Ⅱ型（P<0.001），Ⅱ型種子顯著大于Ⅲ型（P<0.001），Ⅰ、Ⅲ型種子大小差異不顯著（P>0.05）。種子長/寬依次為Ⅱ型>Ⅰ型>Ⅲ型，其中Ⅰ、Ⅱ型種子長/寬顯著大于Ⅲ型（P<0.001），Ⅰ型種子長/寬顯著小于Ⅱ型（P<0.001），表明Ⅱ型彎管列當(dāng)種子最為瘦長。

掃描電鏡結(jié)果表明（圖5），3種類型彎管列當(dāng)種子的表面均呈網(wǎng)狀紋飾，但網(wǎng)紋形狀、網(wǎng)脊粗細(xì)、網(wǎng)眼凹陷程度均有細(xì)微差異。其中，Ⅰ型彎管列當(dāng)種子多為卵圓形，種臍收縮褶皺，但種臍端較平，網(wǎng)脊深，種皮有脊?fàn)钔黄鸬穆褕A形網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)紋里有形狀規(guī)則的蜂巢狀凹點(diǎn)小網(wǎng)眼;而Ⅱ型彎管列當(dāng)種子多為長橢圓形，明顯比Ⅰ、Ⅲ型種子細(xì)長，種臍明顯收縮褶皺呈錐形，網(wǎng)脊光滑、突起明顯，脊之間凹陷形成縱矩形大網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)紋里有分布密集的蜂巢狀凹點(diǎn)小網(wǎng)眼，與Ⅰ型相比網(wǎng)眼凹陷較深。Ⅲ型彎管列當(dāng)種子多為倒卵形，與Ⅰ型較為相似，種臍收縮褶皺，方形網(wǎng)狀紋飾網(wǎng)紋里有形狀規(guī)則的小網(wǎng)眼。

3 討論

3.1 基于ITS2序列和種子形態(tài)學(xué)鑒定的彎管列當(dāng)遺傳多樣性分析

DNA條形碼技術(shù)具有操作簡單、準(zhǔn)確度高、不受環(huán)境和物種等因素限制、方法通用性強(qiáng)等優(yōu)勢，是分析群體遺傳多樣性的常用技術(shù)之一[21]。Ahmed等[23]利用rbcL、matK條形碼對巴基斯坦俾路支省不同地區(qū)采集的15個(gè)列當(dāng)屬樣品進(jìn)行遺傳分化鑒定，發(fā)現(xiàn)matK在列當(dāng)物種鑒定中的表現(xiàn)優(yōu)于rbcL，也可作為其他植物物種鑒定的候選基因。Schneeweiss等[24]采用ITS條形碼對全寄生列當(dāng)科的系統(tǒng)發(fā)育和種內(nèi)變異進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明列當(dāng)科分為兩個(gè)譜系，ITS的種內(nèi)變異低與種內(nèi)形態(tài)變異性、寄主范圍均無關(guān)。本試驗(yàn)利用DNA條形碼技術(shù)對中國向日葵主產(chǎn)區(qū)采集的58份彎管列當(dāng)進(jìn)行rbcL、matK、ITS2片段擴(kuò)增和比對分析，發(fā)現(xiàn)僅ITS2條形碼適用于彎管列當(dāng)種群遺傳多樣性分析?；贗TS2條形碼聚類結(jié)果表明我國不同彎管列當(dāng)種群也不是單系的，聚為3類，與上述研究結(jié)果一致。在本試驗(yàn)中，matK基因擴(kuò)增及測序成功率較低（17%），可能與該基因擴(kuò)增時(shí)通用引物有效性較差有關(guān)。雖然rbcL在擴(kuò)增和測序成功率上能達(dá)到100%，但該基因序列在彎管列當(dāng)中保守性高，進(jìn)化速率較慢，種內(nèi)差異極小，不適合作為DNA條形碼序列對彎管列當(dāng)進(jìn)行種群遺傳分化研究。

目前，彎管列當(dāng)和向日葵列當(dāng)O.cumana的命名較混亂，兩個(gè)名字在文獻(xiàn)中都有記載。石必顯等[27]利用ISSR標(biāo)記對我國不同省區(qū)的向日葵列當(dāng)進(jìn)行遺傳聚類，結(jié)果表明可被聚成兩個(gè)亞組，其中河北、山西和陜西種群聚成一個(gè)亞組，吉林、內(nèi)蒙古和新疆種群聚成另外一個(gè)亞組。本研究中ITS2條形碼聚類結(jié)果與石必顯等研究結(jié)果有相同之處，我國不同彎管列當(dāng)種群大致按照地理分布聚為3類?？傮w上來自相鄰地區(qū)的樣品聚類在一起，地理分布越近，親緣關(guān)系往往越近，但也存在個(gè)別差異，比如采自吉林省同一田間的樣品（JL4、JL6、JL8和JL5、JL7、JL9）呈現(xiàn)復(fù)雜類群聚為2類（Ⅰ型、Ⅱ型）。內(nèi)蒙古地區(qū)和新疆地區(qū)是我國主要向日葵種植區(qū)[3]，以食葵種植為主，種子多采用抗性品種及國內(nèi)外雜交引種，在向日葵栽培歷史悠久、播種面積大、種源復(fù)雜的情況下寄主已經(jīng)對彎管列當(dāng)做出了選擇，因而彎管列當(dāng)種類很單一，聚為一類。而吉林地區(qū)列當(dāng)種群聚為2類可能是由于近年來彎管列當(dāng)危害嚴(yán)重[28]，向日葵種植面積大幅下降，主要以種植當(dāng)?shù)氐膫鹘y(tǒng)品種為主，因此可能篩選出等級較低的列當(dāng)生理小種，從而呈現(xiàn)復(fù)雜類群;也可能是當(dāng)?shù)胤N子調(diào)運(yùn)時(shí)攜帶列當(dāng)種子、列當(dāng)種內(nèi)存在基因交流以及寄主（向日葵栽培品種）不同，列當(dāng)出現(xiàn)不同等級進(jìn)化有關(guān)。

本研究所采集的彎管列當(dāng)植株形態(tài)存在明顯差異，其中Ⅰ型植株花序密集，有50～80朵花，花冠藍(lán)色或紫色，而Ⅱ型植株穗狀花序松散，有20～50朵花，花冠白色或淡藍(lán)色，與Pujadas-Salvà等[13]對列當(dāng)屬的形態(tài)分類研究結(jié)果一致。種子掃描電鏡結(jié)果表明3種類型彎管列當(dāng)在種子大小、形狀、種臍、種皮網(wǎng)紋、網(wǎng)眼等微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)方面存在細(xì)微差別，與王定國等[12]的研究結(jié)果一致。不同彎管列當(dāng)種群在植株形態(tài)、種子微觀形態(tài)存在差異可能與不同環(huán)境條件下表型的變異、生理小種的進(jìn)化有關(guān)。

近年來，隨著我國向日葵大面積種植、引種混亂、檢疫滯后、人類活動(dòng)等因素影響，大部分向日葵種植區(qū)受到根部全寄生雜草彎管列當(dāng)?shù)膰?yán)重威脅[34]。我國不同向日葵種植區(qū)彎管列當(dāng)?shù)倪z傳多樣性可以歸因于基因交流和地理生態(tài)環(huán)境等。此外，不同的寄主栽培品種、氣候環(huán)境、土壤條件、人為活動(dòng)等都可能影響彎管列當(dāng)種群的表型及遺傳結(jié)構(gòu)變異。

3.2 3種類型彎管列當(dāng)與國內(nèi)外彎管列當(dāng)?shù)挠H緣關(guān)系

彎管列當(dāng)隨著向日葵的廣泛種植逐漸在世界各地蔓延。調(diào)查表明，本研究Ⅰ型彎管列當(dāng)（北京、河北、吉林JL4、JL6、JL8）只在我國小面積向日葵種植區(qū)發(fā)生;Ⅱ型彎管列當(dāng)（新疆、內(nèi)蒙古、吉林部分地區(qū)）分布區(qū)是我國向日葵的主產(chǎn)區(qū)，同時(shí)也是彎管列當(dāng)危害最嚴(yán)重的地區(qū);Ⅲ型（內(nèi)蒙古開魯縣NM1）介于Ⅰ型、Ⅱ型之間，可能是二者基因交流的結(jié)果。基于NCBI數(shù)據(jù)庫中的ITS2序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，我國Ⅰ型、Ⅲ型彎管列當(dāng)與世界大部分地區(qū)（美國、西班牙、格魯吉亞、澳大利亞）報(bào)道的彎管列當(dāng)ITS2序列親緣關(guān)系最近，聚為一類，Ⅱ型與以色列報(bào)道的彎管列當(dāng)ITS2序列聚為一類。以上結(jié)果表明我國不同地區(qū)彎管列當(dāng)種群遺傳背景復(fù)雜，主要原因可能與向日葵引種、彎管列當(dāng)種子傳播及種群之間的基因交流有關(guān)。此外，由于寄生植物較獨(dú)特，存在寄主特異性，它們的種群結(jié)構(gòu)也受到寄主的影響，因此其遺傳變異可能因寄主種類不同而產(chǎn)生分化。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合微觀形態(tài)學(xué)特征分析，采用ITS2條形碼技術(shù)，研究了中國主要向日葵種植區(qū)寄生雜草彎管列當(dāng)種群的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)彎管列當(dāng)因生境、寄主（向日葵栽培品種）和遺傳背景不同，形成植株形態(tài)和遺傳組成存在顯著差異的3個(gè)類群?；贗TS2 條形碼和種子形態(tài)學(xué)觀察相結(jié)合的方法可用于彎管列當(dāng)種群遺傳多樣性研究。本研究為彎管列當(dāng)防治提供了重要基因資源，為相關(guān)向日葵抗性育種奠定了理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）