腦卒中后認(rèn)知功能障礙患者miR-20a-5p miR-29c-3p表達(dá)及相關(guān)因素

商慧鮮 許宏俠 郭 芬

河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 開(kāi)封 475000

腦卒中主要包括缺血性腦卒中與出血性腦卒中兩種，指多種原因?qū)е碌哪X血管、腦組織受損引發(fā)的臨床癥狀或致死［1-3］。腦卒中病因復(fù)雜，高血壓、糖尿病以及不良生活習(xí)慣等因素均可引發(fā)該病。腦卒中患者起病較急，發(fā)病后可表現(xiàn)出頭暈、惡心、嘔吐，嚴(yán)重影響機(jī)體健康［4-6］。認(rèn)知障礙是腦卒中患者常見(jiàn)癥狀，指的是因腦血管疾病導(dǎo)致的認(rèn)知功能減退，血管性認(rèn)知障礙是腦卒中后認(rèn)知功能障礙的主要組成部分，約占全部腦卒中后認(rèn)知功能障礙的62.6%。已有多位學(xué)者證實(shí)，腦卒中后認(rèn)知功能障礙與腦卒中患者預(yù)后不良有緊密關(guān)系，目前已成為一項(xiàng)較為嚴(yán)重的社會(huì)、公共衛(wèi)生問(wèn)題［7-9］。microRNAs（miRNAs）是一種單鏈非編碼小分子RNA，對(duì)機(jī)體功能有一定調(diào)節(jié)作用，如miRNAs 可調(diào)節(jié)惡性腫瘤、急性腦梗死等疾病的發(fā)生與發(fā)展［10-12］。近年來(lái)，有研究指出miRNAs可用來(lái)診斷疾病病癥，具有成為疾病生物標(biāo)記物的潛能［13-15］。但目前關(guān)于miRNAs 與腦卒中后認(rèn)知功能障礙聯(lián)系的研究較少，腦卒中患者血清miRNAs的作用仍不明確?；诖?，筆者將河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院159例腦卒中患者納入研究，根據(jù)簡(jiǎn)易精神狀態(tài)評(píng)價(jià)量表（MMSE）得分對(duì)其認(rèn)知功能障礙情況進(jìn)行分組，對(duì)比分析了miR-20a-5p、miR-29c-3p在腦卒中后認(rèn)知功能障礙患者中的表達(dá)情況及影響因素，探究了miR-20a-5p、miR-29c-3p 表達(dá)與認(rèn)知功能障礙的聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院2020-01—2022-06 收入的腦卒中患者159 例，根據(jù)其認(rèn)知功能情況分為正常組（62例）、輕度障礙組（38例）、中度障礙組（36例）、重度障礙組（23例）。其中，正常組男35 例，女27 例；年齡43～85（64.55±8.03）歲。輕度障礙組男20 例，女18 例；年齡49～86（64.95±7.84）歲。中度障礙組男19例，女17例；年齡48～82（64.81±8.17）歲。重度障礙組男13 例，女10例；年齡47～84（65.35±7.71）歲。4 組患者性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究符合《赫爾辛基宣言》內(nèi)容。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)以中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)制定的2019版《中國(guó)各類(lèi)主要腦血管病診斷要點(diǎn)》導(dǎo)向擬定腦卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）體征存在單側(cè)肢體無(wú)力麻木，單側(cè)面部麻木、語(yǔ)言困難、單側(cè)或雙側(cè)視力喪失、眩暈且伴隨嘔吐；（2）出血性腦卒中患者顱腦CT 平掃可見(jiàn)高密度病灶，CT 值為60～80 Hu，高密度血腫周?chē)嬖诘兔芏人[帶圍繞，部分存在腦室、腦池、腦溝受壓，中線(xiàn)結(jié)構(gòu)位移。缺血性腦卒中低密度病灶，累及灰白質(zhì)，部分有水腫和占位；（3）缺血性腦卒中患者血管評(píng)估時(shí)可見(jiàn)血管?chē)?yán)重狹窄或閉塞。

1.3 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，入院后明確診斷為腦卒中；（2）年齡在18～90歲內(nèi)；（3）病變位于基底節(jié)區(qū)域，未出現(xiàn)廣泛性病灶；（4）配合完成MMSE量表評(píng)測(cè)，結(jié)果清晰；（5）可配合完成其他體征檢查；（6）發(fā)病時(shí)間在14 d內(nèi)；（7）了解研究?jī)?nèi)容，知曉利弊，患者或家屬已簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并惡性腫瘤，凝血、免疫或肝腎功能異常；（2）外傷引發(fā)的顱內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下腔出血；（3）患病前有認(rèn)知功能障礙，如過(guò)往有阿爾茨海默病或帕金森疾??；（4）過(guò)往有精神疾病史；（5）合并嚴(yán)重軀體疾病，生命體征不穩(wěn)；（6）妊娠或哺乳期婦女。

1.4 方法所有受試者入院后3 d 于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下取靜脈血5 mL 后置于真空管，將試管垂直30 min等待凝塊，于室溫下行30 r/min離心10 min，再于4 ℃下13 000 r/min離心10 min，取血清置于—80 ℃待測(cè)。用miRNA轉(zhuǎn)化試劑盒提取miRNA后檢測(cè)RNA純度、濃度（濃度范圍20～102 ng/L）、純度（1.81～2.01），進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，用實(shí)時(shí)熒光定量（qRT-PCR）測(cè)其表達(dá)量，用2-△△Ct法算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 觀察指標(biāo)（1）人口學(xué)資料，入院后通過(guò)查閱病歷與詢(xún)問(wèn)方式收集患者性別、年齡、病程、高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾病史；（2）疾病相關(guān)資料，通過(guò)影像學(xué)檢查結(jié)果記錄患者腦卒中類(lèi)型、病變部位；（3）MMSE量表得分，與入院后1 d對(duì)患者進(jìn)行MMSE量表評(píng)估，測(cè)定其認(rèn)知功能。量表含7個(gè)維度，測(cè)試結(jié)果與文化水平有關(guān)，正常界值劃分為文盲、小學(xué)、初中及以上分別大于17、20、24分，27～30分為認(rèn)知功能正常、27分以下為認(rèn)知功能障礙。其中，21～26、10～20、0～9分為輕度、中度、重度認(rèn)知功能障礙。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究數(shù)據(jù)均由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料如性別、高血壓、糖尿病、不良生活習(xí)慣用（n，%）表示，行χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布計(jì)量資料如年齡、miR-20a-5p、miR-29c-3p表達(dá)量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行t 檢驗(yàn)。影響因素分析用二元Logistic回歸模型分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦卒中后不同認(rèn)知功能障礙患者miR-20a-5p、miR-29c-3p 表達(dá)比較4 組患者血清miR-20a-5p、miR-29c-3p mRNA 表達(dá)比較有顯著差異，正常組miR-20a-5p mRNA表達(dá)水平<輕度障礙組<中度障礙組<重度障礙組，miR-29c-3p mRNA 表達(dá)水平>輕度障礙組>中度障礙組>重度障礙組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 4組血清miR-20a-5p、miR-29c-3p mRNA表達(dá)比較（±s）Table1 Comparison of serum miR-20a-5p and miR-29c-3p mRNA expression in four groups （±s）

表1 4組血清miR-20a-5p、miR-29c-3p mRNA表達(dá)比較（±s）Table1 Comparison of serum miR-20a-5p and miR-29c-3p mRNA expression in four groups （±s）

注：輕度障礙組、中度障礙組、重度障礙組與正常組比較，aP<0.05；中度障礙組、重度障礙組與輕度障礙組比較，bP<0.05；重度障礙組與中度障礙組比較，cP<0.05

組別正常組輕度障礙組中度障礙組重度障礙組F值P值n 62 38 36 23 miR-20a-5p 0.18±0.09 0.44±0.05a 0.70±0.08ab 0.87±0.09abc 568.948<0.001 miR-29c-3p 1.01±0.08 0.83±0.05a 0.74±0.06ab 0.52±0.03abc 369.134<0.001

2.2 影響腦卒中后認(rèn)知功能障礙患者miR-20a-5p、miR-29c-3p 表達(dá)的單因素分析以miR-20a-5p、miR-29c-3p 鑒別輕度、中度認(rèn)知功能障礙患者界值（0.51、0.78）為分界點(diǎn)將97例腦卒中后認(rèn)知功能障礙患者分為miR-20a-5p高表達(dá)組（≥0.51，n=60）、低表達(dá)組（<0.51，n=37）與miR-29c-3p高表達(dá)組（≥0.78，n=43）、低表達(dá)組（<0.78，n=54）。

就miR-20a-5p 表達(dá)情況分析，高表達(dá)組年齡≥68、合并高血壓與糖尿病、MMSE 得分<15 占比顯著高于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；就miR-29c-3p 表達(dá)情況分析，低表達(dá)組年齡≥68、合并高血壓與糖尿病、MMSE得分<15占比顯著高于高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 影響腦卒中后認(rèn)知功能障礙患者miR-20a-5p、miR-29c-3p表達(dá)的單因素分析 ［例（%）］Table2 Univariate analysis affecting the expression of miR-20a-5p and miR-29c-3p in patients with cognitive dysfunction after stroke ［n（%）］

2.3 影響腦卒中后認(rèn)知功能障礙患者miR-20a-5p表達(dá)的Logistic回歸分析以年齡（≥68=1，<68=0）、高血壓（有=1，無(wú)=0）、糖尿病（有=1，無(wú)=0）、MMSE得分（≥15=1，<15=0）為自變量，miR-20a-5p表達(dá)（高表達(dá)=1，低表達(dá)=0）為因變量，Logistic 回歸分析顯示年齡、高血壓、糖尿病、MMSE是影響miR-20a-5p表達(dá)的因素（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 影響miR-20a-5p表達(dá)的Logistic回歸分析Table3 Logistic regression analysis affecting miR-20a-5p expression

2.4 影響腦卒中后認(rèn)知功能障礙患者miR-29c-3p表達(dá)的Logistic回歸分析以年齡（≥68=1，<68=0）、高血壓（有=1，無(wú)=0）、糖尿?。ㄓ?1，無(wú)=0）、MMSE得分（≥15=1，<15=0）為自變量，miR-29c-3p表達(dá)（高表達(dá)=1，低表達(dá)=0）為因變量，Logistic 回歸分析顯示年齡、高血壓、糖尿病、MMSE是影響miR-20a-5p表達(dá)的因素（P<0.05）。見(jiàn)表4。

表4 影響miR-29c-3p表達(dá)的Logistic回歸分析Table4 Logistic regression analysis affecting miR-29c-3p expression

3 討論

腦卒中是臨床常見(jiàn)腦血管疾病，對(duì)人體危害較大，除了會(huì)造成運(yùn)動(dòng)功能障礙外，還會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能異常，腦卒中后認(rèn)知功能障礙患者記憶、定向、計(jì)算以及各認(rèn)知領(lǐng)域均會(huì)出現(xiàn)不同程度損害［16-20］。miRNAs作為非編碼RNA，已被證明在多種疾病發(fā)展中扮演了重要角色，有研究顯示，對(duì)于急性腦梗死患者，其腦脊液中miRNAs（含miR-27a、miR-137等）水平均出現(xiàn)了明顯變化，還有研究顯示miRNAs與腦卒中缺氧狀態(tài)下神經(jīng)元細(xì)胞存活與死亡有一定聯(lián)系，可調(diào)控機(jī)體認(rèn)知障礙，但目前關(guān)于其在腦卒中既腦卒中后認(rèn)知功能障礙中的作用仍不明確［21-25］。本研究通過(guò)qRT-PCR方式測(cè)出miR-20a-5p、miR-29c-3p 表達(dá)水平，進(jìn)一步探究了其在腦卒中后認(rèn)知功能障礙患者中的作用。

在本研究中159例腦卒中患者血清miR-20a-5p、miR-29c-3pmRNA 表達(dá)比較有顯著差異，正常組miR-20a-5pmRNA 表達(dá)水平<輕度障礙組<中度障礙組<重度障礙組，miR-29c-3pmRNA 表達(dá)水平>輕度障礙組>中度障礙組>重度障礙組，這與研究結(jié)論一致［26-30］。說(shuō)明腦卒中后認(rèn)知功能障礙患者miR-20a-5p、miR-29c-3pmRNA均出現(xiàn)異常表達(dá)，且認(rèn)知障礙越嚴(yán)重的患者異常表達(dá)越明顯。推測(cè)原因在于，miRNAs參與了腦高級(jí)功能如學(xué)習(xí)、記憶等，其表達(dá)與神經(jīng)元突觸可塑性以及認(rèn)知疾病有顯著聯(lián)系。miR-20a-5p能夠調(diào)控促神經(jīng)元分化因子表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子1 a改變卒中后缺氧狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞死亡或存活狀態(tài)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)認(rèn)知功能的影響［31-33］。miR-29c-3p 的目標(biāo)基因是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3），STAT3 激活后可參與促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞神經(jīng)膠質(zhì)分化，抑制神經(jīng)祖細(xì)胞神經(jīng)元分化，而miR-29c-3p 能夠通過(guò)調(diào)控STAT3 實(shí)現(xiàn)對(duì)認(rèn)知功能的影響。

此外，本研究通過(guò)對(duì)人口學(xué)及相關(guān)疾病治療進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，年齡、高血壓、糖尿病、MMSE得分是影響miR-20a-5p、miR-29c-3p 的因素。原因可能為年齡、高血壓、糖尿病、MMSE 得分可通過(guò)影響認(rèn)知功能障礙情況實(shí)現(xiàn)對(duì)miR-20a-5p、miR-29c-3p的影響。如從年齡方面分析，隨著年齡的上升，腦皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)量下降，更易出現(xiàn)認(rèn)知功能損傷［34-36］。從疾病方面分析，高血壓可能會(huì)影響腦卒中患者血腦屏障完整性，導(dǎo)致腦血管硬化，進(jìn)而致使腦白質(zhì)變性與功能障礙［37-39］。糖尿病患者胰島素抵抗會(huì)導(dǎo)致血糖調(diào)節(jié)紊亂，而高血糖環(huán)境更易發(fā)生無(wú)氧代謝、氧化應(yīng)激等反應(yīng)，損傷腦部血管與神經(jīng)元［40-42］。而MMSE 得分是評(píng)估認(rèn)知功能障礙的常用指標(biāo)，MMSE 分?jǐn)?shù)越高說(shuō)明認(rèn)知功能越好。

腦卒中后認(rèn)知功能障礙患者miR-20a-5pmRNA存在異常高表達(dá)，miR-29c-3pmRNA存在異常低表達(dá)，且認(rèn)知功能障礙越嚴(yán)重，異常表達(dá)越明顯。年齡、高血壓、糖尿病、MMSE 得分是miR-20a-5p、miR-29c-3p表達(dá)的影響因素。