基于網絡藥理學探究棘豆止咳散防治慢性阻塞性肺疾病的機制研究

盛松　李婧　扎拉嘎白乙拉

摘要目的：采用網絡藥理學方法研究棘豆止咳散（JDZKS）治療慢性阻塞性肺疾?。–OPD）的作用機制。方法：利用數據庫、基因芯片等預測JDZKS治療COPD的靶點，構建成分治療靶點（CT）網絡、治療疾病靶點（TD）網絡并計算網絡貢獻指數、Degree、Betweenness和Closeness篩選主要核心成分和靶點。對治療靶點進行富集分析，最后對核心成分和靶點分子對接驗證。結果：預測得到治療靶點116個，根據網絡貢獻指數、Degree、Closeness和Betweenness篩選CT和TD網絡得到2個核心成分和5個核心靶點。GO和KEGG分析顯示JDZKS從炎癥、氧化應激、細胞凋亡、抗感染、營養(yǎng)代謝等方面防治COPD，組織富集分析顯示治療靶點富集于多個器官組織。分子對接結果表明核心成分與核心靶點間具有較強的結合力。結論：JDZKS治療COPD具有多成分、多靶點的特點，理論上可以從多角度、多層次防治COPD。

關鍵詞棘豆止咳散;網絡藥理學;慢性阻塞性肺疾病;基因芯片;網絡效能;貢獻指數;核數;分子對接

Mechanism of Jidou Zhike Powder in Treatment of Chronic Obstructive Pulmonary

Disease Based on Network Pharmacology

SHENG Song，LI Jing，ZHALAGA Baiyila

（1 Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100093，China;

2 Kulun Banner Hospital of Mongolian Medicine，Tongliao 028200，China）

AbstractObjective：To explore the mechanism of Jidou Zhike Powder（JDZK） in the treatment of chronic obstructive pulmonary disease（COPD） by network pharmacology.Methods：Therapeutic targets of JDZK on COPD were predicted by the databases and gene microarray.According to the calculation of contribution index，degree，betweenness，and closeness，the core compounds and therapeutic targets were chosen in the compoundtarget network（CT） and the targetdisease（TD） network.Furthermore，therapeutic targets underwent enrichment analysis.Finally，the binding capacity between the core compounds and targets was verified by molecular docking.Results：A total of 116 therapeutic targets were obtained by prediction.In addition，two core compounds and five core targets were obtained in the CT network and the TD network according to the contribution index，degree，betweenness，and closeness.Furthermore，GO and KEGG analyses indicated that JDZK acted on COPD from inflammation，oxidative stress，cell apoptosis，infection resistance，and nutrition metabolism.Tissue enrichment analysis indicated that the therapeutic targets were enriched in multiple organs and tissues.Molecular docking results manifested excellent binding capacity between core compounds and core targets.Conclusion：JDZK treatment of COPD is characterized by multiple components and targets，which can prevent and cure COPD at multiple levels theoretically.

KeywordsJidou Zhike Powder; Network pharmacology; Chronic obstructive pulmonary diseases; Gene microarray; Networkbased efficacy; Contribution index; Coreness; Molecular docking

中圖分類號：R289.5;R563文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.04.003

慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一種以呼吸道持續(xù)氣流受限為特征的肺部疾病，是呼吸系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病。慢性阻塞性肺疾病全球創(chuàng)議（The Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，GOLD）預計COPD的發(fā)病率在未來40年仍會繼續(xù)上升，至2060年每年有超過540萬人死于COPD及其相關疾病[1]。中醫(yī)學從宏觀著手，整體施治，理論上可以從多角度、多層次出發(fā)防治COPD，更好地提高療效。棘豆止咳散（JDZKS）是內蒙古通遼地區(qū)的常用蒙藥制劑，組方中多葉棘豆為君藥，川貝母為臣藥，石膏為佐藥，甘草為使藥，在長達30年的使用過程中發(fā)現JDZKS對于COPD導致的咳嗽、肺氣腫等具有較好療效[2]。

然而由于復方成分的復雜性和藥理作用的多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)的特點，采用傳統(tǒng)單靶標、單成分的研究思路來研究JDZKS干預COPD的作用機制很難體現復方的系統(tǒng)性，難以科學解釋JDZKS的藥效物質基礎[3]。網絡藥理學是從系統(tǒng)水平研究藥物與人體相互作用規(guī)律及機制的一門新興學科，因其整體性和系統(tǒng)性的特點已被廣泛應用于復方主要活性成分篩選、作用靶點預測及作用機制研究[4]。因此我們借助網絡藥理學方法從整體角度探究JDZKS干預COPD的作用機制（圖1），為JDZKS的系統(tǒng)深入研究提供理論基礎。

1材料與方法

1.1篩選JDZKS的成分本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索川貝母、甘草化學成分，并根據口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和類藥性（Drug Likeness，DL）篩選得到符合條件的候選化合物[5]。因復方中多葉棘豆和石膏未在TCMSP中收錄，本研究通過TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid/）及文獻檢索得到多葉棘豆和石膏的化學成分[67]。檢索日期截至2020年3月1日。

1.2獲取候選化合物的靶點首先將候選化合物分別導入TCMSP和PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到化合物的mol2結構文件以及SMILES和InChI化學式，然后將其導入PharmMapper（http：//www.lilabecust.cn/pharmmapper/）、SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）、BatmanTCM（http：//www.swisstargetprediction.ch/）分別依據反向藥效基團、化合物結構相似性及藥物靶點關系的方法預測化合物靶點[810]，同時為保證預測靶點的準確性，在上述4個網站中分別以Norm Fit≥0.7、Probability≥0.7、Similarity threshold=0.7、Score cutoff=20為條件進一步篩選靶點，最后將4個數據庫的預測靶點匯總去重后導入Uniprot（https：//www.uniprot.org/）中校正為Gene symbol，作為JDZKS的成分靶點。檢索日期截至2020年3月1日。

1.3篩選COPD靶點COPD靶點預測來自數據庫和GEO基因芯片。以“chronic obstructive pulmonary disease”和“COPD”為關鍵詞檢索數據庫GeneCards（http：//www.genecards.org/）、GAD（https：//geneticCHDsociationdb.nih.gov/）、TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、DisGenet（http：//www.disgenet.org/）和DrugBank得到COPD靶點。GSE37768是GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中收錄的一個包含18例COPD患者和9例未吸煙健康人周圍肺組織樣本的基因表達數據集。首先利用該數據集提供的GPL570平臺注釋文件將27個樣本的探針I(yè)D轉換為Gene symbol，然后使用R version3.6.0的Impute包、Affy包、Limma包進行數據集的缺失數據插補、標準化以及差異基因識別，差異基因閾值設置為P<0.05且| Log2 fold change |≥1。為保證疾病靶點預測的準確性，將上述6個來源的COPD靶點兩兩取交集得到疾病靶點，最后將JDZKS成分靶點與COPD疾病靶點再取交集得到JDZKS治療COPD的靶點，即治療靶點。檢索日期截至2020年3月1日。

1.4網絡分析和構建Cytoscape（ver3.2.1）是一款圖形化顯示網絡并進行分析和編輯的軟件，能更直觀地分析藥物治療疾病的作用機制[11]。網絡中節(jié)點是成分或靶點，邊代表成分靶點關系或靶點靶點關系。

1.5成分治療靶點（CT）網絡構建及分析利用候選化合物、治療靶點及其之間的聯系構建CT網絡，同時參考文獻本研究引入了貢獻指數（Contribution Index，CI）以評估候選化合物對CT網絡的單獨貢獻程度，CI的計算主要基于網絡效能（Network Based Efficacy，NE）和PubMed文獻，如果排名前N個化合物的CI之和大于85%，則這N個化合物被認為是對CT網絡貢獻度最大的核心成分[12]，CI計算公式如下。

在公式（1）中，n是與化合物j連接的靶點數量，d（i）是與化合物j連接的靶點i的Degree值。在公式（2）中，m是網絡中的化合物數目，c（j）是化合物j與COPD的相關PubMed文獻數目，檢索策略為在Abstract/Title中以“chronic obstructive pulmonary disease”“COPD”和網絡中化合物英文名稱及別稱為關鍵詞聯合檢索PubMed中1990—2019年的文獻。

1.6治療疾病靶點（TD）網絡構建及分析將治療靶點導入STRING（https：//stringdb.org/），其中“organism”限定為“Homo sapiens”“minimum required interaction score”設定為“medium confidence（>0.400）”得到靶點間互作關系，然后用治療靶點及疾病靶點間的蛋白質相互作用關系構建TD網絡，最后通過Cytoscape的Network Analyzer功能計算網絡中Degree、Betweenness和Closeness評估TD網絡中節(jié)點的重要性，通常一個節(jié)點在網絡中的重要性與Degree、Betweenness和Closeness值成正比。參照既往文獻篩選網絡中大于2倍Degree均值的靶點，在此基礎上再篩選同時大于Degree、Closeness和Betweenness均值的節(jié)點定義為核心靶點[13]。

1.7富集分析本研究使用R進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，首先應用Org.Hs.eg.db包將治療靶點的gene symbol轉換為EntrzID，然后運用ClusterProfiler包進行富集分析，根據Adjusted P<0.05作為條件篩選富集條目，最后使用Enrichplot包和Ggplot2包繪制柱狀圖及氣泡圖展示富集結果。利用TissueEnrich平臺（https：//tissue.gdcb.iastate.edu/）分析和可視化治療靶點的組織器官定位[14]，根據Adjusted P<0.05作為條件篩選顯著富集的組織器官。

1.8分子對接iGEMDOCK（http：//gemdock.life.nctu.edu.tw/dock/，ver2.1）是一款開源的分子對接軟件，具有對接快速、準確度高的優(yōu)點[15]。一般來說，結合親和力是由結合自由能決定的。當結合構象穩(wěn)定時，能量相對較低[16]。在TCMSP中下載核心成分結構的mol2格式文件，在PDB（https：//www.rcsb.org/）中下載核心靶點蛋白結構的PDB格式文件。對接前使用Discovery Studio（version 2016）對靶點蛋白進行去水、加氫、刪除原始配體等預處理，刪除的配體另存為mol2格式文件。軟件采用“standard docking”對接，其余對接參數均為默認。

2結果

2.1篩選JDZKS的成分篩選得到JDZKS成分144個，其中在TCMSP中以“OB≥30%，DL≥0.18”作為篩選條件得到甘草成分75個，川貝母成分11個，通過TCMID及文獻得到多葉棘豆成分60個，石膏成分1個，其中Isorhamnetin和山柰酚為多葉棘豆和甘草共有成分，Sitosterol為川貝母和甘草共有成分。

2.2獲取候選化合物的靶點上述4個數據庫得到812個成分靶點，包括甘草靶點688個，川貝母靶點183個，多葉棘豆靶點329個，石膏靶點19個。

2.3篩選COPD靶點將上述6個來源的疾病靶點（5個數據庫和GEO芯片）兩兩取交集得到COPD靶點932個，成分靶點與COPD靶點再取交集共得JDZKS治療COPD靶點168個，包括靶點川貝母28個，甘草144個，多葉棘豆78個，石膏6個，其中川貝母、甘草、多葉棘豆共同靶點14個，川貝母、甘草共同靶點13個，川貝母、多葉棘豆共同靶點1個，甘草、多葉棘豆共同靶點45個，多葉棘豆、石膏共同靶點1個，這表明JDZKS在治療COPD過程中既有特異性的作用靶點可單獨發(fā)揮作用，又有共同的作用靶點協同發(fā)揮作用，兩藥可“相須相使”治療COPD。

2.4CT網絡構建及分析在CT網絡中有節(jié)點270個，邊849條，代表106個化合物成分，其中川貝母9個，甘草59個，多葉棘豆34個，石膏1個，共有成分3個和164個成分靶點。見圖2A。圖2A網絡中不同顏色的圓圈代表JDZKS中各個藥物的成分，紫色方塊代表成分靶點。如上所述根據CT網絡中每個化合物的NE和PubMed文獻數計算CI，結果表明，槲皮苷和山柰酚這2個化合物的CI之和大于85%，是對CT網絡貢獻度最大的核心成分。見圖2B。即JDZKS抗COPD的主要活性化合物。

2.5TD網絡構建及分析在TD網絡中有165個節(jié)點和668個邊。見圖3A。其中AKT1、TNF、EGFR、SRC、IL1B、PTGS2、CAPS3、EGF、ESR1、IGF1、MMP9、IL10、PPARG、ERBB2、ACTB、FGF2、APP、AR這18個靶點的Degree大于2倍Degree均值（Degree>40.44）。見圖3B。在18個靶點基礎上再篩選同時滿足大于Degree、Closeness和Betweenness均值（Degree>59.17，Closeness>0.58和Betweenness>0.035）的節(jié)點定義為核心靶點，即AKT1、TNF、EGFR、SRC、IL1B。見圖3C。進一步提取的5個核心靶點及其相鄰節(jié)點構建核心靶點網絡，該網絡顯示，5個核心靶點與網絡中74.5%（123/165）的治療靶點有互作關系。見圖3D。是網絡中的核心節(jié)點。在上述4個圖中節(jié)點的大小與Degree值成正比，顏色變化與節(jié)點Degree值相關。

及相鄰節(jié)點提取網絡

2.6富集分析本研究使用R對JDZKS治療COPD的168個靶點進行GO和KEGG分析。根據Adjusted P<0.05確定2 791個GO富集條目，其中生物過程（BP）2 503個，主要涉及類固醇代謝過程、氧化應激反應、營養(yǎng)反應、對營養(yǎng)水平的反應、類固醇激素反應等方面;分子功能（MF）206個，主要包括核受體活動、轉錄因子活性和直接配體調控序列、類固醇結合、類固醇激素受體活性、血紅素結合等方面;細胞組分（CC）81個，主要關于膜筏、膜微結構域、膜區(qū)域、質膜筏、小凹等。見圖4A。根據Adjusted P<0.05共得到146條通路，排名前30的通路中經查找文獻確認的COPD相關通路共9條，包括MAPK信號通路、PI3KAKT信號通路、黏著斑、人類巨細胞病毒感染、甲狀腺激素信號通路、IL17信號通路、叉頭轉錄因子信號通路、甾類激素生物合成、軍團桿菌病。見圖4B。其余的KEGG通路絕大多數可歸屬于人類疾病通路。KEGG分析表明JDZKS活性成分的作用靶點分布于不同的通路，多成分、多靶點相互調節(jié)是COPD的可能作用機制。組織富集分析顯示168個治療靶點顯著富集于多個器官和組織，JDZKS治療COPD是對全身多個組織和器官綜合調控的結果，其中肝臟、胎盤、闌尾、骨髓、膀胱等組織器官在JDZKS治療COPD過程中發(fā)揮重要作用。見圖4C。

2.7分子對接對2個核心成分和5個核心靶點進行分子對接驗證，分子對接結果表明Quercetin和Kaempferol與EGFR、IL1B、TNF這3個靶點的結合力均優(yōu)于原配體，2個核心成分與5個核心靶點間具有較強的結合力，進一步間接證明了網絡藥理學預測的準確性。見圖5。

3討論

本研究發(fā)現，其余的KEGG通路絕大多數可歸屬于人類疾病通路，說明這些疾病可能與COPD潛在相關，如非小細胞肺癌（鱗癌）是COPD的獨立危險因素，它們可能共享許多從疾病發(fā)生發(fā)展的病理演變過程[17]。COPD是近些年來備受關注的慢性疾病之一，近年來的研究表明COPD并不是單一的病理過程，氣道炎癥、氧化應激、蛋白酶/抗蛋白酶失衡，造成氣道、肺實質和肺血管反復損傷修復而引起結構變化，最終導致氣流受限和氣體陷閉、黏液高分泌、氣體交換異常和肺動脈高壓[18]。所以通過干預圖5分子對接自由結合能熱圖

某個特定靶點往往很難控制COPD進展，通過某個單體化合物延緩COPD患者肺功能惡化往往難以取得理想臨床療效。由多種天然藥物組成的復方中含有各類生物活性成分，具有多成分、多靶點、多通路的作用特點，是治療COPD這類由多種病理機制共同介導的慢性疾病的理想治療手段。

本研究通過網絡藥理學從多個角度探究了JDZKS治療COPD的潛在的分子機制和靶點通路。CT網絡及CI計算結果顯示，甘草活性成分槲皮苷以及多葉棘豆和甘草共有成分山柰酚對網絡貢獻度最大，表示它們在JDZKS抗COPD中發(fā)揮主要作用，有著重要的潛在研究價值。既往研究證實槲皮苷是一種植物類黃酮，具有強大的抗氧化、抗炎、抗感染特性，在COPD小鼠模型中可顯著降低氧化應激和肺部炎癥標志物，并減少細菌計數，能有效預防COPD疾病進展[1920]。山柰酚可與抑制劑kappa B激酶2 （Inhibitor Kappa B Kinase 2，IKK2）ATP結合位點結合并通過磷酸化作用導致抑制IKK2，有助于預防COPD發(fā)生和惡化[21]，以上結果為我們提供了更多的研發(fā)中藥單體治療COPD藥物的新線索。進一步的TD網絡分析顯示AKT1、TNF、EGFR、SRC、IL1B等5個核心靶點在JDZKS治療COPD中尤為重要。后續(xù)的GO與KEGG分析顯示JDZKS從炎癥損傷、氧化應激、細胞凋亡、抗感染、營養(yǎng)代謝等方面干預COPD，發(fā)揮其治療COPD并延緩患者肺功能惡化的作用。組織富集分析顯示JDZKS治療COPD是對全身多個組織和器官共同調控的結果，進一步印證了之前GO和KEGG的分析結果，即表明JDZKS從多角度、多層次出發(fā)防治COPD。分子對接結果表明槲皮苷和山柰酚與核心靶點具有較強的結合力，也進一步間接證明了網絡藥理學預測的準確性。

本研究通過網絡藥理學方法分析和探索了JDZKS治療COPD的潛在物質基礎與治療靶點，為揭示其作用機制提供了理論基礎以及為其后續(xù)試驗的療效評價指標篩選提供方向。但是需要注意的是，網絡藥理學研究尚存在一定局限性，如忽視了藥物劑量、中藥炮制、個體化差異帶來的影響，其次數據庫中成分靶點收錄不全、信息更新滯后，不能完全揭示其藥理作用，因此仍須進一步試驗結果的驗證與支持。

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（2020-09-02收稿本文編輯：張雄杰）實驗研究

基金項目：內蒙古自治區(qū)應用技術研究與開發(fā)資金計劃項目（201701111）——蒙藥復方制劑棘豆止咳散的開發(fā)研究

作者簡介：盛松（1987.01—），男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結合防治心血管疾病，Email：747367050@qq.com

通信作者：扎拉嘎白乙拉（1972.02—），男，本科，主任醫(yī)師，研究方向：蒙醫(yī)防治脾胃疾病，Email：188638400@qq.com