獼猴桃中桔青霉素的殘留量測(cè)定

饒燕娜，關(guān)文碧

（肇慶學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，廣東 肇慶 526061）

獼猴桃是世界新興水果之一，主產(chǎn)地包括新西蘭、中國(guó)、意大利等國(guó)[1].獼猴桃果實(shí)酸甜宜人，營(yíng)養(yǎng)豐富，維生素C含量高，深受消費(fèi)者喜愛.2006～2016年，我國(guó)獼猴桃種植面積增長(zhǎng)了3 倍，產(chǎn)量增長(zhǎng)了4.5 倍.目前，我國(guó)獼猴桃種植面積和產(chǎn)量位居世界第一[2].獼猴桃屬于漿果類水果，皮薄汁多，在采后貯藏過程中極易受到真菌侵染而導(dǎo)致果實(shí)腐爛.段愛莉等[3]從陜西省獼猴桃貯藏期霉?fàn)€果實(shí)中分離出30 株病原菌，主要為青霉屬、木霉屬、交鏈孢霉屬、毛霉屬和擬青霉屬，其中青霉屬為優(yōu)勢(shì)菌.Wang等報(bào)道，擴(kuò)展青霉可引起軟棗獼猴桃腐爛病，低溫貯藏中的發(fā)病果實(shí)水漬狀軟化，病斑由淡黃色變至淺棕色，病斑處有大量青綠色孢子[4].

侵染水果的青霉屬菌可產(chǎn)生大量的次級(jí)代謝毒素，受意大利青霉和橘青霉侵染的柑橘病斑部位桔青霉素（CIT）的含量可高達(dá)276 mg/kg[5-6].CIT（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1）對(duì)動(dòng)物的細(xì)胞組織有很強(qiáng)的毒性作用，并具有潛在的致癌性和誘變性[7].2017年10月27日，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單初步整理參考，CIT在3類致癌物清單中.根據(jù)已報(bào)道的文獻(xiàn)資料，CIT在蘋果汁、番茄汁和櫻桃汁中均有檢出，最大濃度為13 mg/L[8].而我國(guó)目前并沒有建立水果中CIT 的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，且獼猴桃中CIT的殘留分析方法尚未見報(bào)道.

圖1 CIT的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

實(shí)驗(yàn)采用新型納米材料MWCNTs、硅膠鍵合十八烷基（silica bonded octadecyl，C18）和硅膠鍵合乙二胺基-N-丙基（silica bonded primary secondary amine，PSA）的混合物作為分散固相凈化劑，基于改進(jìn)的QuECh-ERS（quick,easy,cheap,effective,rugged and safe）方法對(duì)獼猴桃中CIT進(jìn)行提取凈化，結(jié)合HPLC-MS/MS技術(shù)測(cè)定其CIT殘留量.

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

GZ-P01全營(yíng)養(yǎng)破壁料理機(jī)（佛山市三加一電器有限公司），賽多利斯BSA124S-CW電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），JJ500型電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠），新芝SB-5200DT超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），TDL-5000bR低速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），CCA-20低溫冷卻水循環(huán)泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水真空泵（邦西儀器科技上海有限公司），N-1300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司），SB-1300水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司），湘儀H1650R冷凍高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），MX-S渦旋混合器（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京有限公司），液相色譜柱（Luna?Omega 1.6 μm PS C18，美國(guó)Phenomenex公司），液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（配置ESI電離源、四元梯度泵、高性能自動(dòng)進(jìn)樣器）（Waters Xevo TQD，美國(guó)Waters公司）.

CIT 標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%，北京百靈威科技有限公司），用色譜純乙腈配制成100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-18℃冰箱中貯存?zhèn)溆?乙腈（分析純，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司），乙腈（色譜純，德國(guó)默克股份兩合公司），乙酸乙酯（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），氯化鈉（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司），無水硫酸鎂（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司），十八烷基鍵合硅膠（octadecyl silane，C18）（上海斯信生物科技有限公司），N-丙基乙二胺鍵合硅膠（primary secondary amino，PSA）（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司），MWCNTs（純度95%，南京先豐納米材料科技有限公司）.

1.3 樣品前處理

將獼猴桃整個(gè)果實(shí)切塊，勻漿備用.精確稱取10 g獼猴桃果肉于50 mL具塞塑料離心管中，加入10 mL分析純乙腈，擰緊管蓋，渦旋2 min.再往離心管中加入3 g氯化鈉，于25℃水浴中超聲提取5 min，3 800 r/min離心5 min.精確稱取150 mg C18、50 mg PSA 和5 mg MWCNTs 于2 mL 塑料離心管中，取1 mL 上清液于裝有上述凈化劑的2 mL 塑料離心管中，渦旋30 s，10 000 r/min 離心1 min.用1 mL 無菌注射器吸取凈化液，過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，待測(cè).

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

流動(dòng)相：梯度洗脫程序見表1.流速：0.2 mL/min，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：5 μL.

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（Electrospray Ionization，ESI）.掃描模式：負(fù)離子模式掃描.毛細(xì)管電壓：2.20 kV.脫溶劑溫度：500℃，脫溶劑氣流量：700 L/h.多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)如下：母離子m/z249，錐孔電壓56 V，3 個(gè)子離子分別為m/z130.8、m/z160.9、m/z176.9，子離子對(duì)應(yīng)的碰撞能量分別為38 V、22 V、20 V.

2 結(jié)果與討論

2.1 提取濃縮條件優(yōu)化

2.1.1 提取劑的影響

獼猴桃皮薄多汁，水分含量高，加入乙腈提取后，提取液中含有大量的水分，影響后續(xù)的操作和定量分析，因此，必須進(jìn)行乙腈和水的分離.傳統(tǒng)的QuEChERs方法中加氯化鈉和無水硫酸鎂分離乙腈和水.本試驗(yàn)稱取10.0 g獼猴桃樣品于50 mL具塞離心管中，加入3 mL水和10 mL乙腈，渦旋2 min提取獼猴桃中CIT，然后加入1 g 氯化鈉和4 g 無水硫酸鎂，劇烈手搖后置于冰水中冷卻，取上清液過0.22 μm 濾膜，進(jìn)HPLC-MS/MS分析.通過添加回收試驗(yàn)評(píng)價(jià)無水硫酸鎂的使用對(duì)提取效率的影響.試驗(yàn)結(jié)果表明，使用無水硫酸鎂吸水后，CIT的添加回收率（fortified recoveries, FR）僅有67%，并不能滿足真菌毒素分析的要求.分析原因，可能是無水硫酸鎂吸水放熱，造成熱不穩(wěn)定的CIT分解，因此，提取過程中無水硫酸鎂不適合作為脫水劑，后續(xù)試驗(yàn)中只選用有助于乙腈和水分層的氯化鈉.

2.1.2 濃縮操作的影響

濃縮是在不損失待測(cè)組分即CIT 的前提下，將大體積的溶液去除的過程.取0.1 mg/L 的CIT 標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL 于圓底燒瓶中，不加熱旋蒸至近干，再用洗耳球吹干，用1 mL 色譜純乙腈定容，定容液過0.22 μm 濾膜，進(jìn)樣分析.同時(shí)，將0.1 mg/L的未旋蒸處理的CIT標(biāo)準(zhǔn)溶液過膜進(jìn)樣.進(jìn)樣結(jié)果顯示，未旋蒸處理的標(biāo)液峰面積27 184，旋蒸處理的標(biāo)液平均峰面積7 125，旋蒸操作導(dǎo)致CIT有將近70%的損失.CIT是熱敏性化合物，基于減少待測(cè)組分損失考慮，獼猴桃中CIT的提取凈化過程中不進(jìn)行濃縮.

2.2 凈化條件的優(yōu)化

QuEChERS方法中的傳統(tǒng)凈化劑主要有C18、PSA和石墨化碳黑（graphitized carbon blacks，GCB）[9].C18對(duì)非極性物質(zhì)有較強(qiáng)的保留[10].PSA起極性吸附作用，可與金屬離子螯合，用于除去有機(jī)酸、色素、糖類、金屬離子和酚類物質(zhì).GCB能有效吸附色素.MWCNTs是1種比表面積非常大的新型納米材料，可從樣品中吸附不同物質(zhì)[11].考慮到獼猴桃水分、有機(jī)酸、色素、維生素含量多，樣品中基質(zhì)復(fù)雜，GCB的比表面積小，對(duì)各類物質(zhì)的吸附能力較弱，因此，試驗(yàn)中選擇C18、PSA和MWCNTs 作為凈化劑.

在用C18、PSA、MWCNTs 凈化獼猴桃的乙腈提取液時(shí)，需要考慮2 項(xiàng)指標(biāo)：FR 和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積（peak area of matrix solutions，PAMS），2項(xiàng)指標(biāo)都是越高越好，而這3種凈化劑的用量組合對(duì)這2個(gè)指標(biāo)起著重要作用，根據(jù)前期探索性試驗(yàn)，決定對(duì)每種凈化劑，即每種因素選取3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以得到較好的凈化條件，試驗(yàn)因素和各水平如表2所示.

表2 因素水平表

依據(jù)QuEChERs 樣品前處理方法，按正交表L9（34）對(duì)應(yīng)試驗(yàn)號(hào)的凈化劑用量進(jìn)行凈化，并進(jìn)HPLC-MS/MS 分析，得到結(jié)果如表3 所示.對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單指標(biāo)直觀分析，得到每個(gè)試驗(yàn)指標(biāo)的因素主次順序和優(yōu)方案如表4所示.

表3 試驗(yàn)方案和試驗(yàn)結(jié)果

表4 試驗(yàn)結(jié)果分析

由表5以及趨勢(shì)圖2和圖3可以看出，對(duì)于FR 和PAMS 這2 個(gè)指標(biāo)而言，不同因素的影響程度是不一樣的，且不同指標(biāo)對(duì)應(yīng)的優(yōu)方案也是不同的，需通過綜合平衡法找到最優(yōu)方案，即最優(yōu)凈化劑用量，具體平衡過程如下.

表5 獼猴桃中CIT的平均添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

圖2 不同凈化劑用量下添加回收率趨勢(shì)圖

圖3 不同凈化劑用量PAMS趨勢(shì)圖

因素A：對(duì)于PAMS，A 因素是最主要影響因素，且K2＞K1＞K3，在確定優(yōu)水平時(shí)應(yīng)該重點(diǎn)考慮，PAMS越大越好，則K值越大越好，故優(yōu)先選取A2，即150 mgC18；對(duì)于FR，A 因素是較次要因素，由趨勢(shì)圖可看出，50 mgC18 和150 mgC18 之間的FR相差約7%，在可接受的范圍內(nèi)，綜合考慮最終選擇150 mgC18.

因素B：對(duì)于FR 和PAMS，B 因素都是處于末位的次要因素，B 取哪一個(gè)水平對(duì)2 個(gè)指標(biāo)的影響都比較小，而且對(duì)于2 個(gè)指標(biāo)而言，K3＞K1＞K2，故選取B3，即5 mg MWCNTs.

因素C：對(duì)于FR，C因素是最主要影響因素，由趨勢(shì)圖可看出，PSA用量對(duì)回收率影響極大，幾乎呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，確定優(yōu)水平時(shí)應(yīng)重點(diǎn)考慮.由于FR越大越好，則K值越大越好，經(jīng)計(jì)算得K3＞K2＞K1，故優(yōu)先選擇C3，即50 mgPSA.對(duì)于PAMS 而言，C因素是較次要因素，優(yōu)先選擇的50 mgPSA，對(duì)PAMS 影響較小，出于成本考慮，最終選擇50 mg PSA.

經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化凈化劑用量后，確定凈化劑為150 mgC18、50 mgPSA、5 mgMWCNTs.由于該凈化劑組合未出現(xiàn)在正交試驗(yàn)方案中，需再進(jìn)行一次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).以新鮮綠心獼猴桃為樣品，經(jīng)乙腈提取，用所得最優(yōu)方案凈化進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積相差400，在可接受范圍內(nèi)，平均回收率94.2%，而且在實(shí)驗(yàn)過程中，能明顯觀察到色素的去除效果良好，證明所得最優(yōu)方案凈化效果良好.

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)

基于已優(yōu)化的提取凈化條件，制備空白獼猴桃（綠心、黃心、紅心獼猴桃）的提取液，并配制CIT 濃度為0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L 的獼猴桃基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)HPLC-MS/MS 測(cè)定，以CIT 獼猴桃基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線.試驗(yàn)結(jié)果表明，CIT在0.001～0.2 mg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999.

2.3.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect，ME）是指基質(zhì)成分和目標(biāo)化合物在進(jìn)行離子化時(shí)相互競(jìng)爭(zhēng)而導(dǎo)致目標(biāo)化合物信號(hào)強(qiáng)度有不同程度的增強(qiáng)或減弱的現(xiàn)象[12]，通常以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值來進(jìn)行評(píng)價(jià)[13].當(dāng)ME＜0.9時(shí)，表現(xiàn)為明顯減弱的基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME＞1.1時(shí)，表現(xiàn)為明顯增強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)0.9≤ME≤1.1 時(shí)，表現(xiàn)為無顯著基質(zhì)效應(yīng)[14].經(jīng)過計(jì)算，綠心獼猴桃、黃心獼猴桃和紅心獼猴桃的ME 值為1.01、1.04 和0.77.綠心和黃心獼猴桃無顯著的基質(zhì)效應(yīng)，紅心獼猴桃存在明顯減弱的基質(zhì)效應(yīng)，為了能更準(zhǔn)確地測(cè)定目標(biāo)化合物，并且保證試驗(yàn)對(duì)的平行性，本試驗(yàn)采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)3 個(gè)品種的獼猴桃進(jìn)行定量分析.

2.3.3 添加回收實(shí)驗(yàn)、精密度

在真菌毒素殘留分析中，常采用FR表示方法的準(zhǔn)確度.采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations,RSDs）表示方法的精密度.本實(shí)驗(yàn)采用新鮮綠心、黃心、紅心獼猴桃作為樣品，往空白獼猴桃基質(zhì)中添加CIT標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)低、中、高3個(gè)添加濃度（0.01、0.05、0.1 mg/kg），每個(gè)濃度進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，按上述方法進(jìn)行提取、凈化并測(cè)定，所得FR為80.5%～95.3%，RSDs為1.99%～6.73%，F(xiàn)R與RSDs均符合NY/T788-2018標(biāo)準(zhǔn)[15].

2.3.4 最低檢測(cè)限、定量限

在空白獼猴桃樣品中添加CIT，進(jìn)HPLC-MS/MS 分析，測(cè)定出信噪比為3時(shí)濃度為最低檢測(cè)限，信噪比為10時(shí)濃度為定量限[16].經(jīng)添加回收試驗(yàn)驗(yàn)證，本方法最低檢測(cè)限為0.005 mg/L,定量限為0.01 mg/L.

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用新型碳納米材料MWCNTs 作為分散固相凈化劑，基于改進(jìn)的QuEChERS 方法，通過優(yōu)化提取濃縮條件、凈化劑用量，建立了HPLC-MS/MS法測(cè)定綠心、黃心、紅心獼猴桃中CIT殘留量的方法，該分析方法在CIT濃度為0.001～0.02 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，在添加濃度為0.01、0.05、0.1 mg/kg 時(shí)，F(xiàn)R為80.5%～95.3%，RSDs為1.99%～6.73%.方法的最低檢測(cè)限為0.005 mg/L，定量限為0.01 mg/kg，可用于獼猴桃中痕量CIT的分析檢測(cè).