清肝健脾活血方對四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化大鼠氧化應(yīng)激的影響

潘富珍 劉 定 楊沈秋 張 禹

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

肝纖維化是一種慢性肝損傷過程，其持續(xù)發(fā)展可導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭甚至肝細胞癌[1]。研究顯示，肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化是肝纖維化主要驅(qū)動因素[2]。目前肝纖維化尚無有效治療方法[3]，因此如何阻止肝纖維化進程具有重要意義。課題組前期研究認為，肝失疏泄，肝血瘀滯，肝病傳脾，脾虛濕阻，肝腎虧損是肝纖維化病機動態(tài)變化規(guī)律，清肝健脾活血法為治療本病的重要方法[4]。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用大柴胡湯合鱉甲飲子化裁而成的清肝健脾活血方具有抗肝纖維化作用[5-7]，實驗研究亦證實清肝健脾活血方對免疫性肝纖維化大鼠具有抗炎、抗血管重塑、減少轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）表達、促進細胞外基質(zhì)（ECM）降解作用[8-10]。本研究擬觀察清肝健脾活血方對四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝細胞保護作用及其對氧化應(yīng)激的影響，以進一步探討其抗肝纖維化的分子機制，現(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（150±20）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SCXK（黑）2019-004。所有動物自由飲水飲食，室內(nèi)溫度為20～25 ℃，相對濕度40%～60%。本實驗經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 清肝健脾活血方，藥物組成：鱉甲20 g、柴胡10 g、枳實10 g、黃芩10 g、法半夏9 g、白芍15 g、川芎10 g、黃芪30 g、炒白術(shù)12 g、黃精15 g、甘草10 g、生姜5 g。所有飲片由安徽晉仁中藥飲片有限責(zé)任公司提供。藥物煎煮前浸泡2 h，先將鱉甲煎煮2 h，再加入其他11味藥材，加10倍量水煎煮提取2次，每次1 h，合并水煎液濃縮至藥物濃度（以生藥量計量）為4.875 g/mL，置4 ℃冰箱備用。鱉甲煎丸（國藥準字號：Z42020772）由武漢中聯(lián)藥業(yè)提供，臨用時研末以蒸餾水配制成混懸液，濃度為0.1875 g/mL。甲醛（國藥集團，批號：10014118），戊二醛固定液（雷根生物，批號：1124A17），PBS磷酸鹽緩沖液（Solarbio公司，批號：1131021），CCl4（萬維公司，批號：P20200520031），抗熒光淬滅劑（Solarbio公司，貨號：S2100），橄欖油（山東魯花集團有限公司）。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒由南京建成生物技術(shù)有限公司提供，批號分別為20210402、20210406、20210601、20210601；活 性氧（ROS）檢測試劑盒由碧云天生物技術(shù)有限公司提供，批號：20210601；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體由Boster公司提供，貨號：BM0002。

1.3 主要儀器 德國萊卡2235石蠟組織切片機；德國萊卡TP1020-1全自動組織脫水機；上海一恒科學(xué)儀器有限公司DHG-9031A電熱恒溫箱；梅特勒-托利多AL204電子天平；寧波新藝SB-5200DT超聲波清洗機；Thermo Fresco低溫冷凍離心機；Thermo MultiSkan3酶標儀；Bio-Rad半干槽；其林貝爾水平脫色搖床；Hanna酸度計pH 211；Fluka電動組織勻漿器；海門市其林貝爾QL-902渦旋振蕩儀；Thermo scientific NANODROP 2000分光光度計；天津市萊玻特瑞GFL-70電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；尼康Eclipse Ci-L顯微鏡；尼康Nikon DS-F12顯微鏡拍照系統(tǒng)；Moticam 3000顯微攝影成像系統(tǒng)。

2 實驗方法

2.1 分組、造模與給藥 將72只SD大鼠隨機分為6組，分別為正常組、模型組、鱉甲煎丸組和清肝健脾活血方高、中、低劑量組，每組12只，均予普通全價飼料喂養(yǎng)。采用CCl4誘導(dǎo)肝纖維化經(jīng)典造模方法，除正常組外，其余各組大鼠予40%CCl4-橄欖油混懸液（體積比為2∶3）腹腔注射，每次按2.0 mL/kg劑量，每周2次（每周相同時間段），8周共16次，建立CCl4肝纖維化大鼠模型。正常組大鼠腹腔注射等量橄欖油。造模第2日開始，參考動物與人等效劑量原則[11]，清肝健脾活血方高、中、低劑量組大鼠每日分別灌胃給予32.084、16.042、8.021 g/kg清肝健脾活血方水煎濃縮液，鱉甲煎丸組每日灌胃給予0.925 5 g/kg鱉甲煎丸混懸液，均按1 mL/100 g體質(zhì)量將藥液稀釋后灌胃給藥，1次/d，正常組、模型組灌胃等量生理鹽水，共8周。8周后隨機取3只模型組大鼠肝組織做病理檢查，Metavir分期均在F2以上，證實造模成功[12]。

2.2 取材 各組大鼠于灌胃第56天禁食不禁水12 h，用4%水合氯醛按10 mL/kg腹腔注射，麻醉后腹主動脈取血5 mL，4 ℃靜置4 h，以離心半徑10 cm，3000 r/min離心20 min，分離血清。另切取肝臟組織，于10%甲醛、戊二醛溶液，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 觀察指標

2.3.1 肝臟組織病理 取肝臟組織常規(guī)石蠟包埋，切片厚6 μm。HE染色方法：蘇木素染液染色，沖洗，伊紅染液染色，沖洗，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。Masson染色方法：組織常規(guī)脫蠟至水，入Masson復(fù)合染液5 min，入0.2%醋酸水溶液稍洗，入5%磷鎢酸10 min，0.2%醋酸水溶液浸洗2次，入亮綠染色液5 min，0.2%醋酸水溶液浸洗2次，無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，按照Metavir病理評分標準[12]對大鼠肝臟組織病理進行分期。

2.3.2 血清ALT、AST含量及肝組織勻漿MDA、ROS、SOD水平 取大鼠血清，試劑盒法檢測ALT、AST含量活性。準確稱取肝組織，加入9倍體積生理鹽水，剪碎組織，冰水浴制備勻漿，以離心半徑10 cm，2500 r/min離心10 min，取上清，酶聯(lián)免疫吸附（Elisa）法測定MDA、ROS、SOD水平。

2.3.3 肝組織α-SMA表達 取各組大鼠肝臟組織，蠟塊包埋，切片，脫蠟至水，抗原修復(fù)，血清封閉，一抗孵育，二抗孵育，抗熒光淬滅劑封片，顯微鏡下拍照，用Image-Pro Plus 6.0圖片分析系統(tǒng)對肝組織α-SMA進行定量分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 8.3.0及SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），經(jīng)方差齊性檢驗，方差齊則采用LSD法，方差不齊則采用Games-Howell法；組間等級資料比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠肝組織病理形態(tài)觀察及分期比較 病理結(jié)果顯示，正常組大鼠肝細胞板排列較規(guī)整，沿中央靜脈呈放射狀分布，胞質(zhì)胞核界限較清晰，未見炎細胞浸潤，未見明顯的充血或水腫。模型組大鼠肝細胞板排列不規(guī)整，胞質(zhì)染色不均，可見胞質(zhì)融合腫脹，胞核固縮，沿血管周邊肝細胞呈現(xiàn)中度脂肪樣變性，局部可見有炎細胞聚集成堆，纖維增生，部分可見纖維間隔形成。各給藥組大鼠肝組織病理改變有不同程度的改善，其中以清肝健脾活血方高、中劑量組和鱉甲煎丸組改善較為明顯。各組大鼠肝臟組織Metavir病理分期比較，經(jīng)Kruskal-Wallis H檢驗，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與正常組比較，模型組大鼠肝組織病理分期顯著加重（P＜0.01）；與模型組比較，清肝健脾活血方高、中劑量組及鱉甲煎丸組大鼠肝組織病理分期均顯著改善（P＜0.05，P＜0.01），清 肝健脾活血方低劑量組改善不明顯（P＞0.05）。清肝健脾活血方高劑量組大鼠肝組織病理分期程度顯著輕于低劑量組（P＜0.01）；清肝健脾活血方各劑量組與鱉甲煎丸組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖1、圖2。

圖2 各組大鼠肝組織病理形態(tài)變化（Masson染色，×200）

表1 各組大鼠肝臟組織Metavir病理分期比較 單位：只

3.2 各組大鼠血清ALT、AST含量及肝組織勻漿MDA、ROS、SOD水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST含量及肝組織勻漿MDA、ROS水平均顯著升高（P＜0.01），SOD水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，清肝健脾活血方高、中劑量組和鱉甲煎丸組大鼠血清ALT、AST含量及肝組織勻漿MDA、ROS水平顯 著 降 低（P＜0.05，P＜0.01），低劑量組AST含量、MDA水平顯著降低（P＜0.01），高劑量組SOD水平顯著升高（P＜0.05）。清肝健脾活血方高劑量對上述指標的改善顯著優(yōu)于中、低劑量（P＜0.01）；清肝健脾活血方高劑量組大鼠血清AST含量顯著低于鱉甲煎丸組（P＜0.01）。結(jié)果見表2、表3。

表2 各組大鼠血清ALT、AST水平比較（±s）

表2 各組大鼠血清ALT、AST水平比較（±s）

注： 與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與清肝健脾活血方高劑量組比較，ΔΔP＜0.01。

組別 動物數(shù)/只 劑量/（g/kg） ALT/（U/L） AST/（U/L）正常組 8 - 91.92±4.76 66.33±19.36模型組 8 - 111.60±10.93** 202.78±38.09**清肝健脾活血方高劑量組 8 32.084 94.02±11.60## 80.68±18.69##清肝健脾活血方中劑量組 8 16.042 100.68±10.02#ΔΔ 105.01±19.72##ΔΔ清肝健脾活血方低劑量組 8 8.021 108.17±7.91ΔΔ 157.80±21.53##ΔΔ鱉甲煎丸組 8 0.925 5 98.97±6.19# 112.29±16.78##ΔΔ

表3 各組大鼠肝組織勻漿MDA、ROS、SOD水平比較（±s）

表3 各組大鼠肝組織勻漿MDA、ROS、SOD水平比較（±s）

注： 與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與清肝健脾活血方高劑量組比較，ΔΔP＜0.01。

組別 動物數(shù)/只 劑量/（g/kg） MDA/（nmol/mg prot） ROS相對熒光強度 SOD/（U/mg prot）正常組 8 - 1.65±0.16 1.00±0.00 332.11±49.92模型組 8 - 4.91±1.88** 1.74±0.23** 224.53±29.65*清肝健脾活血方高劑量組 8 32.084 1.69±0.54## 1.28±0.25## 322.30±47.20#清肝健脾活血方中劑量組 8 16.042 1.94±0.53##ΔΔ 1.41±0.17#ΔΔ 265.29±89.29ΔΔ清肝健脾活血方低劑量組 8 8.021 1.69±0.54##ΔΔ 1.43±0.25ΔΔ 268.63±72.17ΔΔ鱉甲煎丸組 8 0.925 5 1.76±0.74## 1.42±0.20# 315.08±50.97

3.3 各組大鼠肝組織α-SMA表達比較 正常組大鼠肝組織僅有少量α-SMA蛋白表達，模型組α-SMA蛋白高表達，各給藥組表達均減少，以清肝健脾活血方高劑量組改善最為明顯。與正常組比較，模型組大鼠肝組織α-SMA的相對表達量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，清肝健脾活血方各劑量組及鱉甲煎丸組α-SMA的相對表達量均顯著降低（P＜0.01）。清肝健脾活血方高劑量組α-SMA表達顯著低于中、低劑量組和鱉甲煎 丸 組（P＜0.05，P＜0.01）。 見圖3、表4。

表4 各組大鼠肝組織α-SMA表達比較（±s）

表4 各組大鼠肝組織α-SMA表達比較（±s）

注： 與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與清肝健脾活血方高劑量組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。

組別 劑量/（g/kg） α-SMA正常組 - 35 584.76±7 307.98模型組 - 380 859.39±38 978.18**清肝健脾活血方高劑量組 32.084 68 845.17±6 195.09##清肝健脾活血方中劑量組 16.042 109 175.61±14 410.19##ΔΔ清肝健脾活血方低劑量組 8.021 172 827.74±13 325.46##ΔΔ鱉甲煎丸組 0.925 5 93 150.54±7 103.73##Δ

圖3 各組大鼠肝組織α-SMA表達（×400）

4 討論

肝纖維化可歸屬于中醫(yī)學(xué)“積聚”“癥瘕”“脅痛”“鼓脹”等范疇，病因病機為外感六淫、疫毒，情志失調(diào)，飲食不節(jié)，煩勞過度，引起肝失疏泄，氣機不暢，郁久化熱，導(dǎo)致濕熱疫毒稽留，日久難去。肝血瘀滯既是肝失疏泄的結(jié)果，也是肝病傳脾、肝病及腎導(dǎo)致疾病加重的重要誘因。治療既要抓住肝失疏泄的主證，也要重視肝病傳脾、肝病及腎的變化規(guī)律，同時瘀血作為肝纖維化發(fā)展過程中的重要病理因素，活血化瘀應(yīng)貫穿治療始終[13]?！端貑枴の宄Ｕ笳摗分杏涊d：“治溫以清，冷而行之……”，提出“清”法治療疾病的概念。清代王泰林在《西溪書屋夜話錄》中提出著名的“治肝三十法”，其中“清肝”法是治療肝火類疾病的重要治法。綜上，我們擬清肝健脾活血法作為肝纖維化的基本治法。清肝健脾活血方方中取咸寒之鱉甲為君藥，軟堅散結(jié)；以柴胡、黃芩、枳實、川芎為臣，疏肝解郁、內(nèi)瀉熱毒；佐以黃芪、白術(shù)益氣健脾，與川芎相配益氣活血，與枳實相配行氣活血；佐以酸苦之白芍柔肝斂陰，辛溫之法半夏、生姜燥濕化痰，正如《血證論》所言之“肝體陰而用陽，此以酸甘補肝體，以辛甘補肝用”，白芍與活血之川芎相配伍養(yǎng)血和陰，半夏和健脾之黃芪、白術(shù)相配燥濕健脾；再佐以黃精滋陰益腎，緊扣肝纖維化肝、脾、腎三臟功能失調(diào)的病機特點，滋水涵木，達到肝脾腎同治的目的，《本草分經(jīng)》有云：“黃精甘平，補氣血而潤安五臟……”；使以甘草健脾益氣，調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏清肝瀉熱、益氣健脾、行氣活血、軟堅散結(jié)之效。

研究顯示，α-SMA是HSCs活化的標志[14]，而ROS被認為能誘導(dǎo)HSCs增殖、遷移、膠原積累和肝纖維化形成[15]。氧化應(yīng)激可由ROS的增加或抗氧化劑的減少引起，來自線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和過氧化物酶體的ROS是慢性肝病發(fā)生發(fā)展的重要原因[16]，ROS在CCl4誘導(dǎo)的肝損傷和纖維化形成中起重要作用[17-18]。MDA是氧化應(yīng)激標志物，可以反映機體氧化應(yīng)激水平[19]，而SOD是重要抗氧化酶，具有內(nèi)源性自由基清除劑功能，在慢性肝病中，SOD表達下調(diào)，使肝臟對超氧化物誘導(dǎo)的損傷敏感[20]，提高SOD水平可以提高細胞抗氧化能力，減輕肝細胞損傷[21-25]。

本研究通過CCl4腹腔注射建立肝纖維化大鼠模型，參照《肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南（2019年版）》選取治法相似的鱉甲煎丸作為陽性對照藥。結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST含量及肝組織MDA、ROS活性和α-SMA表達顯著增高，SOD含量顯著降低，說明CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型肝細胞損傷、氧化應(yīng)激、HSCs活化明顯。與模型組比較，清肝健脾活血方高劑量組大鼠血清ALT、AST含量顯著降低，與鱉甲煎丸組比較清肝健脾活血方高劑量組大鼠血清AST含量降低更為明顯，而AST反映的是肝細胞器的損傷，ALT反映的是肝細胞膜的損傷，說明清肝健脾活血方高劑量具有更好的肝細胞保護作用。另外，清肝健脾活血方高劑量組肝組織Metavir病理分期較中、低劑量組改善更為明顯，說明治療存在劑量依賴關(guān)系，可以篩選高劑量作為后續(xù)研究的治療劑量。本實驗結(jié)果表明，與模型組比較，清肝健脾活血方高劑量組大鼠肝組織MDA、ROS水平顯著降低，SOD水平增高，而鱉甲煎丸組SOD水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明清肝健脾活血方高劑量能更好地提高細胞的抗氧化應(yīng)激能力。本實驗結(jié)果表明，清肝健脾活血方高劑量組與鱉甲煎丸組和清肝健脾活血方中、低劑量組比較，α-SMA降低更為明顯，說明清肝健脾活血方高劑量具有顯著的抑制HSCs活化作用。

綜上，此次實驗說明，提高細胞抗氧化應(yīng)激能力，抑制HSCs活化可能是清肝健脾活血方抗肝纖維化的作用機制之一，鑒于HSCs活化作為肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，下一步將進一步通過實驗研究清肝健脾活血方抑制HSCs活化的作用機制。