茵陳素調(diào)控HIF-1α/BNIP3 通路對(duì)高膽紅素血癥新生大鼠模型神經(jīng)損傷的保護(hù)作用

歐小琴，龔春竹，鄭忠梅，秦 彥，曹明慧

（1.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院成都市婦女兒童中心醫(yī)院急診科；2.內(nèi)分泌科，四川 成都 611731）

高膽紅素血癥是常發(fā)生于新生兒中的一種全球性疾病，持續(xù)的高膽紅素水平可損害患兒大腦、小腦、腦干等部位神經(jīng)功能，造成運(yùn)動(dòng)失調(diào)、肌張力障礙、智力低下、聽(tīng)力喪失等后遺癥，嚴(yán)重影響患兒生長(zhǎng)發(fā)育，膽紅素引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是其主要致病因素[1-2]。細(xì)胞在炎癥、氧化應(yīng)激等各種應(yīng)激因素下可引發(fā)自噬，且自噬作用可保護(hù)細(xì)胞免受損傷，在神經(jīng)源性疼痛及繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，促進(jìn)自噬可減輕炎癥損傷，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[3-4]。低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）/Bcl2/腺病毒E1B 相互作用蛋白3（Bcl2/adenovirus E1B 19kDa protein-interacting 3，BNIP3）通路是調(diào)控細(xì)胞存活、凋亡、自噬等過(guò)程的重要信號(hào)通路，激活HIF-1α/BNIP3 信號(hào)可增強(qiáng)細(xì)胞自噬，促進(jìn)其增殖[5]，保護(hù)心肌組織免受缺血/再灌注損傷[6]，并可減輕順鉑引起的腎上皮細(xì)胞損傷，修復(fù)腎功能[7]；另外在創(chuàng)傷性腦損傷中，上調(diào)HIF-1α 表達(dá)可減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，起到神經(jīng)保護(hù)作用[8]，因而提示HIF-1α/BNIP3 是通過(guò)促進(jìn)自噬抑制膽紅素誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的潛在作用靶點(diǎn)。茵陳素是茵陳、羌活等中藥中含有的香豆素類活性成分，具有抗炎作用，可抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并減輕重癥急性胰腺炎引起的相關(guān)急性肝損傷[9-10]，但其是否可通過(guò)抑制炎癥來(lái)影響膽紅素誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡、自噬，目前還未見(jiàn)明確報(bào)道，本研究建立了高膽紅素血癥新生大鼠模型，對(duì)此進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)SD 大鼠于2020 年5 月中旬購(gòu)買自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2019 0003，雌雄各半，由本院動(dòng)物中心飼養(yǎng)，環(huán)境溫度23℃左右、相對(duì)濕度60%左右，并維持清潔、安靜、透氣，晝夜交替光照（12h/12h），自由飲水飲食。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑有：茵陳素（金錦樂(lè)化學(xué)有限公司），膽紅素（美國(guó)Sigma 公司），HIF-1α 抑制劑BAY 87-2243（美國(guó)Selleck 生物科技有限公司），TUNEL 染色試劑盒、高效放射免疫沉淀測(cè)定（radio-immune precipitation assay，RIPA）裂解液、BCA 試劑盒、OCT 包埋劑（北京索萊寶科技有限公司），大鼠中樞神經(jīng)特異性蛋白（central nervous system specific protein，S100β）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），兔源Anti-GAPDH 抗體、兔源Anti-LC3B 抗體、兔源Anti-Beclin1 抗體、兔源Anti-caspase-3 抗體、鼠源Anti-HIF-1α 抗體、鼠源Anti-BNIP3 抗體（美國(guó)Abcam 公司），兔源Bax 一抗、羊抗鼠二抗（美國(guó)Cell Singaling Technology 公司）等。

使用儀器：SMZ745 光學(xué)顯微鏡[尼康公司（日本）]，MR-96A 酶標(biāo)儀[深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司（中國(guó)）]，CM1950冰凍切片機(jī)-徠卡公司（德國(guó)），JS-power600 電泳儀[上海培清科技有限公司（中國(guó)）]，Power-pac 3000 轉(zhuǎn)膜儀[伯樂(lè)公司（美國(guó)）]，Image-Master 凝膠成像分析儀[Applied Biosystems 公司（美國(guó)）]等。

1.3 方法

1.3.1 模型制備及分組給藥

將雌雄大鼠兩兩配對(duì)合籠，待雌鼠生產(chǎn)后，繼續(xù)飼養(yǎng)，對(duì)7 日齡的新生大鼠腹腔注射膽紅素溶液，劑量為100mg/kg[11]，注射1 次，2d 后觀察大鼠，發(fā)現(xiàn)其皮膚逐漸變黃并加重，出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、轉(zhuǎn)圈、俯伏、肌張力發(fā)生障礙、吃奶困難等神經(jīng)行為學(xué)癥狀，揭示高膽紅素血癥大鼠模型建立成功（模型大鼠可以進(jìn)行人工奶粉喂養(yǎng)，保證其生命體征平穩(wěn)）。模型成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、茵陳素組、BAY87-2243 組、茵陳素+BAY87-2243 組，每組12 只，另取12 只SD 新生大鼠腹腔注射100mg/kg 生理鹽水，設(shè)為對(duì)照組。

參照文獻(xiàn)，茵陳素+BAY87-2243 組大鼠以40mg/kg 的劑量腹腔注射茵陳素溶液，同時(shí)以4mg/kg的劑量灌胃BAY87-2243 溶液；茵陳素組大鼠以40mg/kg 的劑量腹腔注射茵陳素溶液[12]，同時(shí)以4mg/kg 的劑量灌胃生理鹽水；BAY87-2243 組大鼠以4mg/kg 的劑量灌胃BAY87-2243 溶液[13]，同時(shí)以40mg/kg 的劑量腹腔注射生理鹽水；模型組與對(duì)照組大鼠均腹腔注射與茵陳素組相同量的生理鹽水，同時(shí)灌胃與BAY87-2243 組相同量的生理鹽水，各組大鼠均于每天上午用藥1 次，共用藥14 次。

1.3.2 大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)及整合能力檢測(cè)

以橫木行走測(cè)試[14]檢測(cè)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)及整合能力，用藥結(jié)束24h 后，使各組大鼠通過(guò)一個(gè)架起的橫木（高50cm，長(zhǎng)100cm，直徑2.5cm），按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分：大鼠掉下，不能站立在平衡木上，記0 分；大鼠不能移動(dòng)，但能站立在平衡木上，記1 分；大鼠能移動(dòng)，但試圖穿過(guò)平衡木時(shí)掉下，記2 分；大鼠后肢腳滑或失足大于50%的步數(shù)，但能穿過(guò)平衡木，記3 分；大鼠后肢腳滑或失足小于50%的步數(shù)，但能穿過(guò)平衡木，記4 分；大鼠后肢腳滑或失足僅出現(xiàn)1 次，但能穿過(guò)平衡木，記5分；大鼠穿過(guò)平衡木，且無(wú)腳滑或失足，記6分。

1.3.3 標(biāo)本采集和大鼠小腦神經(jīng)元凋亡情況檢測(cè)

橫木行走測(cè)試結(jié)束后，統(tǒng)一麻醉各組大鼠，以注射器從腹主動(dòng)脈吸取血液2mL，離心取上清液，放入-80℃冰箱儲(chǔ)存。斷頭處死大鼠，取出小腦，剪下1g組織放入液氮中保存，剩余組織經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗、4%多聚甲醛固定后，以30%蔗糖溶液脫水、最佳切削溫度復(fù)合材料（opti-mum cutting temperature compound，OCT）包埋劑包埋，置于-25℃冰凍切片機(jī)中冰凍后切片，取出所得冰凍切片，室溫下靜置30min，加入3%過(guò)氧化氫溶液孵育5min，PBS 漂洗后，參照原位末端標(biāo)記法[terminal deoxynucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL]染色試劑盒說(shuō)明書的指導(dǎo)步驟進(jìn)行染色，以30%蔗糖溶液脫水、二甲苯透明后封片，在光學(xué)顯微鏡下任選5 個(gè)視野采集圖片，測(cè)定小腦神經(jīng)元凋亡率，公式：凋亡率=凋亡神經(jīng)元/神經(jīng)元總數(shù)×100%。

1.3.4 大鼠血清S100β、NSE 水平檢測(cè)

將1.3.3 中的血清提前取出，放入4℃冰箱中解凍，參照ELISA 試劑盒說(shuō)明書的指導(dǎo)步驟檢測(cè)其中S100β、NSE 水平。

1.3.5 大鼠小腦組織凋亡、自噬及HIF-1α/BNIP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

將1.3.3 中的小腦組織取出，剪成小塊，加入高效RIPA 裂解液，勻漿，4℃離心，取上清液，參照BCA試劑盒說(shuō)明書指導(dǎo)步驟測(cè)定其中蛋白總濃度，加入上樣緩沖液，100℃煮沸5min，待蛋白變性后各取含20μg 總蛋白的樣品液，上樣后進(jìn)行電泳、濕轉(zhuǎn)，將轉(zhuǎn)移有分離蛋白的硝酸纖維膜置于5%的牛奶中，室溫孵育2h，進(jìn)行封閉，剪下目的蛋白條帶，放入做好標(biāo)記的孵育小盒中，分別加入兔源caspase-3、Bax、Beclin-1、LC3B、GAPDH 及鼠源HIF-1α、BNIP3 一抗溶液（稀釋比分別為：1∶2 000、1∶1 000、1∶5 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000），4℃冰箱中孵育過(guò)夜，以TBST 緩沖液洗滌3 次，加入稀釋比1:2 000的羊抗兔或鼠二抗溶液，孵育2h，以TBST 緩沖液洗滌3 次，蛋白條帶上滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯色，以凝膠成像分析儀采集圖像，并以Tanon 軟件分析條帶灰度值，并計(jì)算各組目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用軟件SPSS 24.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較行SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠橫木行走測(cè)試結(jié)果

各組大鼠橫木行走測(cè)試得分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較顯示：模型組大鼠橫木行走測(cè)試得分低于對(duì)照組；模型組大鼠橫木行走測(cè)試得分低于茵陳素組，但高于BAY87-2243 組；茵陳素+BAY87-2243 組大鼠橫木行走測(cè)試得分低于茵陳素組，但高于BAY87-2243 組，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠橫木行走測(cè)試得分（xˉ±s，n=12）Table 1 Scores of rats in each group in the beam walking test(xˉ±s,n=12)

2.2 各組大鼠小腦神經(jīng)元凋亡結(jié)果

各組大鼠小腦神經(jīng)元凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較顯示：模型組大鼠小腦神經(jīng)元凋亡率明顯高于對(duì)照組；模型組大鼠小腦神經(jīng)元凋亡率高于茵陳素組，低于BAY87-2243 組；茵陳素+BAY87-2243 組大鼠小腦神經(jīng)元凋亡率高于茵陳素組，低于BAY87-2243 組，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1、表2。

圖1 TUNEL 染色檢測(cè)各組大鼠小腦神經(jīng)元凋亡情況（×200）Fig.1 The apoptosis of cerebellar neurons in each group detected by TUNEL staining(×200)

表2 各組大鼠小腦神經(jīng)元凋亡率（xˉ±s）Table 2 Apoptosis rate of cerebellar neurons of rats in each group(xˉ±s)

2.3 各組大鼠血清S100β、NSE 水平測(cè)定結(jié)果

各組大鼠血清S100β、NSE 水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較顯示：模型組大鼠血清S100β、NSE 水平明顯高于對(duì)照組；模型組大鼠血清S100β、NSE 水平高于茵陳素組，低于BAY87-2243 組；茵陳素+BAY87-2243 組大鼠血清S100β、NSE 水平高于茵陳素組，低于BAY87-2243 組，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清S100β、NSE 水平（xˉ±s）Table 3 Serum levels of S100β、NSE of rats in each group(xˉ±s)

2.4 各組大鼠小腦組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果

各組大鼠小腦caspase-3、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較顯示：模型組大鼠小腦組織caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組；模型組大鼠小腦組織caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)水平高于茵陳素組，低于BAY87-2243 組；茵陳素+BAY87-2243 組大鼠小腦組織caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)水平高于茵陳素組，低于BAY87-2243 組，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2、表4。

表4 各組大鼠小腦組織caspase-3、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)水平（xˉ±s）Table 4 The relative expression levels of caspase-3 and Bax protein in cerebellum of rats in each group(xˉ±s)

圖2 免疫印跡檢測(cè)各組大鼠小腦組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of apoptosis related proteins in rat cerebellum detected by Western blot

2.5 各組大鼠小腦組織自噬及HIF-1α/BNIP3 通路相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果

各組大鼠小腦組織自噬及HIF-1α/BNIP3 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較顯示：模型組大鼠小腦組織自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、LC3B）及HIF-1α/BNIP3 通路相關(guān)蛋白（HIF-1α、BNIP3）表達(dá)水平均高于對(duì)照組；模型組大鼠小腦組織自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、LC3B）及HIF-1α/BNIP3 通路相關(guān)蛋白（HIF-1α、BNIP3）表達(dá)水平低于茵陳素組，但高于BAY87-2243 組；茵陳素+BAY87-2243 組大鼠小腦組織自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、LC3B）及HIF-1α/BNIP3 通路相關(guān)蛋白（HIF-1α、BNIP3）表達(dá)水平低于茵陳素組，高于BAY87-2243 組，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表5。

表5 各組大鼠小腦組織自噬及HIF-1α/BNIP3 通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平（±s）Table 5 The relative expression levels of autophagy and HIF-1α/BNIP3 pathway related proteins in cerebellum of rats in each group(±s)

表5 各組大鼠小腦組織自噬及HIF-1α/BNIP3 通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平（±s）Table 5 The relative expression levels of autophagy and HIF-1α/BNIP3 pathway related proteins in cerebellum of rats in each group(±s)

注：a 與對(duì)照組相比，P＜0.05；b 與模型組相比，P＜0.05；c 與茵陳素組相比，P＜0.05；d 與BAY87-2243 組相比，P＜0.05。

組別Beclin-1/GAPDH LC3B/GAPDH HIF-1α/GAPDH BNIP3/GAPDH對(duì)照組（n=12）模型組（n=12）0.18±0.04 0.89±0.17a 0.16±0.05 0.91±0.20a 0.15±0.03 0.80±0.16a 0.13±0.04 0.86±0.19a茵陳素組（n=12）BAY87-2243 組（n=12）茵陳素+BAY87-2243 組（n=12）1.64±0.35b 0.20±0.06b 0.90±0.19cd 1.53±0.28b 0.18±0.06b 0.89±0.23cd 1.41±0.30b 0.17±0.05b 0.82±0.18cd 1.52±0.23b 0.14±0.02b 0.85±0.26cd FP 113.717＜0.001 112.062＜0.001 109.716＜0.001 128.531＜0.001

圖3 免疫印跡檢測(cè)各組大鼠小腦組織自噬及HIF-1α/BNIP3 通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of autophagy and HIF-1α/BNIP3 pathway related proteins in rat cerebellum detected by Western blot

3 討論

3.1 高膽紅素血癥新生大鼠模型的構(gòu)建

高膽紅素血癥在新生兒中發(fā)病頻繁，致死率高，且多數(shù)患兒可遺留永久性的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，明顯降低患兒的生活質(zhì)量，給其家庭帶來(lái)沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。新生兒發(fā)生高膽紅素血癥時(shí)，游離的膽紅素沉積于患兒小腦、海馬、基底節(jié)、腦干等部位，誘導(dǎo)炎癥、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，造成神經(jīng)細(xì)胞變性死亡，引發(fā)嚴(yán)重的腦損傷[1-2,15]。NSE 和S100β 蛋白是神經(jīng)細(xì)胞中特有的標(biāo)記物，廣泛分布于大腦、小腦、腦干等神經(jīng)系統(tǒng)中，可作為檢測(cè)小腦損傷的重要生化指標(biāo)[16]。本文通過(guò)向新生大鼠腹腔內(nèi)注射膽紅素的方法建立新生兒高膽紅素血癥大鼠模型，結(jié)果顯示，注射膽紅素后，大鼠橫木行走測(cè)試得分明顯降低，小腦神經(jīng)元凋亡率、血清S100β 及NSE 水平、凋亡相關(guān)蛋白（caspase-3、Bax）表達(dá)水平明顯升高，表明膽紅素可引發(fā)小腦神經(jīng)元凋亡，造成小腦損傷，導(dǎo)致小腦神經(jīng)功能障礙，揭示模型建立成功。

3.2 茵陳素促進(jìn)自噬，抑制新生兒高膽紅素血癥模型大鼠小腦顆粒神經(jīng)元凋亡

自噬是細(xì)胞在炎癥、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等病理過(guò)程中的一種生存機(jī)制，增強(qiáng)自噬可減輕炎癥、過(guò)氧化等各種應(yīng)激損傷，促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制繼發(fā)性腦損傷中的神經(jīng)元凋亡，保護(hù)神經(jīng)功能[3-4,17]。茵陳素是傳統(tǒng)中藥茵陳的主要有效成分，可抑制炎癥、抗輻射、減輕化療毒性，提高大鼠對(duì)缺氧的耐受度[9-10,12]，因而推測(cè)茵陳素可能通過(guò)抑制炎癥而激活自噬、減輕膽紅素誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡。本研究結(jié)果顯示，高膽紅素血癥模型大鼠經(jīng)茵陳素處理后，其橫木行走測(cè)試得分、自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、LC3B）表達(dá)水平升高，小腦神經(jīng)元凋亡率、血清S100β 及NSE 水平、凋亡相關(guān)蛋白（caspase-3、Bax）表達(dá)水平降低，表明茵陳素可抑制膽紅素誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，激活自噬作用，減少小腦顆粒神經(jīng)元凋亡，緩解小腦損傷，修復(fù)其神經(jīng)功能。

3.3 茵陳素通過(guò)激活HIF-1α/BNIP3 通路而促進(jìn)自噬，抑制膽紅素誘導(dǎo)的小腦神經(jīng)元凋亡

HIF-1α/BNIP3 信號(hào)具有調(diào)控細(xì)胞凋亡和自噬的雙重功能，上調(diào)HIF-1α 及BNIP3 表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞自噬作用而促進(jìn)細(xì)胞存活。研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷可激活HIF-1α/BNIP3 信號(hào)，減輕炎癥，進(jìn)而增強(qiáng)自噬能力，并保護(hù)心肌組織免于缺血再灌注損傷；另外上調(diào)HIF-1α/BNIP3 通路蛋白表達(dá)，可通過(guò)激活自噬而促使脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)[18-20]，因而HIF-1α/BNIP3 可作為促進(jìn)自噬，減輕膽紅素誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的潛在治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，模型大鼠凋亡相關(guān)蛋白（caspase-3、Bax）表達(dá)水平、自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、LC3B）表達(dá)水平、HIF-1α/BNIP3 通路相關(guān)蛋白（HIF-1α、BNIP3）表達(dá)水平升高，表明在膽紅素誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡過(guò)程中，自噬增強(qiáng)，但此時(shí)因細(xì)胞自噬而促進(jìn)細(xì)胞存活的作用并不強(qiáng)，凋亡占主導(dǎo)地位，表現(xiàn)為小腦神經(jīng)元凋亡增加；當(dāng)以HIF-1α 抑制劑BAY87-2243 抑制HIF-1α/BNIP3 信號(hào)激活時(shí)，模型大鼠自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、LC3B）表達(dá)水平降低，小腦神經(jīng)元凋亡率、血清S100β 及NSE 水平、凋亡相關(guān)蛋白（caspase-3、Bax）表達(dá)水平升高，表明下調(diào)HIF-1α/BNIP3 通路蛋白表達(dá)，可減弱自噬作用，促進(jìn)小腦神經(jīng)元凋亡，加重小腦神經(jīng)功能損傷；以茵陳素+BAY87-2243 聯(lián)合處理模型大鼠，與茵陳素單獨(dú)處理相比，大鼠橫木行走測(cè)試得分、自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、LC3B）表達(dá)水平、HIF-1α/BNIP3 通路相關(guān)蛋白（HIF-1α、BNIP3）表達(dá)水平降低，小腦神經(jīng)元凋亡率、血清S100β 及NSE 水平、凋亡相關(guān)蛋白（caspase-3、Bax）表達(dá)水平升高，表明BAY87-2243 可減弱茵陳素增強(qiáng)自噬的作用，抑制小腦神經(jīng)元凋亡，改善小腦神經(jīng)功能的作用，揭示茵陳素可能通過(guò)激活HIF-1α/BNIP3 通路而促進(jìn)自噬，抑制膽紅素誘導(dǎo)的小腦神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，茵陳素能激活HIF-1α/BNIP3 通路，增強(qiáng)自噬作用，抑制小腦神經(jīng)元凋亡，減輕小腦損傷，促進(jìn)其神經(jīng)功能恢復(fù)，為新生兒高膽紅素血癥提供了新的臨床治療思路，HIF-1α/BNIP3 信號(hào)可能是其作用靶點(diǎn)，但HIF-1α/BNIP3 作為可促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬的雙重功能的信號(hào)，其具體明確的調(diào)控機(jī)制，本文只是做了初步探索，還存在一定不足，后續(xù)還要進(jìn)行深入研究。