杞黃葛復(fù)方對(duì)組織工程肝臟非酒精性脂肪性肝病模型的肝臟保護(hù)作用研究

黃 龍,劉 霜,陳 煜，段鐘平

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院肝病中心/肝衰竭與人工肝治療研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

脂肪肝根據(jù)病因可分為非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、酒精性脂肪性肝病(簡(jiǎn)稱酒精性肝病)、特殊類型脂肪肝3類，其中NAFLD最為常見(jiàn)[1]。NAFLD是指除外酒精和其他損肝因素，人體發(fā)生的以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)多沉積為主要特征的一類疾病，多是由于運(yùn)動(dòng)偏少、營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩、攝入脂肪過(guò)多所致[2]。隨著肥胖、高血脂、高血糖及其相關(guān)代謝綜合征全球化的流行，NAFLD現(xiàn)已成為歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家和我國(guó)富裕地區(qū)、富裕人口慢性肝病的重要病因，如果不及時(shí)干預(yù)，甚至?xí)l(fā)展為肝纖維化和肝癌[3-4]。杞黃葛復(fù)方是由多名專家按照張仲景中醫(yī)理論并結(jié)合多年經(jīng)驗(yàn)，反復(fù)論證形成的純中藥經(jīng)驗(yàn)處方，其配料為枸杞子、黃精、葛根、決明子、山楂等。方中枸杞子滋腎潤(rùn)肺、補(bǔ)肝明目，黃精補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾潤(rùn)肺、益腎，全方具有保肝明目、補(bǔ)氣養(yǎng)陰等作用，臨床用于治療NAFLD顯示出較好療效，但其作用機(jī)制不明確。由于NAFLD是多因素作用的結(jié)果，采用傳統(tǒng)方法研究其發(fā)病機(jī)制及藥物作用機(jī)制相當(dāng)困難，因此需要新的體外疾病模型進(jìn)行全面評(píng)估[5]。首都醫(yī)科大學(xué)肝病研究所及首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院人工肝中心團(tuán)隊(duì)，經(jīng)過(guò)多年努力，創(chuàng)新性地構(gòu)建了3D組織工程肝NAFLD模型，該模型采用人的肝細(xì)胞，種屬差異性小，可以更好地模擬脂肪肝損傷的病理特征，是一種良好的NAFLD體外模型。因此本研究通過(guò)體外建立3D組織工程肝NAFLD模型，探討了杞黃葛復(fù)方對(duì)NAFLD的保護(hù)作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 雄性Sprague-Dawley大鼠12只，體重180～220 g，購(gòu)于斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010。實(shí)驗(yàn)前正常飼養(yǎng)。人HepG2細(xì)胞來(lái)自于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院肝病中心四科實(shí)驗(yàn)室。

1.2藥物、試劑與儀器 杞黃葛復(fù)方由河南醫(yī)圣堂藥業(yè)有限公司提供；實(shí)驗(yàn)用DMEM購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司；胎牛血清、胰酶、青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PCR提取試劑盒為T(mén)aKaRa RNA PCR Kit(AWV)；蠕動(dòng)泵購(gòu)自Master-Flex；0.22 μm濾器(millex-GV)、SDC購(gòu)自VETEC；一次性靜脈留置針(泰爾茂Hybria II B型三通)、CCK8試劑盒購(gòu)自DOJINDO公司；活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和三酰甘油(TG)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 本研究方案經(jīng)北京佑安醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(AEEI-2020-076),符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

1.3.1基于去細(xì)胞支架的組織工程肝臟的構(gòu)建大鼠禁食24 h、禁水4 h，用10%水合氯醛麻醉后打開(kāi)腹腔，暴露肝臟及門(mén)靜脈，從門(mén)靜脈插入靜脈留置針，固定后開(kāi)啟蠕動(dòng)泵，流速15～20 mL/min，沖洗約20 min。隨后序貫性泵入2% PLA2酶10 min、預(yù)冷的生理鹽水20 min，然后盡量完整摘取整個(gè)肝臟，對(duì)肝臟支架結(jié)扎、修剪并保留肝中葉，放置于事先裝好DMEM的無(wú)菌異形瓶?jī)?nèi)，連接蠕動(dòng)泵裝置，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中循環(huán)灌流過(guò)夜。

1.3.2高脂培養(yǎng)基的配制 將1 mol/L油酸和棕櫚酸按2∶ 1比例混合37 ℃預(yù)熱后與110 μL NAOH和8.8 mL DMEM混合吹勻超聲振蕩10～30 min，直到無(wú)顆粒存在。接著將34.2 mL的2%BSA加入進(jìn)去充分混勻，同時(shí)用鹽酸進(jìn)行調(diào)定pH值至7.4。將以上混合液進(jìn)行過(guò)濾后，取20 mL加入到500 mL DMEM(內(nèi)含5mL牛胎血清和5mL三抗)中，置于4 ℃冰箱留存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)及模型再細(xì)胞化 將人HepG2細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)基(加入10%牛胎血清和5%雙抗)中培養(yǎng)。基于成年大鼠安靜期間肝臟血流速度[85 mL/(min·kg)],每個(gè)肝臟支架以9 mL/min的灌注速率分3次接種人HepG2細(xì)胞，每次1×107個(gè)細(xì)胞，共3 000萬(wàn)個(gè)。再細(xì)胞化完成后,實(shí)驗(yàn)分為3組，正常組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型組每天灌注高脂培養(yǎng)基；杞黃葛復(fù)方組每天灌注高脂培養(yǎng)基，于第6天同時(shí)灌注100 μg/mL的杞黃葛復(fù)方培養(yǎng)3 d。3組均于第8天培養(yǎng)結(jié)束收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4細(xì)胞毒性檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為空白組和7個(gè)藥物組：將HepG2細(xì)胞配制成40～60個(gè)/μL 的細(xì)胞懸液，加入96孔板中，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后，向培養(yǎng)板中加入配置好的高脂培養(yǎng)基，作用48 h后，杞黃葛復(fù)方各濃度組分別加入1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、1 mg/mL的杞黃葛復(fù)方溶液，空白組不加藥。各組培養(yǎng)24 h后根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)要求，每孔加入10 μL CCK8溶液，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱孵養(yǎng)20 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(OD值)，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.5TG測(cè)定 取正常組、模型組、杞黃葛復(fù)方組肝臟模型消化下來(lái)的HepG2細(xì)胞，用PBS沖洗干凈，并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行處理。然后將2.5 μL細(xì)胞勻漿加入96孔板中，與250μL 工作液混合，37 ℃孵育10 min。在510 nm處測(cè)量OD值，計(jì)算TG含量。

1.3.6ROS檢測(cè) 取正常組、模型組、杞黃葛復(fù)方組肝臟模型消化下來(lái)的HepG2細(xì)胞，用PBS清洗干凈，放入15 mL離心管中，1 500 r/min離心10 min，離心2次后棄掉上清，收集沉淀細(xì)胞，加入裂解液充分裂解細(xì)胞，取破碎后的細(xì)胞懸液，添加500 μL PBS和0.5 μL熒光探針DCFH-DA，在37 ℃水浴鍋中加熱40 min，并用PBS洗滌2次，添加200 μL PBS，混合樣品，用熒光酶標(biāo)儀480 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果。根據(jù)ROS說(shuō)明書(shū)公式計(jì)算細(xì)胞中的ROS含量。

1.3.7MDA檢測(cè) 細(xì)胞懸液的獲取同1.3.6，根據(jù)MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)在96孔板中加試劑和樣本，充分混勻后，在37 ℃細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)20 min，在波長(zhǎng)532 nm的多功能酶標(biāo)儀中測(cè)定吸光度值，根據(jù)說(shuō)明書(shū)公式計(jì)算細(xì)胞中MDA含量。

1.3.8SOD檢測(cè) 細(xì)胞懸液的獲取同1.3.6，根據(jù)SOD試劑盒說(shuō)明書(shū)添加試劑和樣本，使用多功能酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量每個(gè)孔的吸光度值，根據(jù)說(shuō)明書(shū)公式計(jì)算細(xì)胞中SOD含量。

1.3.9肝臟脂質(zhì)合成途徑相關(guān)酶和轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-qPCR檢測(cè)：用TRIzol提取總RNA，稀釋后過(guò)紫外分光光度計(jì)，計(jì)算RNA濃度，然后用DNase處理，使用TakaRa試劑盒反轉(zhuǎn)錄后在ABI SteOnePlus機(jī)器上運(yùn)行qPCR。數(shù)據(jù)收集使用ABI7500軟件，結(jié)果顯示以2-ΔΔCT形式體現(xiàn)，并用GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化。引物序列：脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(CD36)上游引物5’-CTTTGGCTTAATGAGACTGGGAC-3’，下游引物5’-GCAACAAACATCACCACACCA-3’；載脂蛋白B(ApoB)上游引物5’-TGCCTGAGCAGACCATTGAG-3’，下游引物5’-TGTACGGTTGAGCTGCATGT-3’；脂肪酸合酶(FAS)上游引物5’-ACAGCGGGGAATGGGTACT-3’，下游引物5’-GACTGGTACAACGAGCGGAT-3’；ATP檸檬酸裂解酶(ACLY)上游引物5’-TCGGCCAAGGCAATTTCAGAG-3’，下游引物5’-CGAGCATACTTGAACCGATTCT-3’；脂肪酸去飽和酶2(FADS2)上游引物5’-TGACCGCAAGGTTTACAACAT-3’，下游引物5’-AGGCATCCGTTGCATCTTCTC-3’；乙酰輔酶A羧化酶(ACC)上游引物5’-ATGTCTGGCTTGCACCTAGTA-3’，下游引物5’-CCCCAAAGCGAGTAACAAATTCT-3’；脂肪酸結(jié)合蛋白1(FABP1)上游引物5’-GTGTCGGAAATCGTGCAGAAT-3’，下游引物5’-GACTTTCTCCCCTGTCATTGTC-3’；過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ (PPARγ)上游引物5’-GGAGGTCCGCATCTTTCACT-3’，下游引物5’-GCTACCAGCATCCCGTCTTT-3’。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均呈正態(tài)分布，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1杞黃葛復(fù)方的細(xì)胞毒性 1 ng/mL～1 mg/mL的杞黃葛復(fù)方各濃度組高脂培養(yǎng)的人HepG2細(xì)胞存活率與空白組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，說(shuō)明均無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，安全性良好。見(jiàn)圖1。

圖1 空白組和杞黃葛復(fù)方各濃度組人HepG2細(xì)胞存活率

2.2各組HepG2細(xì)胞中TG含量比較 模型組HepG2細(xì)胞中TG含量明顯高于正常組(P<0.05)，杞黃葛復(fù)方組明顯低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 正常組和組織工程非酒精性脂肪肝模型HepG2細(xì)胞中三酰甘油含量

2.3各組HepG2細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較模型組HepG2細(xì)胞中ROS、MDA含量均明顯高于正常組(P均<0.05)，SOD含量明顯低于正常組(P<0.05)；杞黃葛復(fù)方組HepG2細(xì)胞中ROS、MDA含量均明顯低于模型組(P均<0.05)，SOD含量明顯高于模型組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4各組HepG2細(xì)胞中肝臟脂質(zhì)合成途徑相關(guān)酶和轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)情況 杞黃葛復(fù)方組HepG2細(xì)胞中CD36、FAS、ACLY、FADS2、ACC、FABP1、PPARγmRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，ApoB mRNA相對(duì)表達(dá)量與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

3 討 論

組織工程肝技術(shù)是近年來(lái)生物工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，它是借助工程學(xué)原理，將肝細(xì)胞培養(yǎng)在特殊支架材料表面，形成具有肝臟功能的組織和類器官。

圖3 正常組和組織工程非酒精性脂肪肝模型HepG2細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)含量

新一代的組織工程肝因?yàn)榉浅Ｖ庇^、功能接近人類自身肝臟的功能，所以目前除了用于肝衰竭等嚴(yán)重肝病治療外，近年也將其作為藥物篩選及評(píng)價(jià)平臺(tái)和工具。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院人工肝中心前期已經(jīng)成功建立了大鼠去細(xì)胞的肝臟支架系統(tǒng)，借助該系統(tǒng)制備的新型組織工程肝，用于肝臟疾病模型、藥理學(xué)、藥物研發(fā)和暴露于體外的化合物的機(jī)制及毒理學(xué)研究，不但可以更加直觀、科學(xué)地評(píng)價(jià)藥物(單體或復(fù)方、中藥或西藥)作用，還能夠顯著降低藥物試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)人體潛在的危害。故本實(shí)驗(yàn)以此模型為平臺(tái)探討了杞黃葛復(fù)方對(duì)NAFLD的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

圖4 組織工程非酒精性脂肪肝模型HepG2細(xì)胞中肝臟脂質(zhì)合成途徑相關(guān)酶和轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)情況

單純脂肪肝是NAFLD的最早期階段，其主要病理變化是肝細(xì)胞內(nèi)以TG為主的脂滴大量堆積，當(dāng)含有脂肪滴的肝細(xì)胞超過(guò)5%時(shí)，則認(rèn)為存在肝細(xì)胞脂肪變[6-7]。 游離脂肪酸通常以TG的形式存儲(chǔ)，TG的合成有2條途徑：一是血液中的脂肪酸由肝細(xì)胞膜上的CD36 攝取進(jìn)入肝細(xì)胞胞質(zhì)后被FATP或脂酰輔酶A合成酶( ACS) 激活形成?；o酶A[8]；二是脂質(zhì)的從頭合成，即以檸檬酸鹽為原料合成酰基輔酶A，其中ACC和FAS均為從頭合成途徑的限速酶。以上途徑產(chǎn)生的?；o酶A再被甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(GPAT)酯化形成溶血磷脂酸(LPA)和1-?；视?3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(AGPAT)以形成磷脂酸 。磷脂酸通過(guò)脂質(zhì)去磷酸化以形成二酰基甘油(DAG)，再通過(guò)酯化形成TG[9-10]。在病理狀態(tài)下，肝細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成產(chǎn)生的TG占總合成TG的1/3[11]。在這一過(guò)程中，這些酶起到了重要的作用。有研究表明，脂肪肝時(shí)CD36、FAS、ACLY、FADS2、ACC、FABP1會(huì)顯著上調(diào)，從而促進(jìn)TG的合成，合成的TG與ApoB在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中包裝成極低密度脂蛋白(VLDL)，并分泌到竇周間隙中[12]。PPARγ是重要的與脂質(zhì)合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其可以通過(guò)活化脂肪細(xì)胞中輔酶A，促進(jìn)脂肪細(xì)胞中游離脂肪酸合成增加，繼而導(dǎo)致TG合成增加，使脂肪細(xì)胞體積增大[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD的發(fā)生與 PPARγ基因的變異有明確的關(guān)聯(lián)[14]。本研究中發(fā)現(xiàn),杞黃葛復(fù)方干預(yù)后，TG的合成明顯減少，與TG合成相關(guān)酶類和PPARγ的mRNA表達(dá)量明顯降低，但ApoB mRNA表達(dá)量并沒(méi)有什么變化，猜測(cè)可能與杞黃葛復(fù)方抑制了TG合成相關(guān)酶和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而減少了肝臟TG的合成，導(dǎo)致并沒(méi)有太多的TG與載脂蛋白結(jié)合排泄出去有關(guān)。

在NAFLD期間，肝細(xì)胞不再耐受累積的脂肪酸的毒性，從而導(dǎo)致細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的功能障礙，包括線粒體β氧化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，隨后導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡[15]。這一過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，破壞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和NADPH氧化酶，最終影響細(xì)胞功能甚至引起肝細(xì)胞死亡，故氧化應(yīng)激損傷可明顯促進(jìn)NAFLD的發(fā)展[16]。SOD 是一類能夠催化超氧陰離子等自由基發(fā)生歧化反應(yīng)且廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的金屬酶[17]，是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑，可消除過(guò)剩的氧自由基及其衍生物，保護(hù)細(xì)胞免受損傷[18]。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，氧自由基等多種因素可以引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致肝脂肪變性[19]。萬(wàn)順梅等[20]研究報(bào)道，NAFLD患者血清MDA含量明顯升高，SOD活力顯著降低，機(jī)體存在自由基代謝失衡，脂質(zhì)過(guò)氧化損傷肝組織。本研究中，杞黃葛復(fù)方干預(yù)后肝細(xì)胞中ROS和MDA含量明顯降低而SOD含量明顯升高，說(shuō)明杞黃葛復(fù)方可抑制ROS的產(chǎn)生，提高SOD的活力，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，保護(hù)肝細(xì)胞。

綜上所述，杞黃葛復(fù)方可以通過(guò)下調(diào)肝臟脂質(zhì)合成途徑相關(guān)酶和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)而影響脂肪酸代謝，減少TG合成；還可以增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，減輕肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。