益氣溫陽(yáng)顆粒聯(lián)合貝伐珠單抗對(duì)肺癌小鼠腫瘤組織微環(huán)境的影響

劉 偉，謝莉瑩，姜可園，梁綿杰，張慧婷，王雪玭

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250；2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617)

據(jù)最新全球癌癥報(bào)告預(yù)計(jì)，2020年肺癌新發(fā)病例為220萬(wàn)(11.4%)，死亡病例為180萬(wàn)(18%)，在全球癌癥發(fā)病率中位居第二，癌癥死亡率中居首，且從全球范圍看其存活率仍較低[1]。2010—2014年確診的肺癌患者年齡標(biāo)準(zhǔn)化5年生存率只有10%～20%[2]。肺癌成為我國(guó)發(fā)病率與病死率最高的癌癥，這不僅嚴(yán)重威脅到人民的生命健康，也給社會(huì)造成巨大負(fù)擔(dān)，因此迫切需要找到更好的肺癌治療方案。貝伐珠單抗作為抑制腫瘤血管生成藥物目前已大量應(yīng)用于臨床，可抗血管生成，改善腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤發(fā)展與轉(zhuǎn)移，但其存在明顯的不良反應(yīng)，且在治療后期會(huì)出現(xiàn)耐藥性，可能導(dǎo)致惡性程度更高的腫瘤發(fā)生[3-5]。中醫(yī)中藥治療對(duì)惡性腫瘤確有一定療效，與西藥聯(lián)合應(yīng)用有減輕不良反應(yīng)、提高整體療效的作用。本實(shí)驗(yàn)觀察了孫增濤教授依據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)制的益氣溫陽(yáng)顆粒與貝珠伐單抗聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Lewis荷瘤小鼠腫瘤組織微環(huán)境的影響，擬從微觀環(huán)境角度發(fā)掘中醫(yī)藥的潛在作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J雄性小鼠50只，體重(18±2)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(動(dòng)物合格證號(hào)：1100111911037746)，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)小鼠進(jìn)行常規(guī)飼料飼養(yǎng)，所有小鼠均可自由進(jìn)食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(22±2)℃， 濕度為 50%～60%。釆用人工控制室內(nèi)照明，保持12 h光照和黑暗交替循環(huán)。

1.2藥物 貝伐珠單抗注射液100 mg(4 mL)/瓶，Roche Pharma(Switzerland)Ltd.生產(chǎn)(批準(zhǔn)文號(hào)：S20120069)；益氣溫陽(yáng)顆粒：黃芪20 g、肉蓯蓉20 g、淫羊藿20 g、黨參15 g、薏苡仁20 g、莪術(shù)15 g、虎杖20 g、雞內(nèi)金10 g、桔梗10 g、甘草6 g。小鼠的藥量計(jì)算方式據(jù)第3版《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中“動(dòng)物與人體的每千克體重劑量折算系數(shù)表”進(jìn)行折算。

1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器、試劑 分光光度計(jì)(NANODROP 2000，Therno scientific)，熒光定量PCR儀(ABI7500，Applied Biosystems)，顯微鏡(BX51T-PHD-J11，Olympus Corporation)，多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)(Image-Pro Plus，Media Cybernetics)，Lewis肺癌細(xì)胞系(中科院上海細(xì)胞保存中心)，Q-PCR 試劑盒(TaKaRa)，超純RNA提取試劑(TaKaRa)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，5x RNA Loading Buffer(TaKaRa)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1) ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、貝伐珠單抗組、益氣溫陽(yáng)組及貝伐珠單抗+益氣溫陽(yáng)組，每組10只。除正常組小鼠外，其他組小鼠于右腋窩皮下接種0.2 mL細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL的Lewis細(xì)胞。接種后3 d，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，0.4 mL/d；貝伐珠單抗組給予貝伐珠單抗15 mg/kg腹腔注射，每周2次；益氣溫陽(yáng)組給予20 g/kg的益氣溫陽(yáng)顆粒生藥灌胃，1次/d；貝伐珠單抗+益氣溫陽(yáng)組給予貝伐珠單抗腹腔注射及益氣溫陽(yáng)顆粒生藥灌胃，給藥方法及劑量同貝伐珠單抗組和益氣溫陽(yáng)組。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1腫瘤組織病理學(xué)觀察 第14天給藥2 h后將小鼠處死，取出腫瘤組織，予4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟組織包埋、切片(5 μm)，行HE染色，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察。

1.5.2腫瘤組織中低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)表達(dá)檢測(cè) 石蠟切片脫蠟、入水，1%甲醇雙氧水阻斷過(guò)氧化物酶，10 min，PBS洗5 min×3次，放入檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中微波爐內(nèi)微波輻射10 min，降至室溫后PBS洗5 min×3次，滴加正常山羊血清封閉液，20 min，滴加一抗，4 ℃過(guò)夜，PBS洗5 min×3次，滴加二抗，37 ℃ 20 min，PBS洗5 min×3次，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃ 20 min，PBS洗5 min×3次，DAB顯色，復(fù)染，脫水，封片，顯微鏡觀察，圖像分析，計(jì)算免疫組化評(píng)分。免疫組化評(píng)分=百分比評(píng)分×細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分(評(píng)分范圍1～12分)。百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)0～1%記0分，1%～10%記1分，10%～50%記2分，50%～80%記3分，80%～100%記4分；細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞無(wú)染色記0分，淺黃色記1分，棕色記2分，棕褐色記3分。

1.5.3腫瘤組織中促紅細(xì)胞生成素(EPO)和HK1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用Q-PCR法檢測(cè)：依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用超純RNA提取試劑提取組織樣本總RNA，測(cè)定RNA的A260/A280比值，檢測(cè)RNA完整性，對(duì)RNA中殘留基因組DNA進(jìn)行消化處理后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。引物序列：EPO上游5’-CCCACCCTGCTGCTTTTACT-3’，下游5’-TGCACAACCCATCGTGACAT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度150 bp；HK1-F上游5’-TGTGAGGCTCCAGTAGGACA-3’，下游5’-GGAAAGCATCAGTCCTGGCT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度145 bp；內(nèi)參β-actin上游5’-GATGTGGATCAGCAAGCAGGA-3’，下游5’-AGTAACAGTCCGCCTAGAAGCA-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度80 bp。各樣品cDNA 10倍稀釋后取2 μL，目的基因引物和內(nèi)參基因引物擴(kuò)增，60～95 ℃進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)和溶解曲線(xiàn)，所測(cè)得值求2-ΔΔCT計(jì)算各組基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5.4血清中TGF-β1水平檢測(cè) 取各組小鼠血清,嚴(yán)格按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作，用標(biāo)準(zhǔn)物濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)直線(xiàn)回歸方程式，將樣品OD值代入方程式，計(jì)算樣品實(shí)際濃度。

2 結(jié) 果

2.1腫瘤組織病理形態(tài) 模型組：腫瘤細(xì)胞團(tuán)塊狀分布，無(wú)出血現(xiàn)象，排列緊密，生長(zhǎng)旺盛，壞死不明顯，大小、形態(tài)各異，部分細(xì)胞核體積增大，染色較深，數(shù)目增多，分布不均，可見(jiàn)巨核、多核，核分裂象增多，可見(jiàn)不對(duì)稱(chēng)性、頓挫性等病理性核分裂象，間質(zhì)內(nèi)的淋巴細(xì)胞少見(jiàn)，可見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞漿出現(xiàn)空泡變異；貝伐珠單抗組：腫瘤細(xì)胞變小，少量出血，大量凋亡，散在部分孤立細(xì)胞，核分裂象減少，異型性差，出現(xiàn)大量“新月”狀細(xì)胞核，間質(zhì)可見(jiàn)中度炎細(xì)胞浸潤(rùn)；益氣溫陽(yáng)組：腫瘤細(xì)胞團(tuán)塊狀分布變小，偶有少量出血，排列呈片狀且疏松，生長(zhǎng)局限，著色淺，可見(jiàn)散在孤立細(xì)胞，核分裂象較少，可見(jiàn)“新月”狀細(xì)胞核，周?chē)梢?jiàn)小灶狀細(xì)胞壞死及中度炎細(xì)胞浸潤(rùn)；貝伐珠單抗+益氣溫陽(yáng)組：腫瘤組織邊界不清，多處大片狀壞死，腫瘤細(xì)胞顯著減少，碎片易見(jiàn)，多處出血，體積明顯縮小，細(xì)胞之間排列疏松，大量散在的孤立細(xì)胞，核分裂象較少，異型性差，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

2.2腫瘤組織中HIF-1α表達(dá)免疫組化染色情況模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比為39%～49%(對(duì)應(yīng)顏色為棕褐色)，貝伐珠單抗組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比為21%～29%(對(duì)應(yīng)顏色為棕色)，益氣溫陽(yáng)組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比為28%～37%(對(duì)應(yīng)顏色以棕褐色為主，帶有少量棕色)，貝伐珠單抗+益氣溫陽(yáng)組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比為15%～23%(對(duì)應(yīng)的顏色為淺黃色和棕色)。見(jiàn)圖2。

圖1 各組肺癌小鼠腫瘤組織HE染色表現(xiàn)(×400)

2.3腫瘤組織中HIF-1α表達(dá)IHS評(píng)分比較 貝伐珠單抗組、貝伐珠單抗+益氣溫陽(yáng)組小鼠腫瘤組織中HIF-1α表達(dá)IHS評(píng)分均明顯低于模型組(P均<0.05)，且貝伐珠單抗+益氣溫陽(yáng)組明顯低于益氣溫陽(yáng)組(P<0.05)，貝伐珠單抗組和益氣溫陽(yáng)組、貝伐珠單抗+益氣溫陽(yáng)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖2 各組肺癌小鼠腫瘤組織中HIF-1α表達(dá)免疫組化染色表現(xiàn)(×400)

2.4腫瘤組織中EPO和HK1 mRNA表達(dá)情況 貝伐珠單抗組、益氣溫陽(yáng)組及貝伐珠單抗+益氣溫陽(yáng)組腫瘤組織中EPO mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，貝伐珠單抗組和貝伐珠單抗+益氣溫陽(yáng)組均明顯低于益氣溫陽(yáng)組(P均<0.05)，貝伐珠單抗組與貝伐珠單抗+益氣溫陽(yáng)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；貝伐珠單抗組和貝伐珠單抗+益氣溫陽(yáng)組HK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，各藥物組間兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組肺癌小鼠腫瘤組織中EPO和HK1 mRNA表達(dá)情況

2.5各組血清TGF-β1水平比較 模型組小鼠血清TGF-β1水平明顯高于正常組(P<0.05)，貝伐珠單抗組、益氣溫陽(yáng)組及貝伐珠單抗+益氣溫陽(yáng)組均明顯低于模型組(P均<0.05)，貝伐珠單抗組和貝伐珠單抗+益氣溫陽(yáng)組均明顯低于益氣溫陽(yáng)組(P均<0.05)，貝伐珠單抗組與貝伐珠單抗+益氣溫陽(yáng)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 正常組和肺癌各組小鼠血清中TGF-β1水平

3 討 論

中醫(yī)雖無(wú)“肺癌”之病名，但在歷代文獻(xiàn)中提到的有關(guān)“肺積”“息賁”“咳嗽”“胸痛”等都有類(lèi)似于肺癌的論述，因此中醫(yī)在治療肺癌方面已有一定經(jīng)驗(yàn)積累?，F(xiàn)代中醫(yī)藥學(xué)者們多將肺癌責(zé)之為“痰、毒、熱、瘀”，認(rèn)為痰毒血瘀、郁結(jié)在肺為主要病機(jī)，將清熱化痰、解毒化瘀作為主要治療方法，以達(dá)到化痰消瘀、散結(jié)除積的目的。中醫(yī)藥憑借長(zhǎng)久的使用經(jīng)驗(yàn)、明確的治療效果、多靶點(diǎn)的作用模式、較少的不良反應(yīng)等多方面優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于各種癌癥的治療，與西藥聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)抗癌療效、減輕西藥的不良反應(yīng)、延緩腫瘤進(jìn)展，但其發(fā)揮療效的具體作用機(jī)制仍有待探究。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及其治療效果離不開(kāi)腫瘤微環(huán)境的影響，腫瘤細(xì)胞的能量代謝、免疫逃逸，腫瘤組織的血管生成等諸多方面皆與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境組成復(fù)雜，除腫瘤細(xì)胞之外，間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)等均參與其中[6-8]。隨著對(duì)腫瘤微環(huán)境研究的進(jìn)一步深入，中醫(yī)藥改善腫瘤微環(huán)境的作用也逐漸被重視，成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。在對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)的梳理中，筆者發(fā)現(xiàn)中藥確有改善腫瘤微環(huán)境的作用，如益氣溫陽(yáng)類(lèi)中藥、益氣活血解毒類(lèi)中藥可抑制腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等[9-12]。同時(shí)課題組在前期對(duì)121例肺結(jié)節(jié)患者中醫(yī)體質(zhì)調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)節(jié)患者以偏頗體質(zhì)多見(jiàn)，其中又以氣虛體質(zhì)、陽(yáng)虛體質(zhì)為主，且氣虛、陽(yáng)虛體質(zhì)可能貫穿肺結(jié)節(jié)患者結(jié)節(jié)由良性結(jié)節(jié)發(fā)展至肺癌的全過(guò)程[13]。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上探究了益氣溫陽(yáng)類(lèi)成方益氣溫陽(yáng)顆粒與西藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響。該方以益氣溫陽(yáng)散結(jié)為法，結(jié)合肺癌發(fā)病特點(diǎn)，輔以活血消積之藥調(diào)佐，補(bǔ)而不滯，溫而不熱，溫補(bǔ)消散，祛邪而不傷正，使氣血通暢而癥塊自消，臨床應(yīng)用效果頗佳。

本次實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)了腫瘤組織中HIF-1α、EPO、HK1表達(dá)情況及血清中TGF-β1水平，能夠反映出腫瘤組織中缺氧、能量代謝異常、免疫逃逸等多方面問(wèn)題，各因子之間相互影響，涉及多種細(xì)胞及機(jī)制通路。其中HIF-1α在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，在缺氧狀態(tài)下升高并激活EPO、糖酵解等相關(guān)基因表達(dá)以適應(yīng)缺氧環(huán)境，介導(dǎo)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[14-17]。EPO除具有造血作用外，還可影響實(shí)體瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活[18]。HK1也在多種腫瘤組織中表達(dá)，具有糖酵解及抗細(xì)胞凋亡作用，可作為癌癥的預(yù)后生物標(biāo)志物[19-21]；且因糖酵解過(guò)度活躍所產(chǎn)生的酸性環(huán)境會(huì)分解破壞細(xì)胞基質(zhì)，致使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，使腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散加速[23-24]。TGF-β1在腫瘤微環(huán)境的免疫抑制方面發(fā)揮著重要作用，其可促進(jìn)血管生成，參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與化療耐藥、癌癥免疫治療不良反應(yīng)、放射耐受的發(fā)生有關(guān)[25-27]。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，益氣溫陽(yáng)顆?？梢栽谝欢ǔ潭壬弦种品伟┬∈竽[瘤組織中HIF-1α表達(dá)，顯著下調(diào)腫瘤組織中EPO mRNA表達(dá)，降低血清中TGF-β1水平，對(duì)HK1 mRNA表達(dá)有下調(diào)趨勢(shì)；益氣溫陽(yáng)顆粒與貝伐珠單抗聯(lián)合應(yīng)用抑制腫瘤組織中HIF-1α和EPO mRNA表達(dá)、降低血清中TGF-β1水平的作用較益氣溫陽(yáng)顆粒單獨(dú)應(yīng)用更明顯。證實(shí)益氣溫陽(yáng)顆粒聯(lián)合貝伐單抗可明顯改善肺癌小鼠腫瘤組織微環(huán)境，延緩腫瘤進(jìn)展，其影響涉及腫瘤組織中包括血管生成、糖酵解、免疫逃逸等多方面，進(jìn)一步明確了益氣溫陽(yáng)顆粒從整體調(diào)節(jié)出發(fā)、增效減毒的多靶點(diǎn)作用?？紤]到腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，各因子之間存在相互影響，關(guān)于中藥對(duì)于腫瘤微環(huán)境的影響及其具體機(jī)制還需要深入研究，以給肺癌的治療研究提供新的思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。