母乳外泌體載藥用于新生兒相關(guān)疾病治療的研究進(jìn)展

姜承耀，陳文娟，陳小慧，王星云，余章斌，韓樹萍

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院 南京市婦幼保健院兒科，南京 210004)

囊泡是一類人工合成或天然存在的納米粒子，是極具吸引力的智能生物活性分子輸送系統(tǒng)[1]。生物囊泡是一種脂雙層天然納米顆粒，外泌體作為其中一員是近年來的研究熱點，在醫(yī)學(xué)載藥領(lǐng)域，除保護內(nèi)容物免受破壞，傳遞酶類、遺傳物質(zhì)等外，還能介導(dǎo)細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；兼具人工合成囊泡的親水、親脂性能，且擁有更強的滲透性、靶向性及可改造性，能夠促進(jìn)藥效在靶位穩(wěn)定發(fā)揮；并利用其小粒徑、脂溶、穩(wěn)定的物理特性，使得藥物借助外泌體更易被攝取[2]。總之，與脂質(zhì)體、肽和其他納米級藥物遞送系統(tǒng)相比，外泌體具有較好的循環(huán)理化穩(wěn)定性，血腦屏障穿透力和生物兼容性，以及較低的毒性[3-5]。

母乳為嬰幼兒生長發(fā)育提供了較為理想的物質(zhì)基礎(chǔ)。母乳中含有大量的外泌體，研究表明乳源外泌體能夠增強腸干細(xì)胞活性，促進(jìn)腸細(xì)胞增殖，保護腸道通透性及屏障功能，對新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(neonatal necrotizing enterocolitis，NEC)導(dǎo)致的腸損傷有保護作用[6-8]。母乳外泌體改造后的載藥體，不僅擁有外泌體本身的獨特優(yōu)點，還兼具改造后功能[9]。參考相關(guān)研究，對外泌體表面標(biāo)志物進(jìn)行改造，獲得組織細(xì)胞靶向性，增強細(xì)胞間信號通訊[10]；添加藥物分子、遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)等外源性物質(zhì)，可以融合利用內(nèi)源性母乳固有營養(yǎng)物質(zhì)，實現(xiàn)分子水平治療[11-13]?，F(xiàn)就外泌體載藥和母乳外泌體生物學(xué)特性的相關(guān)研究進(jìn)展予以綜述。

1 外泌體載藥

在醫(yī)學(xué)載藥領(lǐng)域，多肽、蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子治療藥物的穩(wěn)定性差和吸收率低是普遍存在的問題，因此納米囊泡載藥體系應(yīng)運而生。目前人工合成的納米囊泡中，針對高分子聚合物囊泡與低分子脂質(zhì)體的研究最常見[14]。然而，這些人工納米載藥體進(jìn)入人體后，易引發(fā)自身免疫反應(yīng)，從而被人體免疫系統(tǒng)清除；同時其靶向性差，因而載藥效率不高且具有一定的毒副作用。近年來，外泌體作為天然生物囊泡的成員之一，因具有介導(dǎo)細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗原呈遞和免疫應(yīng)答等功能，兼具人工合成囊泡的小粒徑、脂溶、穩(wěn)定、高滲透性和可改造性等特點，越來越多地被應(yīng)用于藥物靶向遞送，有望成為藥物遞送系統(tǒng)發(fā)展過程中的一項重要突破。

外泌體載藥研究領(lǐng)域發(fā)展至今，藥物載入方式也多種多樣，包括被動方式和主動方式兩類。被動方式可通過外泌體與藥物共孵育或供體細(xì)胞與藥物共孵育實現(xiàn)，兩種方式均簡單易行，不破壞外泌體膜的完整性[15]。已有研究將牛乳外泌體與紫杉醇共孵育得到外泌體-紫杉醇復(fù)合物，結(jié)果表明這種被動性納米藥物改造技術(shù)克服了口服化療藥物生物利用度差的限制，降低了用藥總劑量，從而減少藥物高劑量導(dǎo)致的毒副作用[16]。主動方式主要包括以下幾種。①超聲法：常用，高效，但破壞膜完整性，且存在“二階段釋放”效應(yīng)，因載入的藥物不僅被外泌體包裹，同時存在于外泌體外層膜中，致使藥物釋放分為兩個階段，附著于外泌體外層的藥物于第一階段釋出，被外泌體包裹的藥物于第二階段釋出；②擠壓法：常用，高效，但破壞膜完整性，且產(chǎn)物存在一定細(xì)胞毒性；③凍融法：中效，能形成外泌體與脂質(zhì)體的膜融合，但易形成聚集，導(dǎo)致較大粒徑分布；④電穿孔：有利于載入小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)、微RNA(microRNA，miRNA)等較大分子物質(zhì)，但易致RNA聚集及外泌體不穩(wěn)定，降低載藥量；⑤膜滲透劑孵育法：載藥效率高，但具有細(xì)胞毒性；⑥點擊化學(xué)法：快速高效，可控；⑦抗體結(jié)合法：具有特殊性，易于操作。無論哪種方法，外泌體膜完整性，改造后復(fù)合體的穩(wěn)定性及載藥效率均是衡量載藥方式優(yōu)劣的金標(biāo)準(zhǔn)[15]。有研究分別使用超聲法、擠奶法、膜滲透劑孵育等方法，高效載入抗氧化過氧化物酶至巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞來源外泌體，后將復(fù)合物導(dǎo)入神經(jīng)元和小鼠顱內(nèi)，分別驗證了其在帕金森神經(jīng)元抗氧化模型和小鼠腦炎模型中的神經(jīng)保護作用[17]。

2 母乳外泌體防治新生兒相關(guān)疾病

母乳能夠有效預(yù)防NEC、支氣管肺發(fā)育不良(broncho-pulmonary dysplasia，BPD)等多種新生兒相關(guān)疾病發(fā)生，其在生命早期具有預(yù)防過敏的潛力，但具體作用機制仍有待研究[18-20]。而外泌體作為近年來發(fā)現(xiàn)的母乳生物活性成分之一，在治療NEC、BPD及過敏性疾病等新生兒相關(guān)疾病中也具有良好的應(yīng)用前景。

相關(guān)指南提示母乳喂養(yǎng)能夠減少新生兒NEC的發(fā)生，但作用機制不明[18]，為此，研究人員首先通過乳源性外泌體作用于大鼠腸上皮細(xì)胞，促進(jìn)了腸上皮細(xì)胞的活力和增殖力，同時提高了腸干細(xì)胞的活性，提示外泌體可能是發(fā)揮抗NEC作用的關(guān)鍵[8]。后續(xù)進(jìn)一步研究表明人母乳外泌體可以減輕過氧化氫處理腸上皮細(xì)胞導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，減少腸上皮細(xì)胞死亡，提示人母乳來源外泌體可能作為降低高危新生兒NEC發(fā)生率和嚴(yán)重程度的治療工具[7]。Wang等[21]的研究發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒母體的母乳來源外泌體可顯著促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖和遷移，對抗NEC損傷，部分恢復(fù)實驗性NEC大鼠腸道上皮的增殖和遷移功能，提示母乳來源外泌體對腸道具有重要保護作用。

研究表明，母乳是多能間充質(zhì)干細(xì)胞的豐富來源[22]。研究人員將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過氣道給藥的方式干預(yù)高氧損傷模型組大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡水平下降，促進(jìn)了細(xì)胞損傷后修復(fù)，可能具有防治BPD的作用[23]。進(jìn)一步向新生大鼠BPD模型腹腔注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體能保護肺泡化和血管生成的肺發(fā)育過程，保護高氧狀態(tài)下新生鼠肺泡和肺血管的正常發(fā)育[24]。因此，母乳多能間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對BPD可能具有潛在治療預(yù)防功能。

世界范圍內(nèi)過敏性疾病的發(fā)生率在過去幾十年中呈不斷升高的趨勢，針對新生兒過敏的研究也不斷增多[25]。有研究從初乳和成熟乳中分離出外泌體進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)其抑制了抗分化簇3誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-2和干擾素的產(chǎn)生，同時增加了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量，證明母乳外泌體具體免疫調(diào)節(jié)特征，能夠調(diào)節(jié)新生兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育[26]。而母乳中的外泌體表型會隨著母親的過敏敏感性和生活方式的不同而變化，進(jìn)而可能會影響新生兒過敏的發(fā)展[27]。此外，母乳來源外泌體能夠結(jié)合被1型人類免疫缺陷病毒感染的單核細(xì)胞衍生樹突狀細(xì)胞，并抑制病毒隨后向分化簇4陽性T細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，從而阻斷1型人類免疫缺陷病毒的垂直傳播，保護新生兒[28]。

母乳外泌體的miRNA以其特殊的作用一直是外泌體內(nèi)容物研究的熱點與重點[29]。母乳外泌體含量最高的miR-22-3p與免疫相關(guān)，其靶向轉(zhuǎn)錄因子7是Wnt途徑中的一個重要效應(yīng)分子，可增加肝糖異生途徑中酶的表達(dá)，因此可作為治療胰島素抵抗和2型糖尿病的靶點[30]。突觸形成、穩(wěn)定性和可塑性是神經(jīng)元發(fā)育的關(guān)鍵特征，研究表明對突觸發(fā)育有積極影響的大部分miRNA存在于母乳外泌體中，提示母乳外泌體中的miRNA可能有益于生命早期的大腦發(fā)育[29]。

3 母乳外泌體載藥在新生兒相關(guān)疾病防治中的作用

富集于母乳中的外泌體，因其自身細(xì)胞來源的脂雙層結(jié)構(gòu)，具備低免疫原性；且母乳外泌體作為藥物載體，低毒或無毒，能夠安全高效地攜帶藥物到達(dá)靶組織，已成為極具應(yīng)用前景的新型載藥體。然而，與人工合成囊泡相比，外泌體雖然具有一定的靶向性，但由于其高度的復(fù)雜性和成分的多樣性，作為載藥體的應(yīng)用仍缺乏普遍靶向性，可能產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，誘發(fā)不良反應(yīng)；而且可溶性低，循環(huán)半衰期短，因此針對外泌體表面標(biāo)志物的改造以獲得靶向性一直是研究熱點；此外，也有大量研究針對內(nèi)容物進(jìn)行改造，近年來主要以外源性的抗腫瘤藥物、核酸分子、轉(zhuǎn)錄因子和酶類，內(nèi)源性母乳多糖、低聚糖、多肽等為“貨物”，將它們載入外泌體后運送到標(biāo)靶位置[31-33]。對母乳外泌體進(jìn)行載藥改造，既保留了外泌體本身的特性，同時充分利用了功能性內(nèi)外源物質(zhì)，又可進(jìn)一步優(yōu)化外泌體的靶向性與穩(wěn)定性，有望為治療新生兒相關(guān)疾病提供新的思路和方法。

3.1對母乳外泌體表面標(biāo)志物的改造 外泌體普遍獲得靶向性的方式是轉(zhuǎn)染其來源細(xì)胞使之表達(dá)靶向成分，然后這種成分與外泌體表面蛋白(如溶酶體相關(guān)膜糖蛋白2b)融合，從而獲得具有特定靶向性的外泌體。如將鼠不成熟樹突狀細(xì)胞來源外泌體的溶酶體相關(guān)膜糖蛋白2b與整合素αv特異性iRGD肽(環(huán)狀精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸肽)融合，獲得整合素αv陽性乳腺癌細(xì)胞的靶向性[34]；或?qū)渫粻罴?xì)胞來源外泌體的溶酶體相關(guān)膜糖蛋白2b與神經(jīng)元特異性狂犬病毒糖蛋白多肽融合，獲得腦部神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的靶向性[33]。但此種靶向改造方式也存在一定的缺點：耗時且操作具有挑戰(zhàn)性；一些靶向配體易發(fā)生不正確表達(dá)且易降解；容易產(chǎn)生非特異性結(jié)合，特異性差，靶向性程度低。還有研究通過“后插入效應(yīng)”將納米抗體、聚乙二醇與神經(jīng)2A細(xì)胞或血小板來源外泌體三者結(jié)合，形成“納米抗體-聚乙二醇-外泌體膜脂質(zhì)”結(jié)構(gòu)，大致解決了靶向改造的主要難點。其中，聚乙二醇可延長外泌體血液循環(huán)中的快速清除時間；而納米抗體具有高度可溶性和特異性，可對抗極端化學(xué)條件[35]。以上研究提示，針對母乳外泌體的靶向性改造，可先根據(jù)治療的需要，尋求合適的靶位受體，再通過轉(zhuǎn)染、融合等改造方式使載有抗腫瘤藥物、核酸分子、蛋白質(zhì)及母乳多糖、低聚糖等“貨物”的母乳外泌體-藥物復(fù)合物獲得靶向性，隨后通過口服或靜脈注射等方式給藥，用以治療NEC、BPD等各種新生兒疾病。

3.2對母乳外泌體內(nèi)容物的改造

3.2.1外源性物質(zhì) 多種癌細(xì)胞株來源的外泌體已被證明可作為導(dǎo)入化療藥阿霉素的載體，與直接用藥相比，外泌體包裹阿霉素組成的復(fù)合體毒性更小，實驗鼠能耐受較高藥物濃度，乳腺癌與卵巢癌組織藥物濃度更高，腫瘤組織減少更明顯，同時能減少脫靶效應(yīng)導(dǎo)致的心肌毒性[36]。有研究表明，將紫杉醇載入巨噬細(xì)胞來源外泌體，能夠增強紫杉醇的腫瘤靶向性，從而抑制肺癌轉(zhuǎn)移灶生長，提高對多重耐藥癌細(xì)胞的治療效應(yīng)，為多種化療藥物治療耐藥癌癥提供了可能[37]。值得注意的是，姜黃素，一種具有良好抗炎、抗癌作用的藥物，低穩(wěn)定性、溶解度和生物利用度大大降低了其作用功效，然而通過乳源性外泌體包裹的方式較好地克服了上述不足，在體外消化模型上相比單藥能更加穩(wěn)定地攜帶內(nèi)容物穿過腸道屏障到達(dá)血液循環(huán)發(fā)揮藥效[38]。

將特定siRNA導(dǎo)入外泌體并將其轉(zhuǎn)入癌細(xì)胞，可導(dǎo)致選擇性基因沉默，使其編碼的RAD51(真核生物體內(nèi)的一種蛋白質(zhì))重組酶消失，最終產(chǎn)生增殖癌細(xì)胞死亡的效果[39]。而研究人員設(shè)計出的攜帶siRNA或短發(fā)夾RNA的外泌體，能夠針對胰腺癌中的常見突變位點KRAS，憑借其強大的靶向性以及內(nèi)含的天然吞噬因子，較脂質(zhì)體具有更高的治療效力[32]。一項研究將乳源性外泌體負(fù)載siRNA后分別作用于血管內(nèi)皮生長因子、表皮生長因子受體、蛋白激酶B、鼠類肉瘤病毒癌基因、促分裂原活化的蛋白激酶的特定基因，結(jié)果表明不同癌癥中，siRNA通過外泌體運載后，其靶基因敲除效率升高2～10倍，并通過進(jìn)一步實驗證明了靜脈注射siRNA外泌體復(fù)合體在裸鼠模型中的抗腫瘤活性，提示乳源性外泌體可用于遞送siRNA進(jìn)行抗癌治療[40]。

另有研究首先利用小鼠干細(xì)胞病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)將轉(zhuǎn)錄因子GATA-4(基因啟動子中的一段保守序列，其核心堿基序列為GATA，具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性的功能)導(dǎo)入大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，使之分泌出GATA-4高表達(dá)的外泌體，該種轉(zhuǎn)錄因子的高表達(dá)能增加心肌的存活、減少凋亡，并且提高缺血心肌的血管形成，進(jìn)而極大改善心功能[41]。后續(xù)將抗凋亡miRNA導(dǎo)入上一步的外泌體中，并將改造外泌體注射至左前降支結(jié)扎后心肌缺血區(qū)邊緣，發(fā)現(xiàn)心臟收縮功能顯著恢復(fù)，心肌梗死面積縮小[42]。此外，研究者借助室溫孵育、皂苷滲透、凍融循環(huán)等技術(shù)將過氧化氫酶完整載入巨噬細(xì)胞來源的外泌體，隨后以外泌體-過氧化氫酶復(fù)合物作用于神經(jīng)組織，結(jié)果提高了神經(jīng)元的存活率，減輕了腦部炎癥反應(yīng)，表明基于外泌體的酶類制劑可能是未來治療神經(jīng)退行性疾病有價值的工具[17]。

因此，可依靠外泌體優(yōu)越的“生物兼容性”，將治療性化療藥物、具備調(diào)節(jié)作用的RNA、轉(zhuǎn)錄因子和酶類等特殊蛋白質(zhì)通過外源性藥物改造方式，以外泌體包裹運輸?shù)男问?，直達(dá)疾病標(biāo)靶，從而解決新生兒給藥普遍存在的吸收性低、生物清除率高、半衰期短的問題，提高療效的同時減少不良反應(yīng)。

3.2.2內(nèi)源性物質(zhì) 母乳的疾病防治作用主要取決于其成分組成，已有多項研究發(fā)現(xiàn)母乳中含有多糖，低聚糖，母乳多肽及分泌型IgA，乳脂球膜，乳清蛋白，乳鐵蛋白，酪蛋白，胰島素樣生長因子-1、表皮生長因子在內(nèi)的多種生物活性物質(zhì)[43-45]。其中，母乳多糖可減少致病菌的黏附，保護早產(chǎn)兒腸上皮細(xì)胞免受細(xì)菌侵襲損傷[46]。而低聚糖對新生兒腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用，有益于乳酸桿菌及雙歧桿菌的生長，起到抑制病原微生物繁殖的作用[47]。母乳多肽則作為一類特殊的生物活性物，已經(jīng)被證實具有抗感染、抗氧化、神經(jīng)和免疫調(diào)控等功能[48]。

因此，憑借母乳多種內(nèi)源性活性物質(zhì)，借助外泌體自身優(yōu)良的載藥性，通過以上載藥方法，合成外泌體-母乳獨特內(nèi)源性營養(yǎng)物復(fù)合體，能夠較大限度地提高對母乳營養(yǎng)物質(zhì)的利用。

4 小 結(jié)

母乳外泌體在母乳中含量較高，相較于其他體液更容易獲取，且更易為人們所接受；同時具備低免疫原性的天然優(yōu)勢，作為高效、穩(wěn)定、給藥方便的載藥復(fù)合體，是一個極具應(yīng)用前景的研究方向。然而母乳外泌體改造后應(yīng)用于臨床仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)：①大規(guī)模生產(chǎn)高純度的外泌體是目前外泌體應(yīng)用于臨床所面臨的最大問題，目前的分離方法尚不成熟，大規(guī)模高純度樣本難以獲取。②無論是對外泌體來源細(xì)胞進(jìn)行加工還是對細(xì)胞分離提純后的外泌體直接改造，兩者均需在嚴(yán)苛的條件下進(jìn)行，在此過程中外泌體本身的性能極易受到影響。③外泌體的生物學(xué)效應(yīng)與來源細(xì)胞密切相關(guān)，制訂出合適的篩選標(biāo)準(zhǔn)也是亟待解決的問題。因此，仍需謹(jǐn)慎對待這種新式載藥體和改造手段，不斷強化提純技術(shù)和方案，制訂安全的策略，進(jìn)一步探索母乳外泌體在新生兒疾病中發(fā)揮的潛在生物學(xué)機制，使其盡快應(yīng)用于臨床。