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    響應(yīng)面法優(yōu)化烏飯樹葉總黃酮的提取及抗腫瘤活性研究

    2022-04-01 12:21:06謝俊俊陳海清尹偉
    藥品評價 2022年24期
    關(guān)鍵詞:葉總液料黃酮

    謝俊俊,陳海清,尹偉

    1.江西省藥品檢查員中心,江西 南昌 330029;2.合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院,安徽 合肥 238010

    烏飯樹(Vaccinium bratetum)Thunb.為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬常綠灌木,在我國江西、湖南、湖北、安徽及廣東等地廣泛分布,其樹葉中含有廣泛的營養(yǎng)成分和藥物活性成分。有研究表明[1],烏飯樹葉中的營養(yǎng)成分和藥物活性成分在抗疲勞、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗菌、抗病毒等方面有明顯作用,尤其是烏飯樹葉總黃酮在抑制腫瘤方面具有較好的應(yīng)用前景[2]。本研究采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化烏飯樹葉總黃酮的提取工藝,并考察了其體內(nèi)抗腫瘤活性,旨在發(fā)現(xiàn)烏飯樹葉的藥用價值。

    1 材料

    1.1 材料與試劑

    烏飯樹葉(干燥品,購自樟樹市藥材市場,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)王道群教授鑒定其為烏飯樹葉),蘆丁對照品(青島泰東制藥有限公司,批號:10082-2021707),乙醇(分析純,東莞市勛業(yè)化學(xué)試劑有限公司)。4T1(小鼠乳腺癌細(xì)胞)荷瘤小鼠(BALB/c)、A549(人肺癌細(xì)胞)荷瘤小鼠(BALB/c)(安徽盛鵬實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司)。甲氨蝶呤(湖北興銀河化工有限公司)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    紫外分光光度計(jì)(上海默威生物科技有限公司)、電子天平(江蘇金壇三金實(shí)驗(yàn)器材有限公司)、BK 型超聲波萃取器(納博科超聲波有限公司)、離心機(jī)(浙江三聯(lián)環(huán)??萍脊荆?。

    2 提取方法

    2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    將蘆丁對照品在120 ℃干燥至恒重,精密稱定10.0 mg 置100 mL 量瓶中,用80%乙醇溶解并定容至刻度,精密量取上述對照品溶液0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL,分別置于25 mL 量瓶中,室溫靜置20 min,最終濃度分別為:0 mg/mL、0.004 mg/mL、0.008 mg/mL、0.012 mg/mL、0.016 mg/mL、0.020 mg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程縱坐標(biāo)為吸光度(y),橫坐標(biāo)為蘆丁對照品濃度值(x),回歸方程為:y=13.32x-0.64(r=0.999 7),線性濃度范圍為:0~0.020 mg/mL。

    2.2 烏飯樹葉總黃酮提取工藝及含量測定

    烏飯樹葉冷風(fēng)干燥后粉碎過200 目篩,精密稱取一定量的粉碎樣品置100 mL 燒瓶中,加入適量80%乙醇,用超聲波萃取器進(jìn)行加熱回流、超聲萃取、抽濾,充分提取3 次[3],所得提取液在3 000 r/min下離心,取上清液定容,室溫放置20 min,用紫外分光光度計(jì)測定提取液吸光度,計(jì)算總黃酮含量和提取收得率。

    3 提取單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

    3.1 提取單因素實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

    3.1.1 提取時間的影響恒定提取工藝中的超聲功率和液料比,考察不同提取時間對總黃酮含量的影響,考察的提取時間分別為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min。從圖1(A)可見,總黃酮含量在120 min 時達(dá)到峰值,總體表現(xiàn)為先升后降趨勢;總黃酮含量在提取120 min 后開始下降,可能為其發(fā)生了降解,且降解速度與提取時間呈現(xiàn)正比關(guān)系[4]。

    3.1.2 液料比的影響恒定提取工藝中的提取時間和超聲功率,考察不同液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)與總黃酮含量之間的關(guān)系。從圖1(B)可見,當(dāng)液料比在40∶1 時,總黃酮含量達(dá)到峰值后,持續(xù)增加提取溶劑的比例,烏飯樹葉總黃酮含量并未持續(xù)增加。

    圖1 各單因素實(shí)驗(yàn)對烏飯樹葉總黃酮的影響:A.提取時間;B.液料比;C.提取超聲功率:

    3.1.3 超聲波功率的影響恒定提取工藝中的提取時間和液料比,考察不同提取超聲波功率(30、60、120、240、360 W)對總黃酮含量的影響。從圖1(C)可見,總黃酮含量在提取功率240 W 時達(dá)到峰值,總體表現(xiàn)為先升后降趨勢,可能原因?yàn)檫^高超聲波功率會破壞并分解黃酮成分。

    3.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

    3.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果將上述“3.1”的單因素實(shí)驗(yàn),作為提取工藝優(yōu)化的基礎(chǔ),利用Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)法[5]對烏飯樹葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,將提取時間等單因素作為自變量,烏飯樹葉總黃酮提取率作為應(yīng)變量,考察了單因素不同水平的影響,通過Design-Expert 8.0.6 軟件,得到響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的方案以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果,具體數(shù)據(jù)詳見表1、表2。

    表1 提取因素與水平設(shè)計(jì)表

    表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

    3.2.2 響應(yīng)面回歸擬合結(jié)果實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過Design-Expert 8.0.6 軟件回歸擬合,烏飯樹葉總黃酮各因素回歸方程:Y(總黃酮百分量)=42.85+0.072A+0.11B+0.060C-0.50AB+0.16AC-0.11BC-1.33A2-0.61B2-0.79C2。方程式將3 個單因素(提取時間、液料比、提取超聲功率)都進(jìn)行編碼處理,由表3 可知,單因素二次項(xiàng)多元回歸擬合結(jié)果表明單因素交互項(xiàng)對總黃酮提取工藝有顯著影響(P<0.001)。

    表3 回歸分析結(jié)果

    3.2.3 響應(yīng)面圖及等高線分析將不同交互項(xiàng)分別做出三維響應(yīng)面圖和對應(yīng)二維等高線,響應(yīng)面圖和對應(yīng)等高線均能直觀反映單因素和響應(yīng)值(Y)三者之間的交互作用關(guān)系。從圖2 中可見,當(dāng)某個單因素保持一定時,烏飯樹葉總黃酮提取率會隨著其他兩個單因素的增加,表現(xiàn)出先升后降趨勢,此結(jié)果表明單因素兩兩之間交互作用顯著,且對烏飯樹葉總黃酮的提取收率呈顯著影響關(guān)系。

    圖2 兩單因素交互作用對含量影響的響應(yīng)面和等高線圖:I.提取時間與液料比;II.提取時間與超聲波功率;III.液料比與超聲波功率

    3.2.4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)經(jīng)過對實(shí)驗(yàn)?zāi)P瓦M(jìn)行驗(yàn)證分析,烏飯樹葉總黃酮提取最佳工藝參數(shù)為提取時間(120 min)、提取超聲功率(240 W)、液料比(40∶1),最佳提取工藝的總黃酮理論收率為41.3 mg/g。為驗(yàn)證提取工藝效果,按照上述工藝參數(shù)進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn),3 次平行實(shí)驗(yàn)的總黃酮收率平均值為40.7 mg/g,與理論預(yù)測值對比的RSD<5%。

    4 烏飯樹葉總黃酮的體內(nèi)抗腫瘤活性

    4.1 烏飯樹葉總黃酮的制備

    按照上述響應(yīng)面優(yōu)化方法提取烏飯樹葉總黃酮,并采用硝酸鋁法測定總黃酮純度(對照品為蘆?。罱K測得總黃酮純度為86.34%。

    4.2 烏飯樹葉總黃酮的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

    分別選取25 只4T1(小鼠乳腺癌細(xì)胞)和25只A549(人肺癌細(xì)胞)的BALB/c 荷瘤小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象,稱重后兩種小鼠均隨機(jī)分為5 組。5 組分別為空白對照組(相同體積PBS:磷酸鹽緩沖生理鹽水)、MTX 組(甲氨蝶呤,腹腔注射,20 mg/kg,隔日1 次)、烏飯樹葉總黃酮低、中、高劑量組(灌胃給藥50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg,1 次/d),連續(xù)給藥12 d 后,處死小鼠,稱重分離出腫瘤組織。抑瘤率公式:抑瘤率(%)=(C-T)/C×100%(C:對照組腫瘤質(zhì)量,T:給藥組腫瘤質(zhì)量)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0 軟件處理,采用t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,當(dāng)P<0.05 時表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表4。

    表4 烏飯樹葉總黃酮對荷瘤小鼠腫瘤的抑制效果()

    表4 烏飯樹葉總黃酮對荷瘤小鼠腫瘤的抑制效果()

    由表4 可知,小鼠在烏飯樹葉總黃酮給藥后體重正常,烏飯樹葉總黃酮給藥組小鼠與空白對照組的體重相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。烏飯樹葉總黃酮高劑量組腫瘤質(zhì)量比空白對照組小,高劑量組、MTX 組的抑瘤率與空白對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    5 討論

    近年來,烏飯樹葉中化學(xué)成分的藥用價值[6-7],受到藥學(xué)工作者的廣泛關(guān)注,尤其是烏飯樹葉中含有的黃酮類化學(xué)成分,逐漸成為研究熱點(diǎn)。因?yàn)檠芯勘砻鳎?],烏飯樹葉中的總黃酮成分,在治療腫瘤上有較好的作用,如人體前列腺癌細(xì)胞株等,Barbara 等[9]的研究證實(shí)了這點(diǎn)。本研究通過Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法及對響應(yīng)面資料分析,建立了烏飯樹葉總黃酮提取工藝的數(shù)據(jù)模型,通過建立的回歸擬合方程分析了單因素交互項(xiàng)對提取工藝的影響,采用響應(yīng)面分析法繪制了響應(yīng)面圖和對應(yīng)等高線,并描述了單因素和響應(yīng)值(Y)三者之間的交互作用關(guān)系,最終得出提取工藝的最佳參數(shù)。通過3 次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),總黃酮收率與理論預(yù)測值相符性良好。

    本研究為進(jìn)一步觀察烏飯樹葉總黃酮的抗腫瘤活性,選擇4T1 和A549 的BALB/c 荷瘤小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,烏飯樹葉總黃酮高劑量組腫瘤質(zhì)量明顯低于空白對照組,高劑量組抑瘤率與空白對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)烏飯樹葉總黃酮具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性,進(jìn)一步完善了烏飯樹葉總黃酮的抗瘤譜[10],為提高烏飯樹植物資源的綜合利用,從天然動植物中尋找更加高效、低毒的抗腫瘤藥物奠定了一定基礎(chǔ)。

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