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    星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化mPEG-PLGA 嵌段共聚物空白納米粒的制備工藝

    2022-04-01 12:21:04張衛(wèi)敏賈莉趙魯亞李麗平李偉男
    藥品評價 2022年24期
    關(guān)鍵詞:磁力共聚物乳化劑

    張衛(wèi)敏,賈莉,趙魯亞,李麗平,李偉男

    1.菏澤醫(yī)學(xué)??茖W(xué)校,山東 菏澤 274000;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040

    聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸(mPEG-PLGA)由親水嵌段PEG 和疏水嵌段PLGA 共同組成。PLGA 在體內(nèi)可生物降解、且降解的同時將包載的藥物緩慢地釋放,被廣泛用作遞藥載體[1]。兼具親水性和生物相容性的PEG 被引入mPEG-PLGA 嵌段共聚物后[2],因巨噬細胞對納米粒的吞噬作用減弱,進而促進納米粒體內(nèi)長循環(huán),增加納米粒包載的藥物在靶部位的蓄積[3]。納米粒作為遞藥載體在靶向治療方面被廣泛應(yīng)用,但非載藥的空白納米粒對靶向治療也具有重要意義,實驗研究中常作為對照組證明載藥納米粒的治療作用[4]。本研究對揮發(fā)法制備的mPEG-PLGA 空白納米粒的處方及工藝進行了一定的篩選及優(yōu)化,為后續(xù)制備載藥納米粒奠定相應(yīng)的基礎(chǔ)。

    1 材料與儀器

    mPEG-PLGA(分子量分別為2 000 Da:12 000 Da、2 000 Da:18 000 Da、2 000 Da:38 000 Da,濟南代罡生物科技有限公司);丙酮(天津市星月化工有限公司);吐溫-80(Tween 80,天津市致遠化學(xué)試劑有限公司);聚乙烯醇(PVA,哈爾濱市振杰科技發(fā)展公司);泊洛沙姆188(Poloxamer 188,德國巴斯夫公司),其他試劑均為分析純。

    ME204E 電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);DF-101S 集熱式磁力攪拌器(上海秋佐科學(xué)儀器有限公司);Zetasizer nano ZSP 動態(tài)光散射儀(英國馬爾文公司);低溫高速離心機(上海市離心機械研究所)。

    2 方法

    2.1 揮發(fā)法制備空白納米粒的工藝

    采用乳化揮發(fā)法制備空白納米粒的操作如下[5]:精密稱取某一分子量的mPEG-PLGA,于丙酮中超聲溶解作為油相;乳化劑溶液作為水相。一定轉(zhuǎn)速進行磁力攪拌的同時,將油相緩慢滴入到水相中。室溫持續(xù)攪拌直至丙酮完全揮發(fā)。低溫高速離心后,棄去上清液,將沉淀水洗3 次,制得最終的納米粒。

    2.2 單因素影響因素實驗

    保持處方及工藝中其他因素不變,分別對mPEG-PLGA 的分子量和濃度、油相與水相比例、不同乳化劑和濃度、磁力攪拌速率、離心過濾方式等處方及工藝的主要影響因素進行考察,以粒徑大?。╯ize)、多分散系數(shù)(Polymer dispersity index,PDI)為考察指標,篩選制備條件,確定星點設(shè)計-效應(yīng)面法(CCD-RSM)的影響因素以及水平。

    2.2.1 mPEG-PLGA 分子量的選擇考察不同mPEG比例的嵌段共聚物對納米粒的影響。其中2 000 Da的mPEG 與38 000、18 000、12 000 Da 三種分子量的PLGA 結(jié)合,組成分別為5%、10%、15%三種種類的mPEG-PLGA。

    2.2.2 mPEG-PLGA 濃度的選擇配制5、10、15、20、25 和30 mg/mL 不同濃度的嵌段共聚物??疾旃簿畚锊煌瑵舛葘{米粒的影響。

    2.2.3 油水兩相比例的選擇將5 mL 油相分散于5、10、15、20 和25 mL 不同體積的水相中,在1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 和1∶5 的油水兩相比例下,考察油水兩相體積比對納米粒的影響。

    2.2.4 乳化劑的選擇分別使用乳化劑Tween 80,PVA 和Poloxamer 188,考察不同乳化劑對納米粒的影響。

    2.2.5 乳化劑濃度的選擇確定乳化劑后,配制0.05%、0.10%、0.50%、1.00%和1.5%五種不同濃度的乳化劑,考察乳化劑濃度對納米粒的影響。

    2.2.6 磁力攪拌速率的選擇使用400、600、800、1 000 和1 200 rpm 不同的攪拌速率,考察攪拌速率對納米粒的影響。

    2.2.7 離心過濾方式的選擇采用不同的過濾離心方式制備空白納米粒:(1)不過濾膜,10 000 rpm離心30 min,舍棄上清液,加水重新混懸納米粒;(2)不過濾膜,14 000 rpm 離心20 min,舍棄上清液,加水重新混懸納米粒;(3)過0.22 μm 孔徑濾膜,10 000 rpm 離心30 min,舍棄上清液,加水重新混懸納米粒??疾烊N過濾離心方式對納米粒的影響。

    2.3 CCD-RSM 優(yōu)化處方方法

    以單因素考察確定結(jié)果為基礎(chǔ),選擇對mPEGPLGA 納米粒制備影響較大且需進一步考察的三個因素作為考察對象,即共聚物濃度(A)、乳化劑濃度(B)和磁力攪拌速率(C)。由中心點、析因設(shè)計點、極值點三個方面進行設(shè)計,五水平(-1.682、-1、0、1、+1.682),以size(Y1)與PDI(Y2)為響應(yīng)參數(shù),各因素以及水平值標準化值根據(jù)實際情況做出調(diào)整,進行CCD-RSM 實驗,并記錄數(shù)據(jù),使用design-expert 11 軟件進行數(shù)據(jù)處理。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 單因素影響因素實驗

    3.1.1 mPEG-PLGA 分子量和濃度的選擇以10%含量的mPEG 作為載體,納米粒的size 和PDI 均較?。▓D1)。當(dāng)共聚物中PEG 的比例不斷減少,size關(guān)系為:10% PEG-PLGA<15% PEG-PLGA<5% PEGPLGA。同時,10% PEG-PLGA 的圖譜中無拖尾現(xiàn)象。但是5%和15% PEG-PLGA 樣品在1 000 nm 以上有1%左右的峰值,可能是溶劑中的雜質(zhì)所致(見圖2)。因此后續(xù)使用mPEG 含量為5%的mPEG-PLGA 嵌段共聚物進行實驗。

    圖1 共聚物種類對納米粒的影響

    圖2 存在余峰代表性圖

    此外,當(dāng)共聚物濃度不斷增加,size 隨之增加,但PDI 值出現(xiàn)先增大后減小的現(xiàn)象(圖3),故共聚物濃度對size 與PDI 值影響明顯,優(yōu)先滿足size 值,為便于研究,選擇合適濃度范圍,故選擇5 mg/mL至15 mg/mL 為后續(xù)優(yōu)化實驗時投料的共聚物濃度。

    圖3 共聚物濃度對納米粒的影響

    3.1.2 油水兩相比例的選擇隨著油水比例減小,size 逐漸增加,PDI 值變化不大(圖4)。因此,選取最小size 值下的油水比例1∶2 作為最佳油水兩相比例。此外制備過程中發(fā)現(xiàn),把油相一滴一滴加入到水相中,乳化效果更好。

    圖4 油水兩相比例對納米粒的影響

    3.1.3 不同乳化劑和濃度的選擇三種不同乳化劑對size 和PDI 影響幾乎相同(圖5)。但Poloxamer 188生物安全性更好[6],因此選擇其作為制備納米粒的乳化劑。當(dāng)Poloxamer 188 濃度從0.05%逐漸增加到1.5%時,size 從62.92 nm 逐漸增加到95.40 nm(圖6)。表明隨著乳化劑濃度逐漸增加,size 隨之增大,但1%乳化劑濃度下size 突然降低,乳化劑濃度對納米粒影響較大,因此乳化劑是形成納米粒的重要因素之一[7]。當(dāng)濃度超過0.5%,PDI 持續(xù)增加,所以確定乳化劑從0.05%至0.5%濃度為范圍,進行后續(xù)優(yōu)化實驗考察。

    圖5 乳化劑種類對納米粒的影響

    圖6 乳化劑濃度對納米粒的影響

    3.1.4 磁力攪拌速率的選擇攪拌速率對納米粒的形成具有影響[8]。速率從400 rpm 增加到800 rpm時,size 和PDI 與轉(zhuǎn)速呈負相關(guān)(圖7)。當(dāng)轉(zhuǎn)速為400 rpm 時,size 較大,PDI 稍高,可能由于轉(zhuǎn)速過低,磁力攪拌不均所致。實驗時延長磁力攪拌時間1~2 h,攪拌更加均勻,PDI 值更小些。而轉(zhuǎn)速為1 200 rpm 時,size 最小,但PDI 值在高于800 rpm后呈現(xiàn)增加趨勢,所以轉(zhuǎn)速過高過低均不利于納米粒的形成。磁力攪拌速率對納米粒的形成影響較大,故選擇600 rpm 至1 000 rpm 速率范圍進一步進行優(yōu)化實驗。

    圖7 磁力攪拌轉(zhuǎn)速對納米粒的影響

    3.1.5 離心過濾方式的選擇采用先過0.22 μm濾膜,再10 000 rpm 離心30 min,棄掉上清液,采用第三種方法制備的納米粒size 和PDI 更合適(圖8)。

    圖8 過濾離心方式對納米粒影響

    3.2 CCD-RSM 優(yōu)化處方結(jié)果

    3.2.1 實驗結(jié)果模擬擬合A、B 和C 響應(yīng)因素對size 以及PDI 的考察,實驗結(jié)果見表1。依據(jù)前述方法以Y1、Y2為因變量,A、B、C 為自變量,對實驗數(shù)據(jù)構(gòu)建二次多項式回歸方程擬合。方程如下:

    表1 CCD-RSM實驗結(jié)果

    方差分析結(jié)果見表2。根據(jù)方程中相關(guān)系數(shù)r值以及P值可知,方程擬合度較高,模型誤差較小,可以較好地反映出效應(yīng)值與影響因素之間的關(guān)系。方差分析結(jié)果顯示,Y1模型P=0.019 6(P<0.05),說明此模型差異有統(tǒng)計學(xué)意義,Y2模型P=0.002 7(P<0.01),相比Y1模型,Y2模型顯著差異更強。評價指標Y1所屬方程中A2與B2對Y1有顯著影響,且A2影響更強,效果極顯著;在評價指標所屬Y2方程中B與B2對Y2有顯著影響。

    表2 方差分析結(jié)果

    3.2.2 三維效應(yīng)面圖與最優(yōu)處方預(yù)測size(Y1)、PDI(Y2)作為納米粒的重要評價指標,對納米粒的質(zhì)量影響較大,故利用該模型構(gòu)建效應(yīng)面三維圖進行最優(yōu)制備工藝預(yù)測。根據(jù)擬合方程繪制三維效應(yīng)面圖(圖9)。結(jié)合最優(yōu)處方要求與軟件預(yù)測結(jié)果,確定該空白納米粒制備工藝條件為:共聚物濃度10.41 mg/mL、乳化劑濃度0.21%、磁力攪拌速率870 rpm。

    圖9 三因素對size與PDI影響的三維效應(yīng)面圖

    3.3 最優(yōu)處方工藝驗證

    對優(yōu)選的處方及工藝的可靠性及穩(wěn)定性進行驗證,按CCD-RSM 篩選出的結(jié)果制備3 批空白納米粒,結(jié)果所得納米粒size 為90.74 nm±2.9 nm、PDI為0.22±0.08。納米粒size 和PDI 均較小,表明該工藝制備方法可行,效果良好。

    4 討論

    本實驗采用乳化揮發(fā)法,操作簡單,方法的重現(xiàn)性較好,可放大至工業(yè)化生產(chǎn)。相較于載藥納米粒,空白納米粒常被用來證明載藥納米粒的治療作用,因此具有良好size 和生物安全性的空白納米粒更應(yīng)深入研究[9]。用載藥納米粒的工藝制備空白納米粒,僅可作為參考,因藥物的溶解性,藥物、載體、有機溶劑之間的強弱作用關(guān)系等,并不是直接按照相同工藝制備所得的空白納米粒size 和PDI 都較好[10]。Poloxamer 188 的濃度越低,乳化效果越好。有報道稱,乳化劑用量不足可致使納米聚沉;隨著乳化劑用量增加,size 會越來越小,但濃度過高時,乳化劑對納米粒的穩(wěn)定性有影響[11],與本研究結(jié)果相吻合。本研究制備了mPEG-PLGA 空白納米粒,運用單因素實驗及星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化篩選出最優(yōu)處方和工藝,制備的空白納米粒size 和PDI 均較小,該處方及工藝可行,為下一步研究提供有益參考。

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