采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)白酒釀造系統(tǒng)中的重要功能菌株Lactobacillus jinshani

張媛，廖衛(wèi)芳，繆禮鴻*，楊團(tuán)元，劉蒲臨，楊一斌

1(武漢輕工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430023)2(湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司，湖北 松滋，434200)

白酒是由多種微生物相互作用共同代謝生產(chǎn)的[1]。白酒釀造過(guò)程中的微生物主要可分為細(xì)菌、酵母和霉菌3大類，白酒發(fā)酵過(guò)程中這些微生物相互影響一起發(fā)揮重要作用。乳酸菌是白酒發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌種，其種類和數(shù)量的變化對(duì)白酒釀造過(guò)程至關(guān)重要[2-3]。乳酸菌既能代謝產(chǎn)生酸類、醛類等物質(zhì)直接影響白酒風(fēng)味，也能通過(guò)產(chǎn)生淀粉酶、酯化酶等影響白酒的出酒率和香味[4-5]。與其他菌種的相互作用方面，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸、乙酸等有機(jī)酸和細(xì)菌素等拮抗物質(zhì)可以影響其他微生物的生長(zhǎng)[6-8]，而其也能夠通過(guò)乳糖酶將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖，為酵母生長(zhǎng)提供碳源[9]。乳酸菌作為白酒釀造過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群在白酒釀造過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，研究白酒發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌分布特征及消長(zhǎng)變化對(duì)于指導(dǎo)白酒生產(chǎn)有重要意義。

傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是使用不同的選擇性培養(yǎng)基對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)分離, 但卻不能及時(shí)反映一般條件難以分離培養(yǎng)的微生物的種類和數(shù)量變化?，F(xiàn)在多種分子生物學(xué)技術(shù)手段被應(yīng)用于食品中乳酸菌的定量[10]。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(quantitative real-time PCR，q-PCR)技術(shù)通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物有效地檢驗(yàn)樣本中的目標(biāo)微生物，該方法靈敏、快速，廣泛應(yīng)用于食品微生物的檢驗(yàn)中[11-13]。GUO等[14]和包秋華等[15]利用q-PCR檢測(cè)研究了發(fā)酵乳中嗜酸乳桿菌，牛犇等[16]將傳統(tǒng)方法q-PCR方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)q-PCR法可快速、高效地檢測(cè)實(shí)際食品基質(zhì)中的微生物。為了快速有效地分析和檢測(cè)復(fù)雜微生態(tài)環(huán)境中的乳酸菌, q-PCR技術(shù)以其較高的可重復(fù)性、靈敏性以及準(zhǔn)確性在微生物定量以及乳酸菌定量研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[17-18]。

Lactobacillusjinshani是從中國(guó)白酒釀造系統(tǒng)中分離出的釀造微生物。YU等[19]首次從鎮(zhèn)江香醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中分離到1株革蘭氏陽(yáng)性、具有異型乳酸發(fā)酵特性的兼性厭氧菌株HSLZ-75T并命名為金山乳桿菌L.jinshani。DU等[20]根據(jù)L.jinshani分布頻率高、相對(duì)豐度高的特點(diǎn)，將L.jinshani作為內(nèi)標(biāo)。用種特異性引物定量測(cè)定了內(nèi)標(biāo)物的絕對(duì)豐度后，用內(nèi)標(biāo)物歸一化方法研究了發(fā)酵后的細(xì)菌群落及其動(dòng)態(tài)。通過(guò)對(duì)乳酸菌的定量微生物群分析，確定乳酸菌是一種關(guān)鍵的風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生菌，與8種風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)。邢敏鈺等[21]通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)L.jinshani是白酒釀造中后期優(yōu)勢(shì)微生物，并且通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)該菌與其他微生物呈負(fù)相關(guān)，其含量與產(chǎn)出原酒質(zhì)量正相關(guān)，在發(fā)酵過(guò)程中扮演著重要角色。本研究根據(jù)L.inshani的全基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了L.jinshani的q-PCR檢測(cè)方法。該方法可快速有效的對(duì)L.jinshani進(jìn)行鑒定，為研究其在白酒釀造系統(tǒng)中的演替及所發(fā)揮的功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

本研究所用菌株均由本實(shí)驗(yàn)室從酒醅中分離獲得，冷凍干燥后保藏于-80 ℃冰箱，包括L.jinshani在內(nèi)的13種微生物分屬5個(gè)屬。實(shí)驗(yàn)所用酒醅均由湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司提供。

1.1.2 試劑和儀器

EB-溴乙錠，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PCR引物(27F、1492R)，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；TaqDNA聚合酶、DL 2 000 DNA marker，大連寶生物公司。

電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；BIO-RAD T100 PCR儀，聯(lián)想生物技術(shù)有限公司；超低溫冰箱，青島海爾股份有限公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Syngene公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取

微生物純培養(yǎng)物基因組DNA提?。菏占幱诜€(wěn)定期的菌體，取1 mL于1.5 mL EP管中，離心收集菌體，按照DNA抽屜試劑盒步驟提取DNA。

酒曲及酒醅樣本基因組DNA 提?。?/p>

(1)將50 g的樣品與100 mL的抽提緩沖液放入燒杯中充分混合之后放入全溫振蕩機(jī)，4 ℃，180 r/min，振蕩30 min，置入離心設(shè)備，中速離心5 min，濾除上層液體，留下底部沉淀。

(2)將沉淀放于燒杯內(nèi)然后加入500 mL抽提緩沖液，混勻后，放于液氮中冷凍然后解凍融化，得到含目標(biāo)的微生物體系。

(3)將目標(biāo)微生物和10 μL 100 mg/mL溶菌酶和20 μL 200 mg/mL溶壁酶放入1.5 mL無(wú)菌EP管中混勻，然后放入全溫振蕩機(jī)37 ℃、180 r/min孵育1 h。

(4)加入60 μL 20%的十二烷基硫酸鈉，30 μL 5%的十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)/NaCl和100 μL 5 mol/L NaCl，混勻后放入水浴鍋中65 ℃水浴1 h；接著置入離心設(shè)備，恒溫4 ℃中高速完成離心操作。

(5)靜置分層后，取上層液體置入小于3 mL的離心管中，加入等量的苯類、酚類混合型物質(zhì)溶液后進(jìn)行離心操作，向原玻璃容器中加入0.1體積的，濃度為3 mol/L且pH值為5～7的乙酸鈉溶液和2倍體積的無(wú)水乙醇溶液，攪拌后置于冷凍設(shè)備1 h。

(6)將裝入溶液的離心管放入差速離心機(jī)內(nèi)，高轉(zhuǎn)速離心10 min，取出沉淀物置于干凈的試管中，用體積分?jǐn)?shù)為90%的醫(yī)用酒精清洗沉淀，重復(fù)2次后恒溫干燥，最后加入30 μL ddH2O溶解化合物的DNA，置于冷凍設(shè)備保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

通過(guò)Nr數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)L.jinshani的全基因序列(GenBank 登錄號(hào)為CP034726.1)進(jìn)行系統(tǒng)的比對(duì)分析，選擇了L.jinshani特有的單拷貝基因?yàn)槟康幕?，使用NCBI primer-blast設(shè)計(jì)特異性引物。

1.2.3 PCR 體系和條件

PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×PowerTaqMaserMix 25 μL，DNA模板1 μL，引物各1 μL，三蒸水 22 μL。

PCR擴(kuò)增16S rDNA，采用乳桿菌16S rDNA的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)與1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

q-PCR反應(yīng)體系(20 μL)：AceQ Universal SYBR Green q-PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.2 μL，模板1 μL，補(bǔ)充ddH2O 至20 μL。

q-PCR的反應(yīng)條件[22]：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線均設(shè)定為從65 ℃升溫至95 ℃，每增加0.5 ℃ 檢測(cè)1次熒光信號(hào)強(qiáng)度，每次檢測(cè)持續(xù)5 s。每次檢測(cè)均含有3個(gè)技術(shù)平行。

1.2.4 有效性和特異性

使用含有L.jinshani的質(zhì)粒、純種L.jinshani基因以及含有L.jinshan.的酒醅基因組作為陽(yáng)性對(duì)照，選擇白酒釀造系統(tǒng)中常見(jiàn)12種非目標(biāo)微生物的基因組作為陰性對(duì)照，通過(guò)PCR驗(yàn)證引物的有效性和特異性。根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照組擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判斷引物的有效性；將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物公司測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果判斷引物擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性；根據(jù)陰性對(duì)照組擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判斷對(duì)于其他微生物的特異性。

1.2.5 載體的構(gòu)建

利用設(shè)計(jì)的特異性引物，以酒醅樣本基因組 DNA 為模板進(jìn)行目標(biāo)片段的擴(kuò)增，取5 μL PCR 產(chǎn)物在1.5%含有染色液EB的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。目標(biāo)片段經(jīng)膠回收后與pMD19-T載體連接，利用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，使用特異性引物擴(kuò)增測(cè)序驗(yàn)證是否轉(zhuǎn)化成功。將已完全形成的質(zhì)粒作為標(biāo)樣，采用蛋白核酸檢測(cè)定量?jī)x器來(lái)驗(yàn)證所測(cè)質(zhì)粒的濃度大小，最后根據(jù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)符合度，進(jìn)行冷藏保存。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

構(gòu)建好的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品以10倍稀釋梯度進(jìn)行稀釋，共制備-1～-7共7個(gè)稀釋梯度。以原始濃度和經(jīng)過(guò)稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行q-PCR，測(cè)定對(duì)應(yīng)的Cq值，構(gòu)建質(zhì)?？截悢?shù)與Cq值之間的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴(kuò)增效率E計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：E，擴(kuò)增效率；a，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.2.7 重復(fù)性檢驗(yàn)

以10倍梯度稀釋1.2.5中質(zhì)粒樣本，以稀釋104倍～107倍的樣本為q-PCR檢測(cè)模板測(cè)定對(duì)應(yīng)的Cq值，每個(gè)稀釋度3次重復(fù)，計(jì)算Cq值的變異系數(shù)，對(duì)q-PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.8 q-PCR及高通量測(cè)序檢測(cè)酒曲及酒醅中的L.jinshani

以釀造過(guò)程中酒曲及不同輪次的酒醅基因組DNA作為模板進(jìn)行q-PCR檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出核酸濃度，樣品中L.jinshani的含量計(jì)算如公式(2)所示。每次陽(yáng)性對(duì)照選擇L.jinshani純種DNA，陰性對(duì)照選擇無(wú)菌水，保證熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

(2)

式中：K，拷貝數(shù)，copies/mL；ρ，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度，g/mL；MW為相對(duì)分子質(zhì)量，Da。

同時(shí)將酒曲及酒醅基因組DNA送至武漢華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，對(duì)擴(kuò)增子片段進(jìn)行高通量測(cè)序，分析結(jié)果中可操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，得到L.jinshani在樣品細(xì)菌菌落中的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的設(shè)計(jì)

為構(gòu)建q-PCR快速定性及定量檢測(cè)方法，對(duì)L.jinshani的全基因序列(GenBank 登錄號(hào)為CP034726.1)進(jìn)行系統(tǒng)的比對(duì)分析，選擇了L.jinshani特有的單拷貝基因?yàn)槟康幕?，如圖1所示，使用NCBI primer-blast設(shè)計(jì)的特異性引物為：上游引物F:5′-TGCCACAAGGCTATCACCTC-3′, 長(zhǎng)度為20 bp，(G+C)mol%為57.75%；下游引物R:5′-AACTCTTGGCTTCGCTGACG-3′, 長(zhǎng)度為20 bp，(G+C)mol%為60.95%。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為226 bp，上下游引物不存在成環(huán)、發(fā)夾等結(jié)構(gòu)，將此特異性引物進(jìn)行blast比對(duì)結(jié)果如圖2所示，對(duì)目標(biāo)片段具有特異性，可用于后續(xù)q-PCR檢測(cè)方法的構(gòu)建。

圖1 L.jinshani擴(kuò)增目標(biāo)基因片段Fig.1 L.jinshani amplification of target fragment gene

圖2 特異性引物blast比對(duì)結(jié)果Fig.2 Blast comparison of specific primers

2.2 PCR檢測(cè)引物特異性

使用2.1中設(shè)計(jì)的L.jinshani特異性引物對(duì)15種不同的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)擴(kuò)增引物，結(jié)果如圖3所示，泳道1到泳道12在266 bp處未出現(xiàn)特征條帶，結(jié)果顯示為陰性，表明該引物對(duì)其他12 種微生物無(wú)交叉反應(yīng)；泳道13、泳道14和泳道15在266 bp處出現(xiàn)特征條帶，結(jié)果為陽(yáng)性，均為已知含有L.jinshani目標(biāo)片段的樣品相符。結(jié)果表明使用該引物擴(kuò)增僅能特異性擴(kuò)增出含有L.jinshani基因片段的樣品，說(shuō)明該引物特異性良好，能夠?qū)悠分械腖.jinshani進(jìn)行特異性檢測(cè)。

M-2 000 bp DNA marker；1-Lactobacillus buchneri；2-Lactobacillus pontis；3-Lactobacillus casei；4-Lactobacillus farraginis；5-Lactobacillus plantarum；6-Lactobacillus parafarraginis；7-Lactobacillus panis；8-Bacillus oleronius；9-Bacillus circμLans；10-Acetobacter pasteurianus；11-Pediococcus pentosaceus；12-Saccharomyces cerevisiae；13-含有L.jinshan的質(zhì)粒；14-L.jinshan.；15-含有L.jinshan.的酒醅；16-ddH2O圖3 PCR驗(yàn)證引物特異性Fig.3 Validating primer specificity by PCR

2.3 q-PCR檢測(cè)引物特異性

用2.2中的12種非L.jinshani的菌種DNA樣品及L.jinshani的菌株DNA樣品分別作為模板，利用特異性引物分別進(jìn)行q-PCR。結(jié)果如圖4所示，只有L.jinshani菌株組出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線，其他12種菌種均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，對(duì)其他12 種微生物無(wú)交叉反應(yīng)，結(jié)果表明該引物在q-PCR方法上也具有良好的種間特異性，可用于區(qū)分L.jinshani與其他微生物。

圖4 L.jinshani與對(duì)照菌株的q-PCR的檢測(cè)結(jié)果Fig.4 q-PCR detection results of L.jinshani and control strains

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

回收的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒質(zhì)量濃度為135.26 ng/μL，將構(gòu)建好的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品以10 倍稀釋梯度進(jìn)行稀釋，共制備-1～-7共7個(gè)稀釋梯度。各濃度梯度質(zhì)粒樣本的稀釋曲線均為平穩(wěn)光滑的S 型，如圖5所示，最低檢出量為3.08×103copies/μL；如圖6所示，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，以q-PCR反應(yīng)過(guò)程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Cq)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3.354x+10.613，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.354，線性R2=0.99，通過(guò)斜率計(jì)算擴(kuò)增效率為98.7%，滿足標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求，可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)和實(shí)際生產(chǎn)。

圖5 重組質(zhì)粒梯度的10倍梯度稀釋擴(kuò)增曲線Fig.5 The amplification curve of serial 10-fold dilutions of recombinant plasmid

圖6 L.jinshani 目的基因拷貝數(shù)與Cq值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 The standard curve between L.jinshani target fragment gene copies number and Cq value

2.5 重復(fù)性檢驗(yàn)

以2.4中的質(zhì)粒為擴(kuò)增模板將構(gòu)建好的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品以10倍稀釋梯度進(jìn)行稀釋，共制備-3～-7共5個(gè)稀釋梯度。研究特異性引物qPCR定量方法的可重復(fù)性。結(jié)果如表1所示，Cq值的變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)在0.61%～3.06%，在每個(gè)稀釋梯度樣本的檢測(cè)結(jié)果中均有良好的重復(fù)性，證明基于特異性引物構(gòu)建的q-PCR定量方法具有重復(fù)性，適用于定量含有不同濃度L.jinshani的樣本。

表1 q-PCR定量檢測(cè)方法的重復(fù)性Table 1 The reproducibility of q-PCR

2.6 酒曲及酒醅中L.jinshani含量的檢測(cè)

如表2所示，通過(guò)L.jinshani特異性引物q-PCR的方法定量檢測(cè)湖北酒廠中酒曲及不同輪次酒醅發(fā)現(xiàn)。酒曲中L.jinshani含量較低無(wú)法檢測(cè)到其含量，第1輪次中L.jinshani含量較低無(wú)法檢測(cè)到其含量，在第2輪次酒醅中L.jinshani含量達(dá)到(8.9±0.11)lgcopies/g，在第4輪次酒醅中L.jinshani含量達(dá)到(9.38±0.11) lgcopies/g，第5輪酒醅中L.jinshani含量達(dá)到(9.43±0.11)lgcopies/g。通過(guò)高通量檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，酒曲中未檢測(cè)出L.jinshani，1輪酒醅中L.jinshani含量為9.05%，2輪酒醅中L.jinshani含量為81.51%，4輪酒醅中L.jinshani含量為99.71%，5輪酒醅中L.jinshani含量為99.47%。q-PCR檢測(cè)與高通通量檢測(cè)得到不同輪次酒培的L.jinshani含量相對(duì)應(yīng)。從結(jié)果可以看出，L.jinshani在白酒發(fā)酵后期數(shù)量迅速增長(zhǎng)，成為后期產(chǎn)優(yōu)質(zhì)原酒的酒醅中的優(yōu)勢(shì)菌種。

表2 不同樣品中L.jinshani含量Table 2 The content of L.jinshani in different samples

3 結(jié)論與討論

L.jinshani被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于全國(guó)各產(chǎn)區(qū)白酒釀造體系中[22]。根據(jù)本研究結(jié)果，酒曲中并未發(fā)現(xiàn)L.jinshani，其來(lái)源可能為釀酒過(guò)程中的其他途徑。白云邊第1輪酒醅中L.jinshani出現(xiàn)的比率很小，推測(cè)與酒醅酸度有關(guān)。已有報(bào)道L.jinshani在酒醅后期占優(yōu)勢(shì)[22]，可能與該菌具有較好的耐酸性有關(guān)。發(fā)酵后期，隨著白酒釀造的進(jìn)行,乳酸菌成為后期的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)微生物，L.jinshani數(shù)量得到大量增長(zhǎng)，但關(guān)于L.jinshani的具體代謝功能與價(jià)值還未得到充分研究，其在白酒發(fā)酵過(guò)程中所起到的作用還有待發(fā)掘。目前對(duì)L.jinshani的定性定量檢測(cè)方法的研究報(bào)道較少，因此本研究所建立的能夠快速檢測(cè)酒醅中L.jinshani的方法對(duì)研究其在白酒釀造過(guò)程中的具體功能與價(jià)值具有重要意義。

本研究通過(guò)設(shè)計(jì)L.jinshani的特異性引物F:5′-TGCCACAAGGCTATCACCTC-3′；R:5′-AACTCTTGGCTTCGCTGACG-3′建立了q-PCR的方法對(duì)L.jinshani進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果表明該方法靈敏度高，特異性好，能夠方便快捷地定量檢測(cè)對(duì)樣品中L.jinshani?？捎行?yīng)用于白酒釀造過(guò)程中的L.jinshani的定量與定性檢測(cè)，為進(jìn)一步揭示白酒功能菌株L.jinshani在釀酒過(guò)程中的功能提供了有效方法。