強(qiáng)化乳酸菌釀造高酸黃酒工藝研究

錢(qián)楨文，吳宗文，吳殿輝，魯振東，謝廣發(fā),3*，胡志明，裘哲靈，毛青鐘

1(浙江樹(shù)人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州，310015)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 3(浙江樹(shù)人大學(xué) 紹興黃酒學(xué)院，浙江 紹興，312028)4(紹興女兒紅釀酒有限公司，浙江 紹興，312352) 5(浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江 紹興，312000)6(會(huì)稽山紹興酒股份有限公司，浙江 紹興，312000)

低度黃酒的酒精度一般為8.0%vol～12.5%vol，適合年輕一代消費(fèi)者的口味喜好[1]，近年來(lái)得到迅速發(fā)展。目前低度黃酒生產(chǎn)工藝主要有原酒稀釋法和醪液稀釋發(fā)酵法2種[2-3]，由于醪液稀釋發(fā)酵法釀造的低度黃酒在壇中貯存容易污染微生物導(dǎo)致酸敗變質(zhì)[1,4]，因此目前大多數(shù)廠家采用原酒稀釋法生產(chǎn)低度黃酒，即先釀成酒精度較高的黃酒，然后加水稀釋。但加水稀釋后總酸較低，而酸類物質(zhì)是黃酒的重要口味物質(zhì)，總酸低的黃酒口感淡薄[5]。為解決該問(wèn)題，在實(shí)際生產(chǎn)中通常采用添加貯存或發(fā)酵過(guò)程中酸敗黃酒樣來(lái)提高總酸。但有的酸敗黃酒有異氣異味，且酸敗黃酒的生物胺含量遠(yuǎn)高于正常釀造的黃酒[6]。生物胺具有一定的生理副作用，是引起黃酒飲后不適癥狀的主要成分之一[7-8]。

乳酸菌(lactic acid bacteria)是參與黃酒發(fā)酵的重要微生物之一，浸米和發(fā)酵過(guò)程都離不開(kāi)乳酸菌[9-10]。乳酸菌產(chǎn)酸可以為黃酒醪液提供酸性發(fā)酵環(huán)境，抑制其他雜菌生長(zhǎng)。在黃酒釀造中，通過(guò)接種乳酸菌浸米能消除浸米環(huán)節(jié)的異嗅味，改善浸米品質(zhì)，大幅降低米漿水中生物胺含量[11-12]。此外，生物強(qiáng)化技術(shù)被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的釀造中，ZHANG等[13]通過(guò)強(qiáng)化曼舒里畢赤酵母(Pichiamanshurica)發(fā)酵山西老陳醋大曲，提高了醋中總酸和總酯含量；WANG等[14]在醋酸發(fā)酵開(kāi)始時(shí)接種巴斯德醋酸桿菌(Acetobacterpasteurianus)，增加了鎮(zhèn)江香醋的風(fēng)味，縮短了醋酸發(fā)酵周期，同時(shí)提高了總酸和2,3-丁二醇的含量；王曉勇[15]通過(guò)接種酵母菌和醋酸菌強(qiáng)化大曲生產(chǎn)汾酒醋酸調(diào)味酒，使汾酒的香氣成分更加豐富，風(fēng)味更加協(xié)調(diào)。為改善低度黃酒生產(chǎn)中由酸敗黃酒調(diào)酸引起的異氣異味和生物胺問(wèn)題，提高低度黃酒品質(zhì)和安全水平，本研究采用前期篩選的1株低產(chǎn)生物胺、高產(chǎn)乳酸的乳酸菌進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵，以期釀造出酸度高且能較好地保持黃酒風(fēng)味的調(diào)酸用高酸黃酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CGMCC No.12757，從黃酒發(fā)酵醪液中篩選得到，該菌產(chǎn)酸能力較強(qiáng)且低產(chǎn)生物胺；工業(yè)黃酒酵母(Saccharomycescerevisiae)N85，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

糯米、麥曲，浙江古越龍山紹興酒股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜，美國(guó)Agilent公司；QP2010Ultra GS/MS氣質(zhì)聯(lián)用儀，日本Shimadzu公司；PHS-3E pH計(jì)，瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酵母和乳酸菌培養(yǎng)

米汁的制備：糯米浸泡2 d，蒸飯，按100 g糯米飯質(zhì)量加入300 mL水、5 g熟麥曲和10 000 U糖化酶，于55～60 ℃下糖化5 h，稠袋過(guò)濾，調(diào)整糖度為12 °Bx，分裝后于115 ℃滅菌20 min。

培養(yǎng)方法：將酵母和乳酸菌種子液分別接種于米汁中，接種量為10%，酵母于30 ℃下振蕩培養(yǎng)12 h，乳酸菌于37 ℃下靜止培養(yǎng)12 h。

1.3.2 黃酒釀造實(shí)驗(yàn)

配方∶m(糯米)∶m(水)=1∶1.7、酵母培養(yǎng)液5%、乳酸菌培養(yǎng)液2%、麥曲用量17%；工藝參數(shù)：浸米時(shí)間2 d，前發(fā)酵(主酵)在30 ℃下發(fā)酵4 d，后發(fā)酵在15 ℃下發(fā)酵15 d。黃酒釀造工藝流程如下：

1.3.3 高酸黃酒釀造單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 乳酸菌接入時(shí)間對(duì)黃酒總酸的影響

其他因素不變，乳酸菌接種時(shí)間分別設(shè)定為0、1、2、3、4 d進(jìn)行黃酒釀造實(shí)驗(yàn)，并以不接乳酸菌的黃酒發(fā)酵作為空白對(duì)照。

1.3.3.2 麥曲添加量對(duì)黃酒總酸的影響

其他因素不變，麥曲添加量分別設(shè)定為10%、14%、17%、20%、23%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))進(jìn)行黃酒釀酒實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化高酸黃酒釀造工藝

以釀制黃酒的總酸和酒精度為指標(biāo)，選取乳酸菌接種量、料水比和主酵溫度作為實(shí)驗(yàn)因素，按照DPS9.5 軟件設(shè)計(jì)3因素8水平均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 黃酒常規(guī)理化指標(biāo)的測(cè)定

發(fā)酵液中酒精度、總酸、pH、氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定方法參考GB/T 13662—2018 《黃酒》。

1.3.6 黃酒中有機(jī)酸含量的測(cè)定

前處理：取10 mL樣品于100 mL容量瓶中，加入2 mL 30%硫酸鋅溶液和2 mL 15%亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，用超純水定容，靜置30 min，用濾紙過(guò)濾，再經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾后用于HPLC分析。

色譜條件：參考文獻(xiàn)[16]并稍作改動(dòng)，色譜柱為Waters Atlantis T3d C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，流動(dòng)相20 mmol/L NaH2PO4(用磷酸調(diào)pH至2.7)，進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

1.3.7 黃酒中生物胺含量的測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定黃酒中生物胺含量[17]。

1.3.8 黃酒游離氨基酸含量的測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定黃酒中16種游離氨基酸含量[18]。

1.3.9 黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的測(cè)定[19-20]

頂空固相微萃取條件：黃酒樣品先經(jīng)3 000 r/min離心20 min，取2 mL上清液，加入4 mL純凈水，2.5 g氯化鈉，10 μL內(nèi)標(biāo)物(2-辛醇，89.65 mg/L)，萃取溫度50 ℃，預(yù)熱15 min，萃取時(shí)間40 min，GC解吸5 min(250 ℃)。

GC-MS條件：色譜柱型號(hào)DB-Wax毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱初始溫度40 ℃保持5 min，以5 ℃/min上升至150 ℃，再以10 ℃/min上升至230 ℃，然后保持10 min。載氣為高純度氦氣，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣。MS接口溫度為230 ℃，電子轟擊離子源，掃描范圍(m/z)為30～550 amu，電子能量為70 eV，離子源溫度為210 ℃。

以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行半定量。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 25進(jìn)行，每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化黃酒釀造工藝

2.1.1 乳酸菌接種時(shí)間對(duì)黃酒發(fā)酵的影響

不同乳酸菌接種時(shí)間釀制黃酒的酒精度和總酸含量檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。在發(fā)酵1、2、3、4 d接入乳酸菌與未接入乳酸菌(對(duì)照)相比，黃酒的酒精度具有顯著差異，總酸略有提高，但差異不顯著。而在投料時(shí)(0 d)接種乳酸菌能顯著提高總酸含量，發(fā)酵結(jié)束時(shí)總酸達(dá)到11.9 g/L、酒精度為13.2%vol，與對(duì)照黃酒相比，總酸提高了190%、酒精度下降17.5%。在發(fā)酵1 d后接入乳酸菌，由于醪液中已有較高含量的酒精[21]，可能對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制，因而無(wú)法達(dá)到增酸效果。因此，選擇在投料時(shí)接種乳酸菌為最佳接種時(shí)間。

圖1 乳酸菌接種時(shí)間對(duì)黃酒酒精度和總酸含量的影響Fig.1 Effect of inoculation time of lactic acid bacteria on the contents of alcohol and total acid in Huangjiu

2.1.2 麥曲添加量對(duì)黃酒發(fā)酵的影響

麥曲在黃酒釀造過(guò)程中具有極其重要的作用，傳統(tǒng)黃酒釀造中麥曲的用量約為原料米的1/6[22-23]。麥曲添加量對(duì)黃酒發(fā)酵的影響如圖2所示，麥曲添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))從10%增加到17%時(shí)，黃酒的酒精度和總酸含量逐漸增加，而麥曲添加量從17%增加到23%時(shí)，黃酒的酒精度和總酸含量略有上升。較高的麥曲添加量會(huì)增加生產(chǎn)成本，而黃酒廠進(jìn)行常規(guī)黃酒釀造時(shí)，麥曲添加量一般為17%左右，故選擇麥曲添加量為17%。

圖2 麥曲添加量對(duì)黃酒酒精度和總酸含量的影響Fig.2 Effect of dosage of wheat Qu on the contents of alcohol and total acid in Huangjiu

2.2 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵工藝

以乳酸菌接種量(X1)、料水比(X2)和主酵溫度(X3)為優(yōu)化因素，利用DPS的優(yōu)化系統(tǒng)建立3因素8水平的均勻設(shè)計(jì)，所得設(shè)計(jì)方案的中心偏差較高(CD=0.102 4)，為此將實(shí)驗(yàn)次數(shù)由8次提高到16次，以降低試驗(yàn)的中心偏差(CD=0.078 4)，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果如表1所示。

以所釀黃酒的總酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用二次多項(xiàng)式逐步回歸分析方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得回歸方程Y=6.412 2+0.437 1X1+14.996 8X2-0.400 6X3-0.053 2X12-0.802 3X22+0.012 0X32-0.016 8X1X2-0.324 2X2X3+ 0.006 9X1X3，相關(guān)系數(shù)R=0.971 9，F(xiàn)值=11.41，顯著水平P= 0.003 9。由回歸方程得到最優(yōu)工藝參數(shù)為乳酸菌接種量5.3%、料水比1∶2.5(g∶mL)、前酵溫度24 ℃，總酸最高值為18.2 g/L。對(duì)得到的最優(yōu)工藝進(jìn)行驗(yàn)證：即以乳酸菌投料時(shí)加入、麥曲用量17%、乳酸菌接種量5.3%、料水比1∶2.5(g∶mL)、前酵溫度24 ℃ 的工藝進(jìn)行黃酒發(fā)酵試驗(yàn)，重復(fù)3次，對(duì)檢測(cè)結(jié)果取平均值。所釀黃酒的酒精度為12.5%vol、總酸達(dá)17.5 g/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)較吻合。高酸黃酒的總酸含量較高可以減少勾兌時(shí)的用量，而酒精度12.5%vol既能較好地保持黃酒風(fēng)味，又與低度黃酒的酒精度較為一致，方便勾調(diào)操作。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 1 Mixed-levels uniform experimental design and result

2.3 高酸黃酒的理化指標(biāo)、微理組分及風(fēng)味組分分析

2.3.1 常規(guī)理化指標(biāo)

高酸黃酒和對(duì)照黃酒的理化指標(biāo)見(jiàn)表2。與對(duì)照組黃酒相比，高酸黃酒的酒精度和氨基酸態(tài)氮含量分別降低了21.8%和27.9%，而總酸含量提高了326.8%。

表2 高酸黃酒和對(duì)照黃酒的理化指標(biāo)Table 2 Detection of physiochemical indexes in high-acidity Huangjiu and control Huangjiu

2.3.2 黃酒中主要有機(jī)酸含量

乳酸是黃酒中含量最高的有機(jī)酸，能給黃酒帶來(lái)醇厚感；乙酸是黃酒中的主要揮發(fā)性酸，其含量過(guò)高時(shí)會(huì)使黃酒產(chǎn)生不愉悅甚至酸敗氣味，而酸敗黃酒往往乙酸含量很高[24]。高酸黃酒和對(duì)照黃酒中主要有機(jī)酸含量見(jiàn)表3，與對(duì)照黃酒相比，高酸黃酒中乳酸和乙酸含量分別提高了397.2%和79.3%，乳酸與乙酸質(zhì)量比由1.7∶1提高至4.6∶1。因此，高酸黃酒用于低度黃酒生產(chǎn)中的調(diào)酸有利于改善產(chǎn)品風(fēng)味。

表3 高酸黃酒和對(duì)照黃酒中有機(jī)酸含量的檢測(cè)Table 3 Detection of the content organic acids in high-acidity Huangjiu and control Huangjiu

2.3.3 黃酒中生物胺含量

高酸黃酒和對(duì)照黃酒中生物胺含量見(jiàn)表4。與對(duì)照黃酒相比，高酸黃酒中3種生物胺總量下降34.3%，用于低度黃酒調(diào)酸可提高產(chǎn)品的安全性。生物胺主要通過(guò)微生物分泌的氨基酸脫羧酶作用于游離氨基酸產(chǎn)生的，一方面本研究所用乳酸菌為篩選的低產(chǎn)生物胺植物乳桿菌，另一方面在發(fā)酵初期接種乳酸菌，降低了黃酒發(fā)酵體系中的pH，抑制了雜菌的生長(zhǎng)，使所釀黃酒中生物胺含量低于常規(guī)黃酒[25-26]。

表4 高酸黃酒和對(duì)照黃酒的生物胺含量 單位：mg/L

2.3.4 黃酒中游離氨基酸含量

高酸黃酒和對(duì)照黃酒中游離氨基酸含量見(jiàn)表5。與對(duì)照黃酒相比，高酸黃酒中16種游離氨基酸含量下降43.4%。其原因可能是：一方面低pH抑制了麥曲中蛋白酶的活性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解不完全；另一方面乳酸菌生長(zhǎng)繁殖需要消耗氨基酸作為氮源。

2.3.5 黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量

高級(jí)醇是酒類重要的風(fēng)味物質(zhì)之一，但含量過(guò)高時(shí)易產(chǎn)生雜味和致醉[27-28]。與對(duì)照黃酒相比，高酸黃酒中高級(jí)醇總量下降35.3%(表6)，其中黃酒的主要高級(jí)醇——異戊醇和異丁醇分別降低了50.3%和58.9%。一方面可能由于強(qiáng)化乳酸菌使醪液中總酸含量提高，從而抑制了酵母代謝形成高級(jí)醇；另一方面可能由于采用較低的主酵溫度(24 ℃)所致[21]。酯類是黃酒最重要的香氣化合物，高酸黃酒中總酯含量較對(duì)照黃酒有所提高，可能由于高含量的有機(jī)酸促進(jìn)了酯化反應(yīng)。

表5 高酸黃酒和對(duì)照黃酒中游離氨基酸含量 單位：mg/L

表6 高酸黃酒和對(duì)照黃酒中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量 單位：mg/L

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化，得到強(qiáng)化乳酸菌釀造高酸黃酒的最佳工藝為乳酸菌投料時(shí)接種、接種量為5.3%、麥曲添加量為17%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、料水比為1∶2.5(g∶mL)、主酵溫度為24 ℃。在此條件下，釀制的高酸黃酒酒精度為12.5%vol，總酸含量高達(dá)17.5 g/L。與對(duì)照黃酒相比，高酸黃酒中總酸和乳酸含量分別提高326.8%和397.2%，3種生物胺含量下降34.5%，高級(jí)醇總量下降35.3%。因此，通過(guò)強(qiáng)化乳酸菌釀造高酸黃酒，用于低度黃酒生產(chǎn)的調(diào)酸能提高產(chǎn)品品質(zhì)和安全。該工藝與常規(guī)黃酒釀造工藝相比，除強(qiáng)化乳酸菌發(fā)酵、降低主酵溫度、提高料水比外，其他工藝條件基本不變，因而便于推廣應(yīng)用。