強化乳酸菌釀造高酸黃酒工藝研究

錢楨文，吳宗文，吳殿輝，魯振東，謝廣發(fā),3*，胡志明，裘哲靈，毛青鐘

1(浙江樹人大學 生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州，310015)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 3(浙江樹人大學 紹興黃酒學院，浙江 紹興，312028)4(紹興女兒紅釀酒有限公司，浙江 紹興，312352) 5(浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江 紹興，312000)6(會稽山紹興酒股份有限公司，浙江 紹興，312000)

低度黃酒的酒精度一般為8.0%vol～12.5%vol，適合年輕一代消費者的口味喜好[1]，近年來得到迅速發(fā)展。目前低度黃酒生產工藝主要有原酒稀釋法和醪液稀釋發(fā)酵法2種[2-3]，由于醪液稀釋發(fā)酵法釀造的低度黃酒在壇中貯存容易污染微生物導致酸敗變質[1,4]，因此目前大多數廠家采用原酒稀釋法生產低度黃酒，即先釀成酒精度較高的黃酒，然后加水稀釋。但加水稀釋后總酸較低，而酸類物質是黃酒的重要口味物質，總酸低的黃酒口感淡薄[5]。為解決該問題，在實際生產中通常采用添加貯存或發(fā)酵過程中酸敗黃酒樣來提高總酸。但有的酸敗黃酒有異氣異味，且酸敗黃酒的生物胺含量遠高于正常釀造的黃酒[6]。生物胺具有一定的生理副作用，是引起黃酒飲后不適癥狀的主要成分之一[7-8]。

乳酸菌(lactic acid bacteria)是參與黃酒發(fā)酵的重要微生物之一，浸米和發(fā)酵過程都離不開乳酸菌[9-10]。乳酸菌產酸可以為黃酒醪液提供酸性發(fā)酵環(huán)境，抑制其他雜菌生長。在黃酒釀造中，通過接種乳酸菌浸米能消除浸米環(huán)節(jié)的異嗅味，改善浸米品質，大幅降低米漿水中生物胺含量[11-12]。此外，生物強化技術被廣泛應用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的釀造中，ZHANG等[13]通過強化曼舒里畢赤酵母(Pichiamanshurica)發(fā)酵山西老陳醋大曲，提高了醋中總酸和總酯含量；WANG等[14]在醋酸發(fā)酵開始時接種巴斯德醋酸桿菌(Acetobacterpasteurianus)，增加了鎮(zhèn)江香醋的風味，縮短了醋酸發(fā)酵周期，同時提高了總酸和2,3-丁二醇的含量；王曉勇[15]通過接種酵母菌和醋酸菌強化大曲生產汾酒醋酸調味酒，使汾酒的香氣成分更加豐富，風味更加協調。為改善低度黃酒生產中由酸敗黃酒調酸引起的異氣異味和生物胺問題，提高低度黃酒品質和安全水平，本研究采用前期篩選的1株低產生物胺、高產乳酸的乳酸菌進行強化發(fā)酵，以期釀造出酸度高且能較好地保持黃酒風味的調酸用高酸黃酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌種

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CGMCC No.12757，從黃酒發(fā)酵醪液中篩選得到，該菌產酸能力較強且低產生物胺；工業(yè)黃酒酵母(Saccharomycescerevisiae)N85，由本實驗室保藏。

1.1.2 實驗材料

糯米、麥曲，浙江古越龍山紹興酒股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜，美國Agilent公司；QP2010Ultra GS/MS氣質聯用儀，日本Shimadzu公司；PHS-3E pH計，瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母和乳酸菌培養(yǎng)

米汁的制備：糯米浸泡2 d，蒸飯，按100 g糯米飯質量加入300 mL水、5 g熟麥曲和10 000 U糖化酶，于55～60 ℃下糖化5 h，稠袋過濾，調整糖度為12 °Bx，分裝后于115 ℃滅菌20 min。

培養(yǎng)方法：將酵母和乳酸菌種子液分別接種于米汁中，接種量為10%，酵母于30 ℃下振蕩培養(yǎng)12 h，乳酸菌于37 ℃下靜止培養(yǎng)12 h。

1.3.2 黃酒釀造實驗

配方∶m(糯米)∶m(水)=1∶1.7、酵母培養(yǎng)液5%、乳酸菌培養(yǎng)液2%、麥曲用量17%；工藝參數：浸米時間2 d，前發(fā)酵(主酵)在30 ℃下發(fā)酵4 d，后發(fā)酵在15 ℃下發(fā)酵15 d。黃酒釀造工藝流程如下：

1.3.3 高酸黃酒釀造單因素試驗

1.3.3.1 乳酸菌接入時間對黃酒總酸的影響

其他因素不變，乳酸菌接種時間分別設定為0、1、2、3、4 d進行黃酒釀造實驗，并以不接乳酸菌的黃酒發(fā)酵作為空白對照。

1.3.3.2 麥曲添加量對黃酒總酸的影響

其他因素不變，麥曲添加量分別設定為10%、14%、17%、20%、23%(質量分數)進行黃酒釀酒實驗。

1.3.4 均勻設計優(yōu)化高酸黃酒釀造工藝

以釀制黃酒的總酸和酒精度為指標，選取乳酸菌接種量、料水比和主酵溫度作為實驗因素，按照DPS9.5 軟件設計3因素8水平均勻設計表進行實驗。

1.3.5 黃酒常規(guī)理化指標的測定

發(fā)酵液中酒精度、總酸、pH、氨基酸態(tài)氮含量的測定方法參考GB/T 13662—2018 《黃酒》。

1.3.6 黃酒中有機酸含量的測定

前處理：取10 mL樣品于100 mL容量瓶中，加入2 mL 30%硫酸鋅溶液和2 mL 15%亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，用超純水定容，靜置30 min，用濾紙過濾，再經0.22 μm膜過濾后用于HPLC分析。

色譜條件：參考文獻[16]并稍作改動，色譜柱為Waters Atlantis T3d C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，流動相20 mmol/L NaH2PO4(用磷酸調pH至2.7)，進樣量20 μL，流速1 mL/min，檢測波長210 nm。

1.3.7 黃酒中生物胺含量的測定

采用HPLC法測定黃酒中生物胺含量[17]。

1.3.8 黃酒游離氨基酸含量的測定

采用HPLC法測定黃酒中16種游離氨基酸含量[18]。

1.3.9 黃酒揮發(fā)性風味物質含量的測定[19-20]

頂空固相微萃取條件：黃酒樣品先經3 000 r/min離心20 min，取2 mL上清液，加入4 mL純凈水，2.5 g氯化鈉，10 μL內標物(2-辛醇，89.65 mg/L)，萃取溫度50 ℃，預熱15 min，萃取時間40 min，GC解吸5 min(250 ℃)。

GC-MS條件：色譜柱型號DB-Wax毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱初始溫度40 ℃保持5 min，以5 ℃/min上升至150 ℃，再以10 ℃/min上升至230 ℃，然后保持10 min。載氣為高純度氦氣，流速1.0 mL/min，進樣口溫度為250 ℃，進樣方式為不分流進樣。MS接口溫度為230 ℃，電子轟擊離子源，掃描范圍(m/z)為30～550 amu，電子能量為70 eV，離子源溫度為210 ℃。

以2-辛醇為內標進行半定量。

1.3.10 數據分析

數據分析采用 SPSS 25進行，每個試驗均重復3次，數據以平均值±標準偏差表示，并進行單因素方差分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗優(yōu)化黃酒釀造工藝

2.1.1 乳酸菌接種時間對黃酒發(fā)酵的影響

不同乳酸菌接種時間釀制黃酒的酒精度和總酸含量檢測結果如圖1所示。在發(fā)酵1、2、3、4 d接入乳酸菌與未接入乳酸菌(對照)相比，黃酒的酒精度具有顯著差異，總酸略有提高，但差異不顯著。而在投料時(0 d)接種乳酸菌能顯著提高總酸含量，發(fā)酵結束時總酸達到11.9 g/L、酒精度為13.2%vol，與對照黃酒相比，總酸提高了190%、酒精度下降17.5%。在發(fā)酵1 d后接入乳酸菌，由于醪液中已有較高含量的酒精[21]，可能對乳酸菌的生長產生抑制，因而無法達到增酸效果。因此，選擇在投料時接種乳酸菌為最佳接種時間。

圖1 乳酸菌接種時間對黃酒酒精度和總酸含量的影響Fig.1 Effect of inoculation time of lactic acid bacteria on the contents of alcohol and total acid in Huangjiu

2.1.2 麥曲添加量對黃酒發(fā)酵的影響

麥曲在黃酒釀造過程中具有極其重要的作用，傳統(tǒng)黃酒釀造中麥曲的用量約為原料米的1/6[22-23]。麥曲添加量對黃酒發(fā)酵的影響如圖2所示，麥曲添加量(質量分數)從10%增加到17%時，黃酒的酒精度和總酸含量逐漸增加，而麥曲添加量從17%增加到23%時，黃酒的酒精度和總酸含量略有上升。較高的麥曲添加量會增加生產成本，而黃酒廠進行常規(guī)黃酒釀造時，麥曲添加量一般為17%左右，故選擇麥曲添加量為17%。

圖2 麥曲添加量對黃酒酒精度和總酸含量的影響Fig.2 Effect of dosage of wheat Qu on the contents of alcohol and total acid in Huangjiu

2.2 均勻設計優(yōu)化發(fā)酵工藝

以乳酸菌接種量(X1)、料水比(X2)和主酵溫度(X3)為優(yōu)化因素，利用DPS的優(yōu)化系統(tǒng)建立3因素8水平的均勻設計，所得設計方案的中心偏差較高(CD=0.102 4)，為此將實驗次數由8次提高到16次，以降低試驗的中心偏差(CD=0.078 4)，實驗方案及結果如表1所示。

以所釀黃酒的總酸含量為評價指標，采用二次多項式逐步回歸分析方法對實驗結果進行分析，得回歸方程Y=6.412 2+0.437 1X1+14.996 8X2-0.400 6X3-0.053 2X12-0.802 3X22+0.012 0X32-0.016 8X1X2-0.324 2X2X3+ 0.006 9X1X3，相關系數R=0.971 9，F值=11.41，顯著水平P= 0.003 9。由回歸方程得到最優(yōu)工藝參數為乳酸菌接種量5.3%、料水比1∶2.5(g∶mL)、前酵溫度24 ℃，總酸最高值為18.2 g/L。對得到的最優(yōu)工藝進行驗證：即以乳酸菌投料時加入、麥曲用量17%、乳酸菌接種量5.3%、料水比1∶2.5(g∶mL)、前酵溫度24 ℃ 的工藝進行黃酒發(fā)酵試驗，重復3次，對檢測結果取平均值。所釀黃酒的酒精度為12.5%vol、總酸達17.5 g/L，實驗結果與模型預測較吻合。高酸黃酒的總酸含量較高可以減少勾兌時的用量，而酒精度12.5%vol既能較好地保持黃酒風味，又與低度黃酒的酒精度較為一致，方便勾調操作。

表1 實驗設計方案及結果Table 1 Mixed-levels uniform experimental design and result

2.3 高酸黃酒的理化指標、微理組分及風味組分分析

2.3.1 常規(guī)理化指標

高酸黃酒和對照黃酒的理化指標見表2。與對照組黃酒相比，高酸黃酒的酒精度和氨基酸態(tài)氮含量分別降低了21.8%和27.9%，而總酸含量提高了326.8%。

表2 高酸黃酒和對照黃酒的理化指標Table 2 Detection of physiochemical indexes in high-acidity Huangjiu and control Huangjiu

2.3.2 黃酒中主要有機酸含量

乳酸是黃酒中含量最高的有機酸，能給黃酒帶來醇厚感；乙酸是黃酒中的主要揮發(fā)性酸，其含量過高時會使黃酒產生不愉悅甚至酸敗氣味，而酸敗黃酒往往乙酸含量很高[24]。高酸黃酒和對照黃酒中主要有機酸含量見表3，與對照黃酒相比，高酸黃酒中乳酸和乙酸含量分別提高了397.2%和79.3%，乳酸與乙酸質量比由1.7∶1提高至4.6∶1。因此，高酸黃酒用于低度黃酒生產中的調酸有利于改善產品風味。

表3 高酸黃酒和對照黃酒中有機酸含量的檢測Table 3 Detection of the content organic acids in high-acidity Huangjiu and control Huangjiu

2.3.3 黃酒中生物胺含量

高酸黃酒和對照黃酒中生物胺含量見表4。與對照黃酒相比，高酸黃酒中3種生物胺總量下降34.3%，用于低度黃酒調酸可提高產品的安全性。生物胺主要通過微生物分泌的氨基酸脫羧酶作用于游離氨基酸產生的，一方面本研究所用乳酸菌為篩選的低產生物胺植物乳桿菌，另一方面在發(fā)酵初期接種乳酸菌，降低了黃酒發(fā)酵體系中的pH，抑制了雜菌的生長，使所釀黃酒中生物胺含量低于常規(guī)黃酒[25-26]。

表4 高酸黃酒和對照黃酒的生物胺含量 單位：mg/L

2.3.4 黃酒中游離氨基酸含量

高酸黃酒和對照黃酒中游離氨基酸含量見表5。與對照黃酒相比，高酸黃酒中16種游離氨基酸含量下降43.4%。其原因可能是：一方面低pH抑制了麥曲中蛋白酶的活性，導致蛋白質的降解不完全；另一方面乳酸菌生長繁殖需要消耗氨基酸作為氮源。

2.3.5 黃酒中揮發(fā)性風味物質含量

高級醇是酒類重要的風味物質之一，但含量過高時易產生雜味和致醉[27-28]。與對照黃酒相比，高酸黃酒中高級醇總量下降35.3%(表6)，其中黃酒的主要高級醇——異戊醇和異丁醇分別降低了50.3%和58.9%。一方面可能由于強化乳酸菌使醪液中總酸含量提高，從而抑制了酵母代謝形成高級醇；另一方面可能由于采用較低的主酵溫度(24 ℃)所致[21]。酯類是黃酒最重要的香氣化合物，高酸黃酒中總酯含量較對照黃酒有所提高，可能由于高含量的有機酸促進了酯化反應。

表5 高酸黃酒和對照黃酒中游離氨基酸含量 單位：mg/L

表6 高酸黃酒和對照黃酒中主要揮發(fā)性風味物質含量 單位：mg/L

3 結論

通過單因素試驗和均勻實驗設計優(yōu)化，得到強化乳酸菌釀造高酸黃酒的最佳工藝為乳酸菌投料時接種、接種量為5.3%、麥曲添加量為17%(質量分數)、料水比為1∶2.5(g∶mL)、主酵溫度為24 ℃。在此條件下，釀制的高酸黃酒酒精度為12.5%vol，總酸含量高達17.5 g/L。與對照黃酒相比，高酸黃酒中總酸和乳酸含量分別提高326.8%和397.2%，3種生物胺含量下降34.5%，高級醇總量下降35.3%。因此，通過強化乳酸菌釀造高酸黃酒，用于低度黃酒生產的調酸能提高產品品質和安全。該工藝與常規(guī)黃酒釀造工藝相比，除強化乳酸菌發(fā)酵、降低主酵溫度、提高料水比外，其他工藝條件基本不變，因而便于推廣應用。