上海市市售低溫酸奶中細(xì)菌多樣性的初步研究

鄭鈺倩，喻勇新,2*，趙海霞，唐笑，張華青，陳姝

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，上海，201306)

酸奶作為乳制品中重要的成員，以其獨(dú)特的風(fēng)味、極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值倍受人們青睞。酸奶不但口感美味，而且具有促進(jìn)消化吸收、維護(hù)腸道健康的功能。隨著酸奶生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大、加工生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)鏈的不正規(guī)化、低質(zhì)量奶源等原因，導(dǎo)致酸奶中存在一些有害細(xì)菌，使消費(fèi)者食用后產(chǎn)生不良反應(yīng)，如腹痛、腹瀉甚至中毒。GB 19302—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》中對(duì)大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、酵母和霉菌進(jìn)行了限量規(guī)定?；诂F(xiàn)有的研究，我們發(fā)現(xiàn)存在于酸奶中并可能帶來(lái)一定危害的細(xì)菌主要有黃色葡萄球菌、布魯氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特氏菌等[1]。部分細(xì)菌在國(guó)標(biāo)中并沒(méi)有明確的規(guī)定，對(duì)酸奶食用安全性造成的影響不得而知，因此酸奶的安全問(wèn)題值得引起乳制品相關(guān)行業(yè)的高度重視。

常見(jiàn)的酸奶分為自然發(fā)酵和商品化酸奶兩種。自然發(fā)酵的酸奶與市售的商品化酸奶在加工方面存在著一定的差異。研究發(fā)現(xiàn)南疆地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌群，其中乳桿菌屬、鏈球菌屬、醋酸桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬、芽孢桿菌屬的含量較多[2]。自然發(fā)酵的酸奶通常是牧民(如青藏高原地區(qū))采用傳統(tǒng)而古老的發(fā)酵方法制作的，能夠產(chǎn)生大量?jī)?yōu)良的乳酸菌，具有降低膽固醇、抗氧化等保健功能，但自然發(fā)酵的酸奶中存在較多發(fā)酵菌種外的細(xì)菌。市售酸奶為商品化酸奶，通常采用工廠化加工進(jìn)行大批量生產(chǎn)，上市前對(duì)酸奶進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。一般而言，商業(yè)化酸奶的發(fā)酵時(shí)間相對(duì)較短，乳酸菌活菌數(shù)較多，后酸化作用較弱，但穩(wěn)定性較高。

目前有很多檢測(cè)乳制品中細(xì)菌的方法，例如平板培養(yǎng)法、核酸探針?lè)?、PCR技術(shù)[3]等，這些技術(shù)具有簡(jiǎn)單、易于操作等特點(diǎn)，但當(dāng)不同菌落混雜在一起時(shí)，很難同時(shí)進(jìn)行定性定量的檢測(cè)，且存在一些缺點(diǎn)如周期長(zhǎng)、易受人為因素干擾等[4]。MiSeq系統(tǒng)是一種高端測(cè)序系統(tǒng)，可以同時(shí)進(jìn)行合成與測(cè)序操作。隨著Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)的不斷完善、發(fā)展，現(xiàn)已成功應(yīng)用在多個(gè)方面，如朱瀟等[5]利用該技術(shù)分析牦牛發(fā)酵乳制品中細(xì)菌菌群多樣性；盧圣鄂等[6]將該技術(shù)用于分析土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性。本研究采用宏基因組測(cè)序法，對(duì)酸奶樣品進(jìn)行細(xì)菌采集測(cè)序，檢測(cè)出酸奶中可能存在的細(xì)菌，并進(jìn)行分類分析，從原料乳、加工生產(chǎn)及包裝運(yùn)輸3個(gè)方面分析可能來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材料

酸奶樣品于2021年3月2日購(gòu)于上海泥城大潤(rùn)發(fā)超市冷藏酸奶專區(qū)(0～4 ℃)。如表1所示，一共為16份樣品，包括國(guó)內(nèi)8種知名品牌的酸奶A、B、C、D、E、F、G、H，以及A品牌不同系列的酸奶樣品8份(A1～A8)，其中A與A5為平行對(duì)照樣品。全程保證冷鏈保藏，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室于0～4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 酸奶樣品Table 1 Yogurt samples

1.2 儀器與設(shè)備

FastPre-24 MP型組織均質(zhì)器，美國(guó)MP Biomedicals公司；#DP328型糞便基因組DNA試劑盒，天根生化有限科技公司；SLFPTAD多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰Biotek儀器有限公司；PowerPac HC電泳儀，上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；5331PCR儀，美國(guó)Biometra公司；22331Eppendorf AG離心機(jī)，德國(guó)Hamburg公司；DW-40L508醫(yī)用低溫保存箱、HYC-290醫(yī)用冷藏箱，青島Haier特種電器有限公司；Illumina MiSeq PE300測(cè)序儀，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

用FastPre-24 MP組織均質(zhì)器將樣品進(jìn)行均質(zhì)混勻，用移液槍吸取200 μL樣品于EP離心管中備用。

1.3.2 樣品基因組DNA提取

樣品基因組DNA提取采用糞便基因組DNA試劑盒，具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書。

1.3.3 基因組DNA濃度及純度的檢測(cè)

通過(guò)酶標(biāo)儀對(duì)樣品的DNA濃度以及純度進(jìn)行測(cè)定分析?；蚪MDNA的完整性通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.3.4 細(xì)菌的16S rRNA V3～V4區(qū)PCR擴(kuò)增

以總DNA為模板利用細(xì)菌16S rRNA引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[7]實(shí)現(xiàn)V3～V4可變區(qū)的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 3 min，35個(gè)循環(huán)(94 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min)。擴(kuò)增體系為50 μL，25 μL Premix Tap，2 μL dNTPs，4 μL引物(5 mol/L)，1 μL DNA模板，18 μL滅菌蒸餾水。

1.3.5 Illumina Miseq 測(cè)序

將PCR擴(kuò)增子產(chǎn)物在MiSeqPE300平臺(tái)上進(jìn)行雙端測(cè)序。美吉平臺(tái)MiSeq測(cè)序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，首先用QIIME(v1.9.1)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理獲得合格的reads，根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)的reads拼接成1條序列，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向，即為優(yōu)化數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

樣品數(shù)據(jù)采用稀釋曲線分析、可操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)分析以及β多樣性分析，運(yùn)用Excel繪制OTU水平上樣本菌群分布群落Bar圖，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件 Geneious Prime(v2021.1.1)進(jìn)行細(xì)菌序列的比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品16S rRNA V3～V4區(qū)擴(kuò)增電泳結(jié)果

酸奶樣品總DNA經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)后，濃度均在10～15 ng/μL，且OD260/OD280均在1.8～2.0，表明DNA純度較高。圖1為樣品16S rRNA V3～V4區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析結(jié)果，選用100 bp ladder為Marker。16個(gè)樣品在目標(biāo)產(chǎn)物區(qū)域均出現(xiàn)明顯的條帶，而陰性對(duì)照無(wú)條帶，說(shuō)明酸奶樣品中存在細(xì)菌。此外16個(gè)樣品的電泳條帶均勻單一，表明PCR擴(kuò)增成功，可以進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序。

M-marker圖1 16S rRNA V3～V4區(qū)PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳Fig.1 The agarose gel electrophoresis of PCR products from V3～V4 region of 16S rRNA注：N1、N2分別為提取DNA時(shí)采用的陰性對(duì)照和PCR擴(kuò)增時(shí)采用的陰性對(duì)照

2.2 稀釋曲線

圖2為樣品OTU稀釋曲線，反映群落豐富度的指數(shù)有Sobs、Chao、Ace、Jack、Bootstrap等，其中Sobs描述豐富度實(shí)際觀測(cè)值，更能直觀體現(xiàn)本研究樣品的豐富度，因此采用的多樣性指數(shù)為Sobs。由圖2可知，隨著測(cè)序深度增加，曲線趨于平坦，更多的測(cè)序量并不會(huì)產(chǎn)生更多的物種。表明測(cè)序深度合理，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

圖2 稀釋曲線Fig.2 Rarefraction curve

2.3 OTU分類

按照序列間相似度97%為閾值對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類，去除嵌合體，測(cè)序結(jié)果顯示，酸奶樣品中的細(xì)菌一共包含16個(gè)OTU序列。根據(jù)分類學(xué)分析各分類水平(域、界、門、綱、目、科、屬、種、OTU)上的物種組成情況，如表2所示。OTU水平上樣本菌群分布群落條形圖如圖3所示。

2.3.1 發(fā)酵菌種

本研究采集的樣品共鑒定出9種發(fā)酵菌種，包括OTU1(Streptococcusthermophiles)、OTU2(Bifidobacteriumanimalissubsp.Lactis)、OTU3(unculturedStreptococcus)、OTU4(Lactococcuslactis)、OTU5(Lactobacillusacidophilus)、OTU6(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus)、OTU9(Bifidobacteriumlongumsubsp.Infantis)、OTU13(Lactococcuspiscium)和OTU14(Lactiplantibacillusplantarum)。

根據(jù)調(diào)查顯示，市面上采用的發(fā)酵菌種大多為乳酸菌，乳酸菌包括嗜熱鏈球菌屬、雙歧桿菌屬，乳酸球桿菌屬、乳酸鏈球菌屬、保加利亞乳桿菌屬、嗜酸桿菌等，不同型號(hào)的酸奶根據(jù)需求對(duì)發(fā)酵菌種進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。在所有樣品中均檢測(cè)到了嗜熱鏈球菌，且在各樣品中最為豐富。

2.3.2 污染菌

此外，鑒定出4種污染細(xì)菌，即OTU7(Anoxybacillusflavithermus)、OTU10(Acinetobacterbaumannii)、OTU11(Enterobactersp.)和OTU15(Arthrobactersp.)。

其中OTU10和OTU11可能為條件致病菌，由圖3-b可知，OTU10主要存在于D和F樣品中，而OTU11存在于F和A3樣品中。鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，可引起免疫缺陷宿主的機(jī)會(huì)性感染，感染后具有很高的死亡率。大腸桿菌為腸桿菌屬中主要的細(xì)菌，大腸桿菌的分布廣泛，在各種動(dòng)物和食物中較容易被檢出，大多不會(huì)引發(fā)疾病，但一些特殊血清的大腸桿菌具有一定的致病性。

OTU7和OTU15可能造成酸奶的腐敗變質(zhì)。OTU15少量存在于A1與A3中，OTU7在樣品A、D和A3中豐度較高。節(jié)桿菌屬是最常見(jiàn)的分離細(xì)菌，常見(jiàn)于土壤和被工業(yè)化學(xué)品和放射性材料污染的環(huán)境中[8]。OTU7是常見(jiàn)的腐敗微生物之一，研究表明產(chǎn)芽孢嗜熱細(xì)菌屬的地桿菌和無(wú)氧桿菌是乳品工業(yè)中常見(jiàn)的污染物[9]。此外，OTU12的序列沒(méi)有檢索到可信度更高的物種信息，可能為不可培養(yǎng)的污染菌，在A8中豐度較高，在G、A2和A4中少量存在。

除了這些細(xì)菌之外，OTU8與OTU16不是細(xì)菌序列，而是屬于植物界中的李屬，從圖3-b可知，這兩種均出現(xiàn)在A2樣品中，該樣品為黃桃果粒風(fēng)味發(fā)酵乳，推斷它們是由酸奶中的黃桃果醬等輔料帶入的。

2.4 主成分分析

圖4為主成分分析(principal component analysis，PCA)，通過(guò)比較不同樣本中細(xì)菌群落的組成來(lái)反映酸奶樣本間的差異，樣本物種組成越相似，其在PCA圖中的距離越近。A與A5為平行酸奶樣品，從圖4可知，兩者的測(cè)序結(jié)果基本一致；而不同品牌的酸奶樣品之間差異較大，尤其是B樣品。B樣品中含有大量的OTU2，故與其他樣品產(chǎn)生了較大的差異。

表2 OTU序列物種分類Table 2 The classification of species represented by OTU

圖3 基于屬水平15個(gè)OTU的菌種組成分析Fig.3 Bacterial composition analysis based on 15 OTU at the genus level注：由于OTU1相較于其他16種OTU來(lái)說(shuō)數(shù)量過(guò)大，無(wú)法顯著呈現(xiàn)出其他物種的豐富度。因此圖3將OTU1去掉，為充分呈現(xiàn)出樣品之間的物種豐富度差異

圖4 不同酸奶樣品細(xì)菌菌群的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of bacterial community of different yogurt samples

2.4.1 不同品牌酸奶

樣品A、B、C、D、E、F、G和H分別來(lái)自8個(gè)不同品牌，這8種樣品均為以生牛乳為原料，不添加其他成分的原味風(fēng)味發(fā)酵乳。結(jié)果表明，B、C、E、G和H品牌酸奶中沒(méi)有背景細(xì)菌(即酸奶中除了人為添加的發(fā)酵菌種以外的細(xì)菌統(tǒng)稱為背景細(xì)菌)，可初步判斷為安全性較高的酸奶。而在A、D和F樣品中，A存在較多的OTU7；D相較于A樣品，除了含有OTU7之外，還存在較多OTU10；F主要存在OTU10。

由結(jié)果可知，這8個(gè)品牌的酸奶品質(zhì)并不相同，存在品牌之間的差異。所產(chǎn)生的差異可能是由于發(fā)酵劑、生產(chǎn)工藝等因素不同所致。

2.4.2 同種品牌不同型號(hào)酸奶

此外，對(duì)A品牌旗下的不同系列的酸奶樣品也進(jìn)行了研究。其中A2樣品為復(fù)原乳酸奶，且A2與A3樣品中均添加了黃桃果醬，其余均為原味發(fā)酵乳。結(jié)果表明，A6與A7中背景細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較少，A2、A4次之；A2中出現(xiàn)OTU8與OTU16兩種非細(xì)菌序列的污染物，可能是取樣時(shí)黃桃果醬偶然帶入所致；A3樣品中主要含有OTU11。A1、A5與A8均含有較多的OTU7。

結(jié)果表明同一品牌下的酸奶之間亦存在差異性。導(dǎo)致差異性的原因主要有3點(diǎn)：原料乳不同，分為生牛乳和復(fù)原乳兩種；發(fā)酵菌種不同；添加的輔料不同，添加果粒會(huì)對(duì)酸奶的菌群造成影響。

3 討論

3.1 商品化酸奶中發(fā)酵菌種的篩查

經(jīng)比對(duì)分析，部分樣品中的發(fā)酵菌與表1中標(biāo)簽所示完全一致，而部分樣品不完全一致。對(duì)此，分析有3點(diǎn)原因：其一，該商品化酸奶中實(shí)際添加的發(fā)酵菌種與標(biāo)簽不符。根據(jù)GB 7718—2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》，標(biāo)簽內(nèi)容需確保真實(shí)，因此標(biāo)簽所示發(fā)酵菌種均按要求添加；其二，樣品中均按標(biāo)簽添加了發(fā)酵菌種，但由于某些乳酸菌屬菌株之間的16S rRNA V3～V4區(qū)序列相似度較高，因此被歸類于同一OTU而沒(méi)有被區(qū)分開。經(jīng)生物信息學(xué)軟件Geneious Prime進(jìn)行序列比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬的各個(gè)菌種之間16S rRNA V3～V4區(qū)相似度較高，且該區(qū)域片段長(zhǎng)度有限(僅400～500 bp左右)，無(wú)法把某些菌種完全區(qū)分，因此某些乳酸菌種可能被歸類于乳桿菌屬；其三，某些發(fā)酵菌種添加量比較少，在后續(xù)加工和貯運(yùn)環(huán)節(jié)中菌株失活甚至DNA降解，故未完全被檢測(cè)出。

3.2 酸奶中背景細(xì)菌的溯源及防控

本研究是檢測(cè)酸奶樣品中細(xì)菌的DNA，因此不能區(qū)分菌株是否為存活的狀態(tài)，只能說(shuō)明背景細(xì)菌曾經(jīng)在酸奶中存在過(guò)。背景細(xì)菌的存在，可能導(dǎo)致一些潛在的風(fēng)險(xiǎn)，因此從以下3個(gè)方面對(duì)其進(jìn)行溯源分析。

(1)原料乳的質(zhì)量：影響原料乳質(zhì)量的因素包括奶牛乳房炎、奶牛飲食、養(yǎng)殖環(huán)境、擠奶過(guò)程及原奶的運(yùn)輸過(guò)程。我國(guó)導(dǎo)致奶牛乳房炎最主要細(xì)菌是金黃色葡萄球菌和鏈球菌，發(fā)病率高達(dá)80%[23]。原料乳中曾檢測(cè)到不動(dòng)桿菌屬，表明OTU10可能來(lái)自于患有乳房炎乳奶牛的原料乳中。此外，F(xiàn)ERNANDO等[24]從奶牛糞便存儲(chǔ)池和地表水中分離回收到鮑氏不動(dòng)桿菌，曹慧慧等[25]在奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)采集原料乳的環(huán)節(jié)檢測(cè)到不動(dòng)桿菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、棒狀桿菌屬等。這些環(huán)節(jié)均可導(dǎo)致OTU10、OTU11與OTU15混入。

(2)酸奶生產(chǎn)加工過(guò)程：酸奶的加工過(guò)程包括配料、預(yù)熱、均質(zhì)、殺菌、接種、發(fā)酵、攪拌、后熟以及包裝和運(yùn)輸，其中復(fù)原乳酸奶還包括奶粉生產(chǎn)加工過(guò)程。污染細(xì)菌可能來(lái)源于生產(chǎn)器械、加工人員、果醬輔料等。COLERI CIHAN等[26]相關(guān)研究表明，OTU7有形成生物膜的潛力使其殘存于加工器械上。

(3)包裝運(yùn)輸：包裝材料的質(zhì)量、包裝環(huán)境也會(huì)對(duì)酸奶質(zhì)量產(chǎn)生影響，對(duì)此可采用紫外滅菌等預(yù)處理保證其無(wú)菌狀態(tài)。酸奶大多采用冷鏈運(yùn)輸，若在運(yùn)輸過(guò)程中溫度控制不當(dāng)，可能會(huì)造成酸奶腐敗變質(zhì)。

3.3 與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比

在本研究中發(fā)現(xiàn)的7種背景細(xì)菌只有腸桿菌屬在國(guó)標(biāo)中有明確的規(guī)定，雖然本實(shí)驗(yàn)只對(duì)酸奶樣品中的細(xì)菌進(jìn)行定性分析，但在F和A3樣品中檢出腸桿菌，說(shuō)明商品化的酸奶樣品仍然存在潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，酸奶國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于細(xì)菌部分是基于培養(yǎng)方法進(jìn)行檢測(cè)的，大量不可培養(yǎng)的細(xì)菌無(wú)法有效檢出，因此測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的部分難以培養(yǎng)細(xì)菌也可能存在潛在的隱患。隨著現(xiàn)代高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，酸奶中微生物尤其是細(xì)菌的檢測(cè)和篩查有待進(jìn)一步的提高和完善。

4 結(jié)論

綜上所述，本文通過(guò)宏基因組測(cè)序法分析8個(gè)品牌16種低溫酸奶樣品中的細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)不同品牌和同一品牌的不同種類酸奶之間均存在顯著性差異。除了發(fā)酵劑中的乳酸菌之外，在商品化酸奶樣品中還發(fā)現(xiàn)了部分環(huán)境污染細(xì)菌，表明商品化酸奶在原料乳收集、加工生產(chǎn)和包裝運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)仍然存在受環(huán)境細(xì)菌污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)。本研究成果為商品化酸奶細(xì)菌群落研究和提高酸奶安全性提供一定的參考價(jià)值。