竹筒酒陳釀過程中礦質(zhì)元素變化規(guī)律研究

葉晨，張保，姚曦，荀航，湯鋒

(國際竹藤中心，國家林業(yè)和草原局/北京市共建竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100102)

竹筒酒是一種中國傳統(tǒng)含酒精飲料，已有1 800余年的飲用歷史，在傣族、客家族及土家族等少數(shù)民族聚居區(qū)尤其受歡迎[1]。近年來，竹筒酒消費(fèi)群體日益擴(kuò)大，已形成了一定的市場規(guī)模。其制作工藝是將基酒(白酒)注入活竹竹腔內(nèi)，經(jīng)過一段時(shí)間的陳釀，基酒的化學(xué)成分、顏色、口感和香氣等均發(fā)生顯著變化。通常成酒色如琥珀，自帶竹香，口感清甜[1]。研究表明，富含多種礦質(zhì)元素是竹筒酒突出的特征之一[2]。

酒中的礦質(zhì)元素主要來源于釀酒原料及各個(gè)環(huán)節(jié)的引入，礦質(zhì)元素種類及其含量不僅直接影響酒的顏色、口感等酒質(zhì)特征，還與酒的功效和營養(yǎng)密切相關(guān)[3-7]。白酒中金屬離子主要來自于貯酒器和加漿水，可作為乙醇代謝酶的活性中心和酶的激活劑，參與乙醇在人體的代謝過程；還會(huì)與醇、醛、酮、酸、酯等化合物結(jié)合形成大分子基團(tuán)，改變酒的風(fēng)味和口感等特征[3]。K離子能夠增加酒的甜醇感，Cu離子則能去除新酒氣，而Na、Zn、Fe、Mg等對酒的口感有不良影響[4]。發(fā)酵或陳釀過程，也影響酒中礦質(zhì)元素含量。葉萌祺等[8]發(fā)現(xiàn)，蘋果酒發(fā)酵過程中礦質(zhì)元素含量波動(dòng)較大。陶勇等[9]研究了劍南春不同窖齡窖泥的礦質(zhì)元素含量變化，發(fā)現(xiàn)Cu含量隨窖齡增加緩慢下降，其他元素變化不顯著。姜忠軍[10]研究發(fā)現(xiàn)白蘭地陳釀過程中K元素含量差別最大，可用K元素作為描述不同陳釀年份白蘭地特征的典型指標(biāo)。

陳晨等[2]采集市售竹筒酒樣品，檢測發(fā)現(xiàn)竹筒酒含有豐富的礦質(zhì)元素，K元素含量高達(dá)222.40～968.99 mg/L，并通過實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了竹筒酒中的K元素來源于竹稈。但是，竹筒酒中其他礦質(zhì)元素是來源于竹稈還是基酒？陳釀過程中，竹稈與基酒中礦質(zhì)元素如何變化？存在什么樣的交換規(guī)律以及竹葉黃酮是否影響礦質(zhì)元素的交換等問題，目前尚不清楚。

因此，本文參照典型竹筒酒生產(chǎn)方法，研究陳釀過程中，K、Ca、Na、Mg、Mn、Fe、Cu、Zn、Al、Se、Ni、As、Pb、Cd、Cr、Mo、Co 17種礦質(zhì)元素在竹稈與基酒中的交換規(guī)律；通過添加外源黃酮，研究竹葉黃酮對竹稈與基酒中礦質(zhì)元素轉(zhuǎn)移的影響，以期為制定竹筒酒標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)規(guī)程及產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

竹葉黃酮提取物，總黃酮含量為17.61%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，國際竹藤中心竹藤資源化學(xué)利用研究所提供；白酒，52%vol，四川不老譚酒業(yè)有限公司。

HNO3(優(yōu)級(jí)純)，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水(18.2 MΩ·cm)，實(shí)驗(yàn)室超純水儀制備；Ca、Cr、Cd、Co、Mg、Mn、Mo、Na、Ni、Pb、As、Fe、Cu、Se(1 000 μg/mL)，國家有色金屬及電子材料分析測試中心；K、Al(1 000 μg/mL)，國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院；Zn(1 000 μg/mL)，中國計(jì)量科學(xué)研究院。

島津ICP-MS 2030電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，日本島津公司；普析TAS990原子吸收分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ETHOS UP微波消解儀，意大利Milestone公司；Cascada AN 實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)，美國Pall公司。

1.2 陳釀實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)地設(shè)在安徽省黃山市太平湖竹園(118.037 25°N，30.355 35°E)。選擇自然生長環(huán)境條件基本一致的毛竹(竹齡1～3年)，每根毛竹在距地表水平高度1.5 m內(nèi)，間隔選取3個(gè)竹節(jié)，采用直徑為2 mm的鉆頭，在竹節(jié)處斜向下45°開孔，向竹腔內(nèi)注入100 mL基酒，采用熱熔槍密封。

添加外源黃酮的處理，準(zhǔn)確稱取一定量的竹葉黃酮提取物，精確至0.000 1 g，添加入白酒中，配制成終質(zhì)量濃度為2.5、5、10 mg/mL的基酒。其他處理同上。

分別陳釀0、3、7、10、14、21、28、35 d后，在注酒竹腔下部竹節(jié)上1 cm處開孔，用50 mL注射器取樣，待檢測。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3 礦質(zhì)元素檢測

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法，各元素的前處理及檢測參數(shù)見表1。

表1 各元素前處理方法及儀器條件Table 1 Pre-treatment methods and instrument conditions for the determination of 17 elements

1.4 結(jié)果計(jì)算與數(shù)據(jù)分析

將檢測得到的結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(表2)，計(jì)算礦質(zhì)元素含量，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)原始數(shù)

表2 17種礦質(zhì)元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限Table 2 Regression equations and detection limits for 17 mineral elements

據(jù)應(yīng)用Microsoft Excel 2013進(jìn)行處理，利用SPSS 22.0進(jìn)行顯著性差異分析，Origin 2018繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基酒中礦質(zhì)元素檢測結(jié)果

檢測表明，基酒中含有一定量的礦質(zhì)元素，其中Na和Ca含量最多，分別為37.79 mg/L和32.49 mg/L；其次為Mn，含量為7.40 mg/L；Zn、Mn、Cu、Al的含量介于64.57～287.00 μg/L；Cr、As、Ni、Se、Cd含量介于0.98～6.70 μg/L；K、Fe、Pb、Mo和Co含量低于檢測限(表3)。值得注意的是，Al、As、Pb和Cd對人體有潛在毒性，除Pb未檢出外，其余3種均有檢出，其中Al的含量最高，達(dá)64.57 μg/L，但均滿足GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》、GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》和世界衛(wèi)生組織關(guān)于食品添加劑和污染物的限量要求[11]。

2.2 竹筒酒陳釀過程中礦質(zhì)元素變化規(guī)律

2.2.1 常量元素變化規(guī)律

陳釀過程顯著影響竹筒酒中常量元素的含量，K元素含量變化最大。陳釀初期，竹筒酒中K的含量呈指數(shù)型增長(表4)，14 d時(shí)達(dá)到峰值，含量為330.83 mg/L。隨后逐漸降低，28 d后趨于平衡，含量穩(wěn)定在190 mg/L左右(圖1)。Ca、Na的含量逐漸降低，其變化符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程(表4)，半衰期分別為26.05、9.40 d，21 d后，含量趨于穩(wěn)定，Ca的含量由32.49 mg/L降至18.16 mg/L，Na的含量由37.79 mg/L降至10.84 mg/L。Mg的含量總體變化不大，基酒注入竹腔3 d后略有升高，14 d后達(dá)到最高，為10.60 mg/L，隨后緩慢下降，28 d后趨于平衡，35 d時(shí)含量為6.56 mg/L。毛竹稈中富含K元素，1～5年生毛竹竹稈中K的平均含量為2.54 mg/g[12]，遠(yuǎn)高于基酒中K的濃度，并且在陳釀初期，基酒中乙醇含量較高，提高了細(xì)胞膜的通透性，使竹稈中K迅速滲入酒中。經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定，14 d后，竹筒酒中乙醇含量逐漸降低，并穩(wěn)定在10%vol左右，對細(xì)胞膜的通透性影響較小，因此酒中K的含量也逐漸降低，趨于相對穩(wěn)定。

表3 基酒中的礦質(zhì)元素含量Table 3 Mineral element content in base liquor

2.2.2 微量元素變化規(guī)律

微量元素含量在陳釀過程具有不同程度的變化。Mn的含量在10 d內(nèi)快速增加，10 d時(shí)達(dá)到最高，為2.96 mg/L，隨后緩慢下降，35 d時(shí)含量為1.36 mg/L。Cu的含量在陳釀初期變化劇烈，3 d內(nèi)迅速升高并在第3天達(dá)到峰值，由85.43 μg/L升至178.67 μg/L，3～7 d保持在穩(wěn)定水平，7～10 d大幅下降，14 d后趨于平衡，含量達(dá)到陳釀前相同水平。Zn和Ni的含量在7～35 d期間的變化規(guī)律相似，均在第14天達(dá)到谷值，Zn的含量為54.95 μg/L，Ni的含量為2.86 μg/L，14～28 d略有上升，28～35 d又大幅下降，到35 d還未達(dá)到平衡。與陳釀前比，Ni元素含量下降了60%，Zn元素含量的降幅高達(dá)90%。研究表明，Zn2+的添加使得酒的口味欠老練、單、澀，對酒質(zhì)不利[4]，因此Zn元素在竹筒酒陳釀期間的含量下降對酒質(zhì)提升有一定的貢獻(xiàn)。Cr的含量逐漸降低，其變化符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程(表4)，半衰期為9.59 d，14 d后含量趨于穩(wěn)定，含量由6.70 μg/L降至2.11 μg/L。Fe元素僅在第3和第7天有檢出，Se在陳釀過程中均未檢出，Mo、Co在基酒和陳釀全過程均未檢出。

表4 Ca、Na、Cr、As、K元素的動(dòng)力學(xué)方程Table 4 Kinetic equations for Ca, Na, Cr, As and K elements

a-常量元素；b-微量元素圖1 竹筒酒中有益元素含量隨時(shí)間變化Fig.1 Dynamics of the content of beneficial elements in bamboo liquor over time

2.2.3 有害元素變化規(guī)律

Al、As、Pb和Cd對人體有潛在毒性，其在竹筒酒中的含量受陳釀時(shí)間的影響表現(xiàn)不同。如圖2所示，Pb、Cd元素含量在陳釀初期迅速上升，Pb在7 d時(shí)達(dá)到峰值，為6.82 μg/L，Cd的含量在10 d時(shí)達(dá)到2.32 μg/L，隨后二者緩慢下降，35 d時(shí)均降到0.50 μg/L以下，遠(yuǎn)低于食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)及聯(lián)合國糧農(nóng)組織與世界衛(wèi)生組織關(guān)于有毒重金屬的限量標(biāo)準(zhǔn)。Al和As元素的含量隨著陳釀時(shí)間的延長而不斷降低，Al元素在2周后不再檢出，這對酒質(zhì)的提升有益，因?yàn)锳l離子會(huì)使酒的口感單、澀[4]。As元素含量的變化規(guī)律符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)(表4)，且在12 d左右下降至初始含量的一半，35 d時(shí)降至2 μg/L以下，遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 竹筒酒中有害元素含量隨時(shí)間變化Fig.2 Dynamics of the content of harmful elements in bamboo liquor over time

2.3 外源黃酮對竹筒酒中礦質(zhì)元素變化的影響

外源黃酮提取物中含有一定量Ca、Na、Ni、As等元素，隨著添加直接進(jìn)入基酒中，提高了基酒中相應(yīng)礦質(zhì)元素的初始含量。添加后，黃酮基酒中Ca元素含量為32.49～112.45 mg/L，Na元素含量為33.06～47.58 mg/L，K元素含量為9.94～43.73 mg/L，Ni元素含量為4.89～8.99 μg/L，As元素含量為8.96～38.80 μg/L，基本與外源黃酮含量成比例增長。

2.3.1 外源黃酮對常量元素的影響

外源黃酮顯著影響竹筒酒中常量元素的含量(圖3、圖4)。2.5 mg/mL外源黃酮處理，大幅提高了K含量的峰值，14 d時(shí)達(dá)到1 044.90 mg/L，是空白基酒組的3.16倍(圖3-a)；10 mg/mL外源黃酮處理，K含量上升速度最快，10 d時(shí)達(dá)到峰值，其他3組均在14 d達(dá)到峰值；21 d后，除10 mg/mL外源黃酮處理組外，另外3組的K含量都達(dá)到了平衡(圖3-a)，2.5 mg/mL外源黃酮處理組比另外3組的含量高出近1.5倍(P<0.05)(圖4)；35 d時(shí)，10 mg/mL外源黃酮處理組K元素含量最高，其次是2.5 mg/mL外源黃酮處理組。Ca的變化趨勢在不同黃酮添加量下基本一致(圖3-b)，其含量高低與竹葉黃酮添加量具有一定關(guān)系，21 d時(shí)，2.5 mg/mL外源黃酮處理組Ca元素含量顯著較低(P<0.05)，比空白基酒組低近50%，比5、10 mg/mL外源黃酮處理組低1～2倍(圖4)。Mg的變化趨勢受不同黃酮添加量影響不大(圖3-d)，外源黃酮處理僅對其含量高低有所影響。21 d時(shí)，Mg在2.5 mg/mL外源黃酮處理下的含量是其他3組的1.5倍左右，21 d后，除2.5 mg/mL外源黃酮處理組外，其他3組Mg的含量基本達(dá)到平衡。

a-K；b-Ca；c-Na；d-Mg；e-Mn；f-Cu；g-Ni；h-As圖3 外源黃酮對礦質(zhì)元素變化規(guī)律的影響Fig.3 Effect of exogenous flavonoids on variation of mineral elements

黃酮類化合物可以通過環(huán)上的酚羥基和羰基與金屬離子配位，形成相應(yīng)的黃酮-金屬離子螯合物[13-16]。Na元素的含量隨著竹葉黃酮添加量的增加不斷提高(圖3-c)，21 d時(shí)，10 mg/mL外源黃酮處理下的Na元素含量高達(dá)26.02 mg/L，是空白組的2倍以上(圖4)，推測隨著黃酮添加量的增加，酒中Na+與黃酮化合物生成螯合物，濃度下降，使得竹稈中Na+更趨向于向酒中擴(kuò)散，導(dǎo)致酒中的Na元素含量升高。

a-常量元素；b-微量元素圖4 竹筒酒中有益元素含量隨黃酮添加量變化Fig.4 Dynamics of the content of beneficial elements in bamboo liquor with flavonoid addition

2.3.2 外源黃酮對微量元素的影響

與常量元素相比，外源黃酮對微量元素影響較小。21 d時(shí)，Zn元素在2.5 mg/mL外源黃酮處理組的含量最高，為188.67 μg/L，比空白組高出1倍，比5、10 mg/mL外源黃酮處理組高出0.5倍左右。外源黃酮對Cu的變化趨勢和含量基本沒有影響，21 d時(shí)，2.5 mg/mL外源黃酮處理組的Cu的含量為105.00 μg/L，僅高于其他3組10%左右。Ni元素的變化趨勢也基本不受外源黃酮影響。21 d時(shí)，Ni元素的含量在5 mg/mL外源黃酮處理組最高，為4.27 μg/L，在2.5 mg/mL外源黃酮處理組最低，為3.43 μg/L。Cr元素含量受外源黃酮影響較為顯著，21 d時(shí)，添加黃酮的處理組比空白組高出60%～115%。Se元素含量隨黃酮添加量增加而增加，最高為0.34 μg/L，根據(jù)相關(guān)研究，這是由于Se與黃酮生成了配合物[17]，酒中游離的Se離子濃度小于竹稈中，因此竹稈中的Se離子向酒中擴(kuò)散，引起了竹筒酒中Se元素的升高。

與其他元素相反，陳釀的前21 d內(nèi)，空白組的Mn元素含量高于3個(gè)添加外源黃酮的處理組(圖3-e)，21 d時(shí)，空白組Mn含量是3個(gè)外源黃酮處理組的1.46～3.28倍(圖4)。2.5 mg/mL的外源黃酮處理組在35 d時(shí)，Mn的含量比開始陳釀前高出了15倍。據(jù)此推測竹筒酒在陳釀過程中，Mn會(huì)不斷累積，而添加外源黃酮對竹筒酒陳釀過程中Mn的累積具有減少作用。

2.3.3 外源黃酮對有害元素的影響

外源黃酮對有害元素具有不同程度的影響。外源黃酮提取物中含有8.96～38.80 μg/L的As元素，隨著陳釀過程逐漸降低，到21 d時(shí)趨于平衡。21 d時(shí)，As元素含量隨外源黃酮添加量的升高不斷升高(圖3-h)，2.5 mg/mL外源黃酮處理組含量較空白組增加較少，僅增加了10%，另外2組含量均為空白組的2倍左右。如圖5所示，酒中的Cd元素的含量在2.5 mg/mL外源黃酮處理組比空白基酒組低90%，在5、10 mg/mL外源黃酮處理組比空白基酒組低約40%。竹葉黃酮對竹筒酒中Al和Pb元素含量影響不顯著(P>0.05)，21 d時(shí)，Al元素僅在10 mg/mL 外源黃酮處理組有檢出，其原因是10 mg/mL 外源黃酮提取物中初始Al元素含量較高，為105.00 μg/L。

圖5 竹筒酒中有害元素含量隨黃酮添加量變化Fig.5 Dynamics of the content of harmful elements in bamboo liquor with flavonoid addition

3 結(jié)論與討論

(1)竹子中富含K[18]

在陳釀過程中，竹筒酒中的K含量變化除了與竹子中的K主動(dòng)溶出有關(guān)外，還與竹筒酒中的乙醇有關(guān)。相關(guān)研究表明，植物的無氧呼吸也會(huì)產(chǎn)生乙醇，但最終會(huì)被自身的乙醇代謝途徑代謝轉(zhuǎn)化[19]。在陳釀初期，竹筒酒的乙醇含量較高，植物無法在短時(shí)間內(nèi)代謝消耗，因乙醇對竹子的刺激作用，使竹筒酒中的K含量在陳釀初期呈指數(shù)型增長；陳釀15 d后，竹筒酒中乙醇含量趨于穩(wěn)定，乙醇對竹子的刺激作用減少，酒中K含量受溶出作用影響，呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，在28 d左右達(dá)到了約190 mg/L的穩(wěn)定含量。Ca、Na、Cr、As元素含量的變化符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，Ca元素含量在陳釀過程中下降緩慢，降幅較?。籒a、Cr、As元素含量均在10 d左右就下降到初始含量的一半。除K、Mn元素外，各元素在陳釀過程中總體呈下降趨勢，最終在21 d左右趨于穩(wěn)定水平，因此陳釀21 d比較合適。

(2)礦質(zhì)元素對植物的生長調(diào)節(jié)具有重要作用[20]

K、Mg在自然界中屬于大量元素，K是植物調(diào)節(jié)葉片氣孔開閉，控制蒸騰作用的重要元素，Mg是植物光合作用酶的組成元素；Zn作為自然界中的微量元素，對植物生長調(diào)節(jié)過程中的酶具有活化作用；Pb、Cd在自然界中屬于重金屬元素，對多數(shù)植物生長具有脅迫作用。毛竹為禾本科植物，K、Mg、Zn是毛竹生長過程中的必需元素，Pb、Cd對毛竹根系細(xì)胞具有損傷作用[12,21-22]。本研究中添加外源黃酮對竹筒酒中各礦質(zhì)元素含量具有不同程度的影響。2.5 mg/mL外源黃酮處理，大幅提高了K、Mg、Zn元素含量的峰值，有力地降低了有害元素Pb、Cd的含量，對As、Al元素含量無明顯影響。因此，添加外源黃酮對竹筒酒中有益元素的積累和有害元素的降低有較好的作用，且最適的添加量和最佳陳釀時(shí)間分別為2.5 mg/mL和21 d。