Microbacterium sp.XT11黃原膠內(nèi)切酶在畢赤酵母中的異源表達(dá)、性質(zhì)及應(yīng)用

楊國(guó)帥，許穎，詹曉北，蔣蕓，李志濤，高敏杰

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院, 江蘇 無(wú)錫，214122)

黃原膠是由野油菜黃單孢菌分泌的一種胞外雜多糖，主鏈由以β-1,4糖苷鍵相連的葡萄糖構(gòu)成，甘露糖→葡萄糖→甘露糖組成其側(cè)鏈，分子質(zhì)量一般為2×106～5×107Da[1]。研究發(fā)現(xiàn)，由黃原膠降解而來(lái)的低分子質(zhì)量黃原膠可以抑制軟骨細(xì)胞凋亡[2]、治療骨關(guān)節(jié)炎[3]，還具有抗氧化活性[4]、抑菌[5]、清除自由基[6]等功效，具有較高的市場(chǎng)價(jià)值。因此，通過(guò)降解黃原膠生產(chǎn)低分子質(zhì)量黃原膠具有重要的意義。

常見(jiàn)的多糖降解方法有物理法，化學(xué)法和生物酶法[7]。相對(duì)于物理法和化學(xué)法，生物酶法反應(yīng)條件溫和、過(guò)程可控，因而被廣泛應(yīng)用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，與黃原膠降解直接相關(guān)的酶有黃原膠內(nèi)切酶、β-D-葡萄糖苷酶，黃原膠裂解酶、α-D-甘露糖苷酶、不飽和葡萄糖醛酸酶，其中黃原膠內(nèi)切酶是一種能隨機(jī)切割黃原膠主鏈的β-1,4-葡萄糖苷鍵的內(nèi)切葡聚糖酶，對(duì)黃原膠的降解起關(guān)鍵性作用[9]。LI等[10]對(duì)來(lái)自Microbacteriumsp.XT11的黃原膠內(nèi)切酶進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其能直接作用于黃原膠主鏈?zhǔn)蛊浣到?。YANG等[11]將此黃原膠內(nèi)切酶在大腸桿菌中胞內(nèi)表達(dá)，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)它具有一般的內(nèi)切葡聚糖酶具有的2個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域：具有催化活性的催化結(jié)構(gòu)域和只具有結(jié)合功能但無(wú)催化活性的碳水化合物結(jié)合模塊，推測(cè)其可能是來(lái)自GH9 家族的新分支。但是大腸桿菌的胞內(nèi)表達(dá)和較低的酶活力限制了大規(guī)模應(yīng)用。

畢赤酵母(Pichiapastoris)是一種成熟的蛋白表達(dá)宿主，在畢赤酵母中胞外表達(dá)的酶具有更高的生產(chǎn)率和純度，操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單且成本較低，主要用于生物制藥和工業(yè)酶的生產(chǎn)[12-13]。合適的啟動(dòng)子能使外源蛋白高效表達(dá)，畢赤酵母的啟動(dòng)子分為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子，其中AOX1和GAP最為常用[14]。

本研究首次將來(lái)自Microbacteriumsp.XT11的黃原膠內(nèi)切酶，以畢赤酵母GS115為表達(dá)宿主進(jìn)行異源表達(dá)。并對(duì)其啟動(dòng)子及發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)重組黃原膠內(nèi)切酶的酶學(xué)性質(zhì)做了初步探索，并利用其對(duì)黃原膠進(jìn)行水解，為低分子質(zhì)量黃原膠的制備提供了一個(gè)可行的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌JM109和畢赤酵母GS115均為本實(shí)驗(yàn)室保藏；載體pPIC9K購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：5酵母膏，10胰蛋白胨，5 NaCl，20瓊脂粉(固體培養(yǎng)基)，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，15 min)。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：10酵母膏，20蛋白胨，20葡萄糖，20瓊脂粉(固體培養(yǎng)基)，高壓蒸汽滅菌(115 ℃，20 min)。

BMGY培養(yǎng)基(g/L)：10酵母膏，20蛋白胨，13.4YNB，4×10-4生物素，10甘油，100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)，高壓蒸汽滅菌(115 ℃，20 min)。

BMMY培養(yǎng)基(g/L)：10酵母膏，20蛋白胨，13.4 YNB，4×10-4生物素，5甲醇，100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)，高壓蒸汽滅菌(115 ℃，20 min)。

BSM培養(yǎng)基：26.7 mL/L 85% H3PO4，0.93 g/L CaSO4，18.2 g/L K2SO4，14.9 g/L MgSO4·7H2O，4.13 g/L KOH，40 g/L甘油，4.35 mL/L PMT1。

1.1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶(EcoR I、NotI、SacI、SalI、BamH I)、DNA膠回收試劑盒，美國(guó)Thermo公司;TaqPremix、DNA Maker、DNA連接酶(Solution I)，TaKaRa公司(大連);Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、氨芐青霉素、遺傳霉素(G418)、瓊脂糖，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

C1000 TouchTM型 PCR儀、Micro PulserTM型電轉(zhuǎn)儀，美國(guó)Bio-Rad公司；KTA蛋白純化系統(tǒng)，美國(guó)GE Healthcare公司；TU-1810分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

黃原膠內(nèi)切酶基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以CGGAATTCATGTCTAGACGTAGAGCCTCTTC(EcoR I)為上游引物，TAAAGCGGCCGCTTAACCAACGGCCACACCAGTAAC(NotI)為下游引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后通過(guò)雙酶切法插入到畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K中組成重組質(zhì)粒pPIC9K-EX。將重組質(zhì)粒pPIC9K-EX轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后涂布于帶有Amp抗性的LB平板上，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR, 質(zhì)粒酶切，測(cè)序驗(yàn)證。

在此基礎(chǔ)上，以畢赤酵母GS115基因組為模板，GCAGCGAGCTCAATGTCTTGGTGTCCTCGTC(SacI)為上游引物，GGCCGGATCCATTTAAAGTCTTTGGGTCAGG(BamH I)為下游引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到GAP基因片段，再通過(guò)雙酶切法替換重組質(zhì)粒pPIC9K-EX的啟動(dòng)子AOX1片段組成重組質(zhì)粒pGAP9K-EX(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction of plasmids pPIC9K-EX and pGAP9K-EX

1.2.2 黃原膠內(nèi)切酶的表達(dá)與篩選

將驗(yàn)證成功的質(zhì)粒pPIC9K-EX，pGAP9K-EX分別線性化(SalI)后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)MD，G418板篩選后[15]，分別挑取20株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證。將驗(yàn)證成功的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定其酶活力，以篩選高酶活力菌株。

1.2.3 重組酵母的發(fā)酵條件優(yōu)化

將重組畢赤酵母在YPD平板上30 ℃下活化60～72 h，挑取單菌落接種至25 mL YPD培養(yǎng)基中，以200 r/min、30 ℃下培養(yǎng)16～18 h獲得種子液(OD600=2～6)。設(shè)置初始發(fā)酵條件：pH 6.0；接種量5%(相對(duì)于培養(yǎng)基)；溫度30 ℃；轉(zhuǎn)速：200 r/min。對(duì)培養(yǎng)溫度、pH、轉(zhuǎn)速和接種量進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定其細(xì)胞干重、酶活力。

1.2.4 7-L發(fā)酵罐放大生產(chǎn)黃原膠內(nèi)切酶

將重組畢赤酵母7-L發(fā)酵罐中放大培養(yǎng)。選用BMS培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，初始裝液量3.0 L，接種量為5%，待出現(xiàn)溶氧反彈之后補(bǔ)加甘油，同時(shí)調(diào)節(jié)通氣量和轉(zhuǎn)速，使溶氧保持在20%左右。每隔4～6 h取1次樣，測(cè)定其細(xì)胞干重、蛋白濃度及黃原膠內(nèi)切酶酶活力。

1.2.5 黃原膠內(nèi)切酶的分離純化

采用離心、硫酸銨沉淀等步驟對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行初步純化。發(fā)酵液8 000 r/min離心 5 min，得到上清液；加入硫酸銨，攪拌溶解后使硫酸銨終質(zhì)量濃度為400 g/mL，在4 ℃下放置過(guò)夜，并于12 000 r/min、4 ℃ 條件下離心15 min 收集蛋白沉淀。最后，采用KTA Avant蛋白純化系統(tǒng)，將粗酶液進(jìn)行體積排阻層析(Superdex G100)進(jìn)行分離，用SDS-PAGE分析純化后的酶。

1.2.6 黃原膠內(nèi)切酶活力和蛋白濃度的測(cè)定

酶反應(yīng)體系(5 mL)為2 g/L 黃原膠，10 mmol/L 磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)，適量酶液。于40 ℃下反，10 min，沸水浴10 min 終止反應(yīng)，DNS法測(cè)定反應(yīng)體系中還原糖濃度[16]，空白為滅活的酶液。酶活定義：每分鐘釋放1 μmol/L 還原糖所需的黃原膠內(nèi)切酶酶量為1 U。利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度[16]。

1.2.7 黃原膠內(nèi)切酶酶學(xué)性質(zhì)研究

為測(cè)定黃原膠內(nèi)切酶的最適pH，用10 mmol/L 不同pH(3.0～9.0)的磷酸鈉緩沖液測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算各pH下的相對(duì)酶活力。測(cè)定pH穩(wěn)定性時(shí)，用上述緩沖液稀釋酶液，并在4 ℃ 下放置3 h，按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力，以未經(jīng)處理的黃原膠內(nèi)切酶酶液為100%，計(jì)算各pH下的殘余酶活力。為測(cè)定重組黃原膠內(nèi)切酶最適溫度，在20～70 ℃ 測(cè)定黃原膠內(nèi)切酶酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算各溫度下的相對(duì)酶活力。測(cè)定溫度穩(wěn)定性時(shí)，將適當(dāng)稀釋后的酶液于20～70 ℃ 保溫3 h后測(cè)定酶活力，以未經(jīng)處理的黃原膠內(nèi)切酶酶液為100%，計(jì)算各溫度下的殘余酶活力。

1.2.8 低分子質(zhì)量黃原膠的制備

將2 g/L 原膠溶解于10 mmol/L 磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)中，加入足量的黃原膠內(nèi)切酶，40 ℃ 反應(yīng)5 h，水解產(chǎn)物經(jīng)Sevage法[17]除蛋白，加入一定體積的無(wú)水乙醇醇沉，得到水解產(chǎn)物。采用高效體積排阻色譜(high-performance size exclusion chromatograph，HPSEC)測(cè)定其分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃原膠內(nèi)切酶的表達(dá)與純化

Microbacteriumsp.XT11來(lái)源的黃原膠內(nèi)切酶基因(EX, GenBank：ALX66163.1)全長(zhǎng)2 856 bp，編碼951個(gè)氨基酸，針對(duì)畢赤酵母偏好性，對(duì)黃原膠內(nèi)切酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后密碼子的適應(yīng)指數(shù)從0.49升到0.88，平均GC含量(DNA 4種堿基中，鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶所占的比率)從67.3%調(diào)整至44.3%，并避免了EcoR I、NotI、SacI、SalI、BamH I等常用酶切位點(diǎn)。

重組質(zhì)粒pPIC9K-EX的驗(yàn)證結(jié)果如圖2-a所示，其單酶切結(jié)果與重組質(zhì)粒pPIC9K-EX的大小相符，雙酶切及PCR結(jié)果均在2 800 bp左右出現(xiàn)明顯條帶，與黃原膠內(nèi)切酶基因大小一致，隨后的測(cè)序驗(yàn)證表明重組質(zhì)粒pPIC9K-EX構(gòu)建成功。以同樣的方法驗(yàn)證重組質(zhì)粒pGAP9K-EX(圖2-b)，最后的測(cè)序驗(yàn)證表明重組質(zhì)粒pGAP9K-EX構(gòu)建成功。將驗(yàn)證成功的重組質(zhì)粒pPIC9K-EX、pGAP9K-EX分別線性化后導(dǎo)入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選最終得到16株重組畢赤酵母-pPIC9K-EX和15株重組畢赤酵母pGAP9K-EX。將重組畢赤酵母搖瓶發(fā)酵后測(cè)定其酶活力，由圖2-c可以看出，以AOX1為啟動(dòng)子的重組畢赤酵母酶活力最高為240.12 U/L(A8)，以GAP為啟動(dòng)子的重組畢赤酵母(圖2-d)酶活力最高為300.23 U/L(G12)。

ExPASy預(yù)測(cè)黃原膠內(nèi)切酶分子質(zhì)量約為101 kDa。發(fā)酵上清液的SDS-PAGE分析結(jié)果(圖3-a)顯示，泳道2(A8)和泳道4(G12)均在95～130 kDa有明顯的條帶，表明重組畢赤酵母-pPIC9K-EX、重組畢赤酵母-pGAP9K-EX均可成功的表達(dá)黃原膠內(nèi)切酶。圖3-b中無(wú)明顯雜帶，表明雜蛋白已被去除。對(duì)于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)而言，不同啟動(dòng)子的表達(dá)速率和表達(dá)條件均有很大差異，當(dāng)啟動(dòng)子為AOX1時(shí)，需要甲醇誘導(dǎo)才能表達(dá)外源蛋白；當(dāng)啟動(dòng)子為GAP時(shí)，表達(dá)外源蛋白無(wú)需誘導(dǎo)[14]。高酶活力菌株重組畢赤酵母-pGAP9K-EX-12表達(dá)黃原膠內(nèi)切酶的水平(300.23 U/L)高于重組畢赤酵母-pPIC9K-EX-8(240.12 U/L)，且培養(yǎng)條件、發(fā)酵調(diào)控相對(duì)比較簡(jiǎn)單，所以選用重組畢赤酵母-pGAP9K-EX-12做后續(xù)研究。

M-DNA Marker；1、2-EcoR I、Not I單酶切結(jié)果；3-雙酶切結(jié)果；4-EX基因PCR結(jié)果；5、6-Sac I、BamH I單酶切結(jié)果；7-雙酶切結(jié)果；8-GAP基因PCR結(jié)果；9-四酶切結(jié)果a-重組質(zhì)粒pPIC9K-EX的驗(yàn)證；b-重組質(zhì)粒pGAP9K-EX的驗(yàn)證；c-重組畢赤酵母-pPIC9K-EX高酶活力篩選；d-重組畢赤酵母酵母-pGAP9K-EX高酶活力篩選圖2 重組酵母的構(gòu)建與篩選Fig.2 Construction and screening of recombinant Pichia pastoris

M-蛋白質(zhì)Marker；1、3-原始畢赤酵母；2-重組畢赤酵母-pPIC9K-EX-8；4-重組畢赤酵母-pGAP9K-EX-12；5-重組畢赤酵母-pPIC9K-EX-8；6-重組畢赤酵母-pGAP9K-EX-12a-重組畢赤酵母發(fā)酵上清液；b-純化后圖3 SDS-PAGE檢測(cè)重組黃原膠內(nèi)切酶的表達(dá)和純化Fig.3 SDS-PAGE analysis of endoxanthanase expression and purification

2.2 重組畢赤酵母的發(fā)酵條件優(yōu)化

畢赤酵母對(duì)不同外源蛋白的表達(dá)水平有很大差異，除外源蛋白本身的性質(zhì)、畢赤酵母的啟動(dòng)子等影響外，畢赤酵母的發(fā)酵條件也影響著外源蛋白的表達(dá)水平。畢赤酵母的最適生長(zhǎng)溫度為28～30 ℃，溫度影響畢赤酵母的菌體生長(zhǎng)速率、產(chǎn)物的合成方向及速率等[18]，考察了不同發(fā)酵溫度對(duì)重組畢赤酵母表達(dá)黃原膠內(nèi)切酶的影響(圖4-a)。畢赤酵母在pH為3～7的條件下都能正常生長(zhǎng)，但各工程菌本身的發(fā)酵特性和產(chǎn)物的理化性質(zhì)各有差別[12]，導(dǎo)致所需的最適pH各不相同，分別在不同pH下對(duì)重組畢赤酵母進(jìn)行發(fā)酵(圖4-b)，以尋求重組畢赤酵母表達(dá)黃原膠內(nèi)切酶所需的最適pH值。發(fā)酵液中的溶氧量直接影響畢赤酵母的生長(zhǎng)和代謝，一般通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速等控制溶氧量；合適的接種比能保證在畢赤酵母快速生長(zhǎng)的同時(shí)大量產(chǎn)生代謝產(chǎn)物[15]。所以對(duì)發(fā)酵轉(zhuǎn)速(圖4-c)和接種比(圖4-d)進(jìn)行了優(yōu)化。在搖瓶水平，重組畢赤酵母-pGAP9K-EX-12表達(dá)黃原膠內(nèi)切酶的最佳發(fā)酵條件為30 ℃、pH 6.0、220 r/min、接種量5%。

參照搖瓶水平的優(yōu)化條件，對(duì)重組畢赤酵母-pGAP9K-EX-12進(jìn)行7-L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，結(jié)果如圖5所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，重組畢赤酵母菌體干重最終達(dá)到80.53 g/L，蛋白含量與黃原膠內(nèi)切酶酶活力分別達(dá)到501.12 mg/L和1 230.25 U/L，而搖瓶發(fā)酵只有185.64 mg/L和407.13 U/L，分別提高了2.7和3.0倍。

a-溫度；b- pH；c-轉(zhuǎn)速；d-接種量圖4 重組畢赤酵母-pGAP9K-EX-12的搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.4 Optimization of fermentation conditions for recombinant Pichia pastoris-pGAP9K-EX-12 in the shake flasks

a-搖瓶；b-7-L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)圖5 重組畢赤酵母-pGAP9K-EX-12的發(fā)酵曲線Fig.5 Fermentation curve of recombinant Pichia pastoris-pGAP9K-EX-12

2.3 黃原膠內(nèi)切酶酶學(xué)性質(zhì)

重組黃原膠內(nèi)切酶的酶學(xué)性質(zhì)如圖6所示。黃原膠內(nèi)切酶的最適作用pH為6.0，在pH為5.5～7.5、4 ℃ 放置3 h 后，其酶活力仍可達(dá)90%以上，說(shuō)明重組黃原膠內(nèi)切酶具有較寬的pH耐受性。重組黃原膠內(nèi)切酶的酶活力隨著溫度的上升先提高再下降，在40 ℃達(dá)到最大，高于45 ℃時(shí)，酶活力急速下降，可能是溫度過(guò)高導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。在20～45 ℃ 放置 3 h 后，殘留酶活力仍可達(dá)70%以上，在很寬的溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出相對(duì)較高的活性。在最佳條件(40 ℃，pH 6.0)下測(cè)定黃原膠內(nèi)切酶的比活力為2 700 U/g。

黃原膠主鏈的結(jié)構(gòu)與纖維素類似，姜海珠等[19]將來(lái)自Clostridiumthermocellum的纖維素酶在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其能一定程度上降解黃原膠，比酶活力為98.3 U/g。NANKAI等[20]發(fā)現(xiàn)來(lái)自Bacillussp.GL-1的黃原膠內(nèi)切酶對(duì)天然的黃原膠作用效果不明顯，比酶活力為9.2 U/g。MOROZ等[21]將來(lái)自Paenibacillusnanensis黃原膠內(nèi)切酶在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的比酶活力為285 U/g。本研究在畢赤酵母中表達(dá)的重組黃原膠內(nèi)切酶具有相對(duì)較高的酶活力和穩(wěn)定性，使其成為工業(yè)生產(chǎn)低分子質(zhì)量黃原膠的理想候選酶。

2.4 低分子質(zhì)量黃原膠的制備

研究發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量在300～1 500 Da的黃原膠可以促進(jìn)對(duì)人體有益的腸道微生物的生長(zhǎng)和短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，具有益生活性，可以作為益生元而被廣泛應(yīng)用[22-23]。在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)來(lái)自Clostridiumthermocellum的纖維素酶可將黃原膠部分降解為分子質(zhì)量為4.5×104Da的低分子質(zhì)量黃原膠[19]；在枯草芽孢桿菌表達(dá)來(lái)自Paenibacillusnanensis黃原膠內(nèi)切酶的水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量主要在1 500 Da左右[21]。

a-最適pH；b-pH穩(wěn)定性；c-最適溫度；d-溫度穩(wěn)定性圖6 黃原膠內(nèi)切酶酶學(xué)性質(zhì)Fig.6 Enzymatic properties of endoxanthanase

利用HPSEC法測(cè)定了純化后水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量(Mw)與保留時(shí)間(t)的關(guān)系, 以lgMw為縱坐標(biāo), 保留時(shí)間為橫坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7-a所示, 為lg(Mw)=13.1-0.515t，R2=0.996。待黃原膠內(nèi)切酶水解黃原膠(2.8×107Da)5 h 后，將得到的水解產(chǎn)物提純并測(cè)定其分子質(zhì)量(圖7-b)。

a-標(biāo)準(zhǔn)曲線；b-水解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布圖7 水解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布Fig.7 Molecular weight distribution of hydrolysate

分別由標(biāo)準(zhǔn)曲線、峰面積計(jì)算其分子質(zhì)量及比例，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為2.3×107Da 左右的占26.42%，分子質(zhì)量為1 400 Da左右的占73.58%，說(shuō)明重組黃原膠內(nèi)切酶可以有效水解黃原膠，但水解產(chǎn)物中仍存在分子質(zhì)量較大的黃原膠，推測(cè)是一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的區(qū)域沒(méi)有被完全水解。因此，利用畢赤酵母異源表達(dá)的黃原膠內(nèi)切酶可以有效制備低分子質(zhì)量黃原膠。

3 結(jié)論

本研究成功將來(lái)自Microbacteriumsp.XT11的黃原膠內(nèi)切酶在畢赤酵母GS115表達(dá)，以GAP為啟動(dòng)子的重組畢赤酵母的最優(yōu)發(fā)酵條件為30 ℃、pH 6.0、220 r/min、接種量5%，經(jīng)7-L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)后酶活力可達(dá)1 230.25 U/L，最適作用條件為pH 6.0，40 ℃。將黃原膠內(nèi)切酶作用于黃原膠，水解產(chǎn)物大部分為分子質(zhì)量在1 400 Da 左右的低分子質(zhì)量黃原膠。為低分子質(zhì)量黃原膠的工業(yè)制備提供了一種可行的途徑。