miR-125b-5p靶向ΔNp63α對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分化的影響及其機(jī)制

丁毅，李敏，陳龍，張美林，馮樹梅*

1新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，烏魯木齊 830011；2新疆第二醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖組胚教研室，烏魯木齊 830011；3新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院技能中心，烏魯木齊 830011；4新疆烏魯木齊市中心血站，烏魯木齊 830011

皮膚是生物體遠(yuǎn)離外界環(huán)境影響的第一道屏障，位于皮膚最外層的表皮層主要由不斷經(jīng)歷自我更新、分化和退化過程的角質(zhì)形成細(xì)胞組成[1-2]。角質(zhì)形成細(xì)胞的異常分化與銀屑病、特應(yīng)性皮炎及皮膚鱗癌等的發(fā)生關(guān)系密切[3-4]。因此，闡明角質(zhì)形成細(xì)胞的分化機(jī)制對(duì)于了解皮膚疾病的發(fā)生非常重要。MicroRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性、長(zhǎng)度為22～23個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，通過與靶基因的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)配對(duì)來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[5]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可調(diào)控分化、增殖和凋亡等多種重要的細(xì)胞功能，并且其表達(dá)異常與皮膚疾病密切相關(guān)[4-6]。miR-125b-5p作為一種重要的抑癌分子，在銀屑病、皮膚鱗癌和黑色素瘤中低表達(dá)，并可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-8]；過表達(dá)miR-125b-5p可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的增殖[9]。ΔNp63α是皮膚發(fā)育的重要調(diào)控因子，在銀屑病和皮膚鱗癌中表達(dá)上調(diào)[10]，過表達(dá)ΔNp63α可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖[11]。靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-125b-5p與ΔNp63α密切相關(guān)，但miR-125b-5p能否通過調(diào)控ΔNp63α的表達(dá)影響角質(zhì)形成細(xì)胞的分化鮮見報(bào)道。本研究旨在分析miR-125b-5p和ΔNp63α對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分化的影響及可能機(jī)制，以期為了解皮膚病的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑riboFECTTM CP、miR-125b-5p的模擬物及抑制劑、陰性對(duì)照模擬物/抑制劑購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；ΔNp63α單抗(ab203826)、β-actin單抗(ab75186)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt；ab179463)、p-Akt(Ser473；ab192623)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR；ab32028)、p-mTOR(Ser2448；ab109268)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K；sc-365290)、細(xì)胞角蛋白10(cytokeratin 10，CK10；sc-53252)、外皮蛋白(involucrin，Inv；sc-21748)、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶1(transglutaminase，TG1；sc-166767)單抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；皂素(saponin)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自上海愛必信生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白分析試劑盒和RIPA裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購(gòu)自中國(guó)Biosharp公司。生物安全柜和CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；激光共聚焦顯微鏡(Nikon C2)購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常皮膚永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，用含15%滅活胎牛血清(FBS)、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)。

1.3 角質(zhì)形成細(xì)胞分化模型的構(gòu)建 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT細(xì)胞，按照3×105個(gè)/孔接種于6孔板中，加入1.8 mmol/L氯化鈣處理0、1、5、7 d，提取RNA行qRT-PCR檢測(cè)。

1.4 細(xì)胞免疫熒光分析ΔNp63α的表達(dá)情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT細(xì)胞，按照8000個(gè)/孔鋪于含細(xì)胞爬片的6孔板中，次日加入1.8 mmol/L氯化鈣處理0、5 d。用PBS清洗3次，4%多聚甲醛溶液固定15 min；PBS洗滌10 min×3次，將ΔNp63α一抗(1∶300)于saponin中稀釋后加在玻片上孵育1 h；PBS洗滌，加入二抗(1∶300)孵育1 h，PBS洗滌后封片，利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行共聚焦成像分析。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT細(xì)胞，按照3×105個(gè)/孔接種于6孔板中。次日待細(xì)胞貼壁后按照如下分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染：陰性對(duì)照模擬物組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照模擬物)、miR-125b-5p模擬物組(轉(zhuǎn)染miR-125b-5p模擬物)、陰性對(duì)照抑制劑組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照抑制劑)、miR-125b-5p抑制劑組(轉(zhuǎn)染miR-125b-5p抑制劑)。因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率僅可維持3 d左右，故在3 d后重新轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染5 d后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)miR-125b-5p及ΔNp63α、CK10、Inv、TG1、PI3K、Akt、mTOR的mRNA表達(dá)水平利用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，90 ℃15 s。以U6或β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物由中國(guó)生工生物工程公司合成，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of qRT-PCR

1.7 Western blotting檢測(cè)ΔNp63α、CK10、Inv、TG1、PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)水平 取轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照模擬物/抑制劑、miR-125b-5p模擬物/抑制劑的角質(zhì)形成細(xì)胞，RIPA冰上裂解20 min，用BCA蛋白分析試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè)。蛋白質(zhì)經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC)上。1×TBST洗滌后，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入TBST稀釋的一抗ΔNp63α(1∶1000)、CK10(1∶100)、Inv(1∶100)、TG1(1∶1000)、PI3K(1∶3000)、Akt(1∶3000)、mTOR(1∶3000)和β-actin(1∶1000)，4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔/鼠IgG二抗(1∶5000)室溫孵育1 h；洗膜后用ECL試劑盒發(fā)光顯影，然后用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.8miR-125b-5p與ΔNp63α結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站查詢miR-125b-5p和ΔNp63α的完整RNA序列，利用bibiserv(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/)在線網(wǎng)站對(duì)miR-125b-5p和ΔNp63α的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 28.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Games-Howell檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 皮膚分化相關(guān)標(biāo)志物和miR-125b-5p在氯化鈣誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞分化模型中的表達(dá)情況 qRTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，氯化鈣處理7 d時(shí)角質(zhì)形成細(xì)胞中CK10、Inv和TG1mRNA相對(duì)表達(dá)水平(分別為300.70±13.27、9.14±1.23、5.49±0.34)高于處理0 d(分別為1.10±0.11、1.02±0.23、1.00±0.08)、1 d(分別為2.13±0.45、1.21±0.21、1.33±0.04)和5 d(分別為11.90±2.10、5.86±1.03、2.61±0.11)時(shí)，且處理5 d時(shí)高于處理1 d時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1A)；氯化鈣處理5 d時(shí)miR-125b-5p相對(duì)表達(dá)水平(0.08±0.01)低于處理0 d(1.00±0.02)和1 d(0.17±0.02)時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001或P<0.05，圖1B)，但氯化鈣處理5 d與7 d(0.07±0.02)時(shí)miR-125b-5p相對(duì)表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 皮膚分化相關(guān)標(biāo)志物和miR-125b-5p在角質(zhì)形成細(xì)胞分化模型中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of skin differentiation-related markers and miR-125b-5p in keratinocyte differentiation model

2.2 氯化鈣處理對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞中ΔNp63α表達(dá)及PI3K/Akt/mTOR通路的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，氯化鈣處理1、5、7 d時(shí)角質(zhì)形成細(xì)胞中ΔNp63α mRNA相對(duì)表達(dá)水平均高于0 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.55±0.24、5.58±0.42、20.82±0.58vs. 1.01±0.23，P<0.01，圖2A)。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，與氯化鈣處理0 d時(shí)相比，氯化鈣處理5 d時(shí)角質(zhì)形成細(xì)胞中ΔNp63α陽(yáng)性細(xì)胞率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(96.9%±0.9%vs. 43.2%±8.2%，t=6.469，P<0.001，圖2B)。氯化鈣處理1 d(分別為2.28±0.05、1.66±0.04、1.77±0.22)、5 d(分別為4.37±0.22、2.42±0.05、2.47±2.22)和7 d(分別為12.77±0.59、2.88±0.20、4.39±0.33)時(shí)PI3K、Akt和mTORmRNA相對(duì)表達(dá)水平高于0 d(分別為1.00±0.11、1.03±0.05、1.00±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2C)。

圖2 氯化鈣促進(jìn)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中ΔNp63α的表達(dá)且激活PI3K/Akt/mTOR通路Fig.2 Calcium chloride promotes the expression of ΔNp63α and activates PI3K/Akt/mTOR pathway in keratinocyte

2.3ΔNp63α與miR-125b-5p的關(guān)系 bibiserv網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miR-125b-5p與ΔNp63α的3'-UTR區(qū)有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。

圖3 bibiserv網(wǎng)站預(yù)測(cè)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中miR-125b-5p與ΔNp63α的3'-UTR結(jié)合位點(diǎn)信息Fig.3 Prediction of 3'-UTR binding sites between miR-125b-5p and ΔNp63α by bibiserv website in keratinocyte

qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-125b-5p模擬物組ΔNp63α mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照模擬物組(mRNA：0.64±0.02vs. 1.00±0.01；蛋白：0.92±0.19vs. 1.22±0.20，P<0.05，圖4A、B)；miR-125b-5p抑制劑組ΔNp63α mR NA和蛋白表達(dá)水平均高于陰性對(duì)照抑制劑組(mRNA：1.79±0.13vs. 0.99±0.01；蛋白：0.78±0.09vs. 0.60±0.11，P<0.05，圖4C、D)。

圖4 皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中ΔNp63α與miR-125b-5p的關(guān)系Fig.4 Relationship of ΔNp63α with miR-125b-5p in keratinocyte

2.4miR-125b-5p轉(zhuǎn)染對(duì)角質(zhì)細(xì)胞中皮膚分化相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響 qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-125b-5p模擬物組CK10、Inv、TG1mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照模擬物組(P<0.05，圖5A)；miR-125b-5p抑制劑組CK10、Inv和TG1mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于陰性對(duì)照抑制劑組(P<0.05，圖5B)。

圖5 miR-125b-5p轉(zhuǎn)染對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中分化相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響Fig.5 Effect of miR-125b-5p transfection on the expression of skin differentiation-related markers in keratinocytes

2.5miR-125b-5p轉(zhuǎn)染對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR通路的影響 qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照模擬物組相比，miR-125b-5p模擬物組PI3K、Akt、mTORmRNA表達(dá)水平降低，PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6A)；與陰性對(duì)照抑制劑組相比，miR-125b-5p抑制劑組PI3K、Akt、mTORmRNA表達(dá)水平升高，PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6B)。

圖6 miR-125b-5p表達(dá)對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR通路的影響Fig. 6 Effects of miR-125b-5p expression on PI3K/Akt/mTOR pathway in keratinocytes

3 討 論

表皮再生和動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于維持正常皮膚功能非常重要，且表皮的形成伴隨著角質(zhì)形成細(xì)胞的分化、增殖和遷移。分化的基底層角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮細(xì)胞補(bǔ)充的主要來源[12]。角質(zhì)形成細(xì)胞的異常分化與銀屑病和特應(yīng)性皮炎等皮膚病相關(guān)，并與皮膚腫瘤的形成有關(guān)[13]。因此，研究角質(zhì)形成細(xì)胞的分化對(duì)理解皮膚疾病的發(fā)生具有重要意義。

近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與角質(zhì)形成細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等相關(guān)。Wang等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-744-3p可通過靶向KLLN抑制銀屑病中角質(zhì)形成細(xì)胞的分化。在皮膚表皮層分布的miR-155過表達(dá)可明顯抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的終末分化[15]。但miRNA調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞分化的相關(guān)研究較少。據(jù)報(bào)道，miR-125b-5p在部分癌癥中起到癌基因或抑癌基因的作用，這可能是由于miR-125b-5p在不同組織中的靶基因不同而導(dǎo)致的[16]。此外，Zheng等[17]發(fā)現(xiàn)，miR-125b-5p在銀屑病患者皮膚中呈低表達(dá)。Lu等[18]發(fā)現(xiàn)，miR-125b-5p在皮膚鱗癌中呈低表達(dá)。過表達(dá)miR-125b-5p可促進(jìn)皮膚鱗癌細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤的增長(zhǎng)。Tian等[19]也得到了相似的結(jié)果。同時(shí)，miR-125b-5p在口腔鱗癌、頭頸鱗癌、肺鱗癌和食管鱗癌中也呈低表達(dá)[20-22]。由此可見，miR-125b-5p可能在角質(zhì)形成細(xì)胞中作為一種抑癌基因而存在。本研究對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分化模型中miR-125b-5p的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p的表達(dá)水平隨著角質(zhì)形成細(xì)胞的分化而降低，推測(cè)miR-125b-5p可能參與角質(zhì)形成細(xì)胞的分化。本研究結(jié)果顯示，miR-125b-5p模擬物組CK10、Inv、TG1的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低，且轉(zhuǎn)染miR-125b-5p抑制劑后可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)，提示miR-125b-5p在角質(zhì)形成細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著重要作用。采用生物信息學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，miR-125b-5p可以與ΔNp63α的3'-UTR區(qū)結(jié)合。過表達(dá)miR-125b-5p可降低ΔNp63α mRNA和蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步表明miR-125b-5p抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的分化是通過下調(diào)ΔNp63α實(shí)現(xiàn)的。

ΔNp63α為p53家族的成員，在上皮組織分化和組織發(fā)育中發(fā)揮重要作用，且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ΔNp63α在皮膚鱗癌、宮頸癌、肺癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[23-24]。有研究發(fā)現(xiàn)，ΔNp63α表達(dá)水平與皮膚鱗癌患者的生存率呈負(fù)相關(guān)[23]。此外，ΔNp63α過度表達(dá)可促進(jìn)皮膚鱗癌的發(fā)生和發(fā)展[25]。King等[26]發(fā)現(xiàn)，ΔNp63α敲除小鼠的表皮不再生長(zhǎng)。Nylander等[27]發(fā)現(xiàn)，在p63敲除小鼠中過表達(dá)ΔNp63α可以恢復(fù)皮膚分化標(biāo)志物的水平，并維持上皮的完整性。上述研究表明，ΔNp63α在皮膚發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

此外，本研究證實(shí)，miR-125b-5p和ΔNp63α對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分化的作用可能與PI3K/Akt/mTOR通路有關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的分化[28-29]。Troiano等[30]發(fā)現(xiàn)，在皮膚鱗癌中ΔNp63α過表達(dá)與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路異常激活有關(guān)。因此，本研究評(píng)價(jià)miR-125b-5p和ΔNp63α對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分化的影響時(shí)，重點(diǎn)關(guān)注了PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的作用。結(jié)果表明，上調(diào)miR-125b-5p可降低角質(zhì)形成細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR通路mRNA、總蛋白及磷酸化蛋白的表達(dá)水平，而下調(diào)miR-125b-5p則促進(jìn)了PI3K/Akt/mTOR通路的激活，提示miR-125b-5p靶向ΔNp63α通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的分化。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，miR-125b-5p靶向ΔNp63α通過PI3K/Akt/mTOR通路抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的分化。該結(jié)果為理解皮膚疾病的發(fā)病機(jī)制提供了新的見解，并為表皮細(xì)胞生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。但本研究?jī)H在體外細(xì)胞水平證實(shí)miR-125b-5p對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分化的影響，且ΔNp63α調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞分化是否與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)尚無法證實(shí)。因此，體內(nèi)功能驗(yàn)證及ΔNp63α的潛在機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。