耐甲氧西林金黃色葡萄球菌殺白細胞素基因亞型的流行及MLST分子分型

毛劍鋒，張傳領，楚 旭

殺白細胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)是一種雙組分成孔毒素，能導致白細胞溶解和組織壞死[1-2]，常與嚴重的金黃色葡萄球菌皮膚軟組織感染和壞死性肺炎相關[3]。PVL編碼基因(包括LukS-PV和LukF-PV)內(nèi)部會發(fā)生變異，由于其527位核苷酸的單核苷酸多態(tài)性(A→G)導致176位的組氨酸(His176)被精氨酸(Arg176)所取代，根據(jù)這種氨基酸不同可將PVL分為H和R變異型[4]。除527位核苷酸變異外，其他位點變異情況也多有報道，目前已發(fā)現(xiàn)至少22個核苷酸位點的突變[5-6]。

盡管PVL對金黃色葡萄球菌疾病嚴重程度的作用已被公認[13]，但PVL亞型對蛋白質毒性和疾病結局的影響仍不清楚。分子模型研究表明，R亞型可能改變PVL編碼基因孔隙的形成，增加PVL的白細胞毒性[4]。更重要的是毒力相關基因突變除了增加細菌的分子多樣性外，還可能導致蛋白質功能的獲得或喪失。由于PVL在金黃色葡萄球菌疾病轉歸中的重要性[7]，了解PVL基因的結構和多樣性對于理解金黃色葡萄球菌的致病性和改進特異性治療藥物的靶點設計至關重要。因此，本研究旨在確定本地區(qū)臨床分離的金黃色葡萄球菌PVL基因亞型的分布，并了解其分子特性。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 287株MRSA來自于我院各臨床科室送檢的血液、尿液、痰液、膿液、傷口分泌物、耳道分泌物、無菌體液等標本，已剔除同一患者相同部位來源菌株。所有菌株經(jīng)VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行菌種鑒定，根據(jù)美國臨床和實驗室標準委員會(CLSI)推薦的方法，采用頭孢西丁紙片法，若抑菌圈直徑≤21 mm初步判斷為MRSA，再以PCR擴增mecA基因進行分子確認，引物序列參照文獻[8]。上述菌株保存于30%甘油肉湯，-70 ℃冰箱備用。ATCC 49775(陽性質控)和MRSA N315(陰性質控)為上海市第一人民醫(yī)院劉慶中博士饋贈。

1.2 主要儀器和試劑 VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定儀為法國Bio-Merieux公司產(chǎn)品，EPS-100電泳儀為上海天能科技有限公司產(chǎn)品，GeneAmp PCR System 9600為美國ABI公司產(chǎn)品(Applied Biosystems)，Lysostaphin為日本TaKaRa公司產(chǎn)品，UV-3B紫外成像儀為珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司產(chǎn)品，Premix Taq Version 2.0及DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司，引物合成及PCR擴增產(chǎn)物測序委托上海生物工程有限公司完成。

1.3 研究方法

1.3.1 感染類型判斷 按照美國CDC的CA-MRSA定義：患者在社區(qū)或入院48 h內(nèi)分離到MRSA菌株；1年內(nèi)無住院或與醫(yī)療機構接觸史；沒有留置各種導管及其他穿刺皮膚的醫(yī)用裝置[9]，同時具有以上條件者可做出CA-MRSA感染的臨床診斷。根據(jù)此定義將臨床分離的MRSA菌株分為CA-MRSA和HA-MRSA。

1.3.2 MRSA基因組DNA制備 采用細菌基因組DNA提取試劑盒(美國 Axygen)提取MRSA菌株的基因組DNA，紫外分光光度法測定其濃度和純度[10]。

1.3.3pvl基因檢測與序列分析 采用文獻報道的pvl基因PCR引物，上游引物序列：5′-ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA-3′(luk-PV-1)，下游引物序列:5′-GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC3′ (luk-PV-2)[11]。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR總體積25 μL，反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min,30 個循環(huán);72 ℃ 10 min (GeneAmp PCR System 9600,美國ABI)。采用溴化乙錠預染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳、UV-3B紫外成像儀和凝膠成像系統(tǒng)檢測并分析PCR產(chǎn)物,目的擴增片段長度為433 bp。經(jīng)上述檢測符合要求的PCR擴增產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司測序,采用在線BLAST軟件分析測序結果并確定其基因型。

1.3.4pvl基因亞型確認 根據(jù)Boakes等[5]方法，設計了3對引物，分別擴增出3個片段(核苷酸長度分別為654、718和680)。所有PCR擴增產(chǎn)物均由上海生工生物工程有限公司進行雙向測序，測序結果參照O’Hara等[4]方法判斷亞型。

1.3.5 CC克隆分型 參考Enright等[12]方法分型，PCR擴增7個管家基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpiand、yqiL)，產(chǎn)物雙向測序，根據(jù)MLST數(shù)據(jù)庫(http://www.mlst.net)分析確定其類型(STs)；MLST克隆型別(MLST-CCs)通過網(wǎng)絡eBURST (enhanced based upon related sequence types)程序進行(http://eburst.mlst.net/)。

1.4 統(tǒng)計學方法 分析相關數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件分析，兩組數(shù)據(jù)進行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1pvl+MRSA檢出率 287株MRSA中，51株為pvl+菌株(17.8%，51/287)，其中29株為CA-MRSA(56.9%，29/51)，22株為HA-MRSA(43.1%，22/51)。

2.2pvl亞型分型 對51株MRSA的pvl基因擴增產(chǎn)物雙向測序，共發(fā)現(xiàn)4個位點(lukS序列的527和663位點，lukF序列的1 396和1 729位點)存在核苷酸的變異(圖1)，核苷酸527位的突變導致176位的組氨酸(His)被精氨酸(Arg)取代，根據(jù)氨基酸的變化將pvl分為R和H亞型。除527位點發(fā)生變異外，再根據(jù)1 396和663位點是否發(fā)生變異細分為H1(GenBank：EF571669)和H2(GenBank：EF571668)；USA300屬于R亞型，根據(jù)1 729位點是否發(fā)生變異分為R1(GenBank：EF571829)和R2亞型(GenBank：EF571830)(表1)。本資料51株pvl+MRSA中，90.2% (46/51)的菌株屬于H亞型(6株H1、40株H2)，而R型僅占9.8% (5/51)(1株R1、4株R2)(圖1)。

圖1 51株臨床分離MRSA pvl基因序列變異分布Fig.1 Sequence variants of lukSF-PV observed in 51 MRSA clinical isolates

2.3 MLST分子分型 51株pvl+MRSA共分成11種STs，經(jīng)eBURST軟件分析11種STs型屬于7種CCs。最主要的流行株為CC59 (ST59/338)，占68.6%(35/51)，其次為CC22(ST22/217)(9.8%,5/51)、CC88(ST88)(5.9%,3/51)、CC5(ST25/149)、CC1(ST1/188)(5.9%,3/51)、CC9 (ST9)、CC30 (ST30)(2.0%,1/51)。46株H型菌株的主要克隆型為CC59，占69.6%(32/46)，其次為CC22和CC1，占10.9%和6.5%；5株R型菌株的主要克隆型為CC59，占60%(3/5)，其余為CC88和CC5(表2)。

表1 pvl基因亞型核苷酸位點突變及相關氨基酸的非同義替換Tab.1 Nucleotide site mutations of PVL gene subtypes and nonsynonymous substitution of related amino acids

2.4 MRSA感染類型 51株pvl+MRSA菌株中，29株CA獲得株 (56.9%，29/51)和22株HA獲得株 (43.1%，22/51);CA獲得株中H亞型25株 (86.2%,25/29)，R亞型4株 (13.8%,4/29)；HA獲得株中H亞型21株 (95.5%,21/22)，R亞型1株 (4.5%,1/22)，CA株和HA株攜帶的pvl均以H亞型為主，分別占86.2%(25/29)和95.5%(21/22)，兩組差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.390，P>0.05)(表2)。

表2 pvl亞型的感染類型及CCs克隆型別Tab.2 Infection types of PVL subtypes and clonal types of CCS

3 討 論

自1932年PVL從金黃色葡萄球菌中首次分離以來，關于PVL的研究遍及全球。MRSA的pvl基因攜帶率在不同地區(qū)的報道有所差異[13-14]：阿富汗高達59.2%，加拿大亦有30.1%，而日本僅13.5%。我們的檢測結果顯示，本地區(qū)MRSA的pvl基因攜帶率為17.8%(51/287)，低于北京地區(qū)和福建地區(qū)的報道[15-16]，但明顯高于本省其他城市，如紹興地區(qū)為15.5%，溫州地區(qū)僅7.4%[17-18]。究其原因，可能與省會城市杭州人口密度高、旅游業(yè)發(fā)達帶來的人口流動幅度大，環(huán)境衛(wèi)生易處于高污染水平有關。

pvl基因在金黃色葡萄球菌中的作用已明確[7]。然而，不同亞型對PVL毒性的影響尚不清楚。O’Hara FP等[4]提出176位核苷酸的非同義替換而導致的R亞型可能會增加PVL的白細胞毒性。而另外一些學者認為，R和H亞型可能具有相同的誘導孔形成和白細胞毒性的能力[19]。近期，巴西學者[20]發(fā)現(xiàn)分離自新生兒血液的H2b亞型pvl+USA1100/ST30/CC30菌株表達的PVL毒素量是其他譜系的5倍，這一結果強調(diào)了進一步研究PVL亞型的分布及其克隆譜系的重要性。目前，世界范圍內(nèi)已有PVL亞型分布的報道,不同地區(qū)的作者已經(jīng)證明了PVL之間的相關性亞型、金黃色葡萄球菌譜系及其在全球的地理分布[4-6]。一般來說，R亞型主要與USA300有關，金黃色葡萄球菌譜系廣泛分布于美國[21]，而H亞型與來自亞洲等非美國地區(qū)的其他克隆型別的金黃色葡萄球菌有關，如CCs 1、5、6、22、25、30、59、88和121[4,6,19]。在來自四大洲的52株金黃色葡萄球菌CC30PVL分離株中分離出H1、H2/H2a、H2b、H2c、H2d、R1、R2和R3 PVL亞型。巴西學者[20]分析了39株金黃色葡萄球菌的四個不同克隆譜系(STs/CC1、5、8和30)中的LukSF-PVL基因，發(fā)現(xiàn)了一種新的H亞型并命名為H2e。然而，到目前為止，關于我國金黃色葡萄球菌PVL基因亞型的情況還少見報道。筆者首次在杭州地區(qū)收集pvl+MRSA進行亞型分析，共發(fā)現(xiàn)有4個位點(lukS序列的527和663位點，lukF序列的1 396和1 729位點)存在核苷酸變異，根據(jù)其中氨基酸的變化將pvl分為R和H亞型，再根據(jù)變異位點不同將亞型進一步細分。研究結果顯示，51株pvl+MRSA中，90.2%(46/51)的菌株屬于H亞型，其中又以H2亞型為主(6株H1、40株H2)，而R亞型僅占9.8% (5/51)(1株R1、4株R2)，說明本地區(qū)臨床分離MRSA攜帶的pvl基因以亞洲流行的H亞型(H2)為主。這一結果與上述文獻報道相似。

分子生物學分型對分析菌株的同源性和遺傳背景，明確暴發(fā)流行菌株的基因型并推斷擴散趨勢具有十分重要的意義。在世界不同地區(qū)，攜帶pvl的優(yōu)勢克隆譜系有所不同[22]：亞洲以ST59(CC59)克隆為主，非洲以ST88(CC88)克隆為主，ST80(CC80)主要在歐洲流行，大洋洲常見ST30(CC30)克隆，ST22(CC22)克隆主要流行于印度，而美國以ST8(USA300)克隆為主。本資料顯示，pvl陽性的克隆型別以ST59(CC59)為主(68.6%，35/51)，與亞洲流行型別克隆一致。并且由表2可見，無論是H亞型還是R亞型，其在pvl+MRSA的分離株均以CC59為主，分別占69.6%(32/46)和60.0%(3/5)。因本研究中R亞型的數(shù)量較少，而要明確pvl亞型分子型別的流行特征，有必要分離更多的菌株進一步深入研究。

有研究認為[23]，pvl基因是CA-MRSA的特征性分子，而在HA-MRSA中少見。但越來越多學者發(fā)現(xiàn)，pvl+MRSA在社區(qū)感染患者和醫(yī)院感染患者中均有檢出[14，24]。本資料51株pvl+MRSA菌株中，29株為CA獲得株(56.9%，29/51)，22株為HA獲得株(43.1%，22/51)，提示CA-MRSA克隆已經(jīng)播散到醫(yī)院環(huán)境并引起醫(yī)院獲得性相關感染。然而，關于CA-MRSA和HA-MRSA兩者間pvl亞型分布差異的報道較少，我們的資料中，CA獲得株中H亞型25株 (86.2%,25/29)，HA獲得株中H亞型21株 (95.5%,21/22)，表明本地區(qū)CA-MRSA和HA-MRSA攜帶的pvl均以H亞型為主，兩組差異無統(tǒng)計學意義。

綜上所述，目前國內(nèi)關于金黃色葡萄球菌pvl基因的亞型分布還鮮有報道。本研究首次明確杭州地區(qū)臨床分離MRSA攜帶的pvl以H亞型(H2)為主，主要克隆型別為CC59，CA-MRSA和HA-MRSA攜帶的pvl亞型沒有明顯差異，這有助于更好地了解本地區(qū)pvl+金黃色葡萄球菌菌株的分子流行病學和進化特征，為該類菌株的防控提供臨床數(shù)據(jù)。