屋塵螨8類變應(yīng)原(Der p 8)克隆表達(dá)、純化及免疫原性鑒定

劉慧婷，袁如意，陳獻(xiàn)雄，劉曉宇

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平的提高，越來越多的人遭受過敏性疾病的困擾。過敏性疾病發(fā)病率在全球呈上升趨勢(shì)，是重要的世界衛(wèi)生問題。而塵螨是引起許多過敏性疾病的重要過敏原之一，現(xiàn)研究證明與塵螨過敏原相關(guān)的過敏性疾病有許多，如過敏性哮喘、過敏性鼻炎和過敏性皮炎等[1-3]。居室內(nèi)的優(yōu)勢(shì)螨類主要有屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus,Derp)和粉塵螨(Dermatophagoidesfarina,Derf)，研究表明屋塵螨在溫帶以及熱帶的沿海、濕潤(rùn)地區(qū)有較多的分布，是室內(nèi)塵螨過敏原中多種過敏原的主要來源[4]。目前臨床上治療過敏主要應(yīng)用過敏原特異性免疫治療(Allergen-specific immunotherapy,ASIT)，以改變疾病的進(jìn)程，然而ASIT制劑多是過敏原、非過敏原和其他蛋白質(zhì)的混合物，且大部分過敏患者對(duì)于不同塵螨過敏原呈現(xiàn)交叉反應(yīng)，難以完全標(biāo)準(zhǔn)化，可能引起嚴(yán)重的副作用[5-6]。目前研究者致力于開發(fā)重組過敏原，重組或純化的天然變應(yīng)原代替天然提取物，能有效還原原有的免疫原性，使得過敏治療更加安全有效[7-8]。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases,GSTs)是一類生物廣泛存在的解毒酶家族，其作用是催化谷胱甘肽(GSH)與多種親電子化合物的結(jié)合，保護(hù)生物大分子免受親電試劑的氧化破壞攻擊[9]。因其可能與宿主的免疫反應(yīng)以及寄生蟲對(duì)藥物的耐藥性有關(guān)，已在許多寄生蟲中進(jìn)行了研究[10-12]。此前已有研究克隆表達(dá)了與GSTs具有很大同源序列的過敏原Der p 8，并鑒定了它的過敏原性[10]，但國(guó)內(nèi)未見對(duì)GSTs基因及其蛋白特征的相關(guān)報(bào)道?？紤]到不同地域的過敏原之間可能存在差異性，有必要對(duì)其變化性和差異性進(jìn)行研究。因此，本實(shí)驗(yàn)希望通過對(duì)屋塵螨Der p 8蛋白的克隆、表達(dá)及純化，并鑒定重組蛋白的免疫原性，分析其同源性，為臨床上塵螨過敏性疾病的特異性診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 螨、載體和菌株 屋塵螨為本實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)，表達(dá)載體為pET-32a，表達(dá)菌株為大腸埃希菌BL21(DE3)。

1.1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)材料 RNA提取試劑盒和核酸膠回收試劑盒(QIAGEN，奧格生物技術(shù)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(生工生物工程股份有限公司)，質(zhì)粒DNA 提取試劑盒和 DNA 膠純化試劑盒(美國(guó)OMEGA公司)；T載體、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ及XhoⅠ(Takara，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；鎳離子親和層析柱，Mouse anti human IgE-HRP(美國(guó)Southem Biotech公司)，其余試劑為國(guó)產(chǎn)、進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 血清 Western blotting所用血清取自廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科Der p IgE陽性患者。

1.2 方 法

1.2.1 塵螨飼養(yǎng) 收集室內(nèi)塵樣本，根據(jù)屋塵螨形態(tài)學(xué)特征，顯微鏡下挑取雌雄各半的屋塵螨，放在裝有塵螨飼料的培養(yǎng)瓶中濕度(70±2)%、溫度(25±2)℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)3個(gè)月，再進(jìn)行收集純屋塵螨。

1.2.2 塵螨鑒定 稱取1 g塵螨用液氮研磨，研磨好的粉末PBS溶解冰上搖2 h，8 000 r/min離心30 min。上清取樣進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.2.3 設(shè)計(jì)引物 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中Der p 8的核酸序列信息，利用GeneTool軟件設(shè)計(jì)合適引物，引物交由生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.4 提取屋塵螨總RNA和RT-PCR擴(kuò)增 按照說明書，將凍存的屋塵螨于液氮中研磨至粉狀后按RNA提取試劑盒(QIAGEN公司)說明書提取屋塵螨總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄引物，以提取出的總RNA為模板，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增(反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min)，得到屋塵螨的cDNA。

1.2.5 PCR擴(kuò)增及其克隆產(chǎn)物的鑒定 以合成的cDNA為模板，根據(jù)設(shè)計(jì)的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共 31 個(gè)循環(huán)，再以72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳鑒定，膠回收并連接至T載體，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌(E.coliTop10)，涂板培養(yǎng)15 h，挑選合適的菌落37 ℃搖菌過夜培養(yǎng)，取樣送至公司測(cè)序。

1.2.6 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒和重組表達(dá)菌 將測(cè)序正確的菌液于37 ℃搖菌過夜培養(yǎng)(LB培養(yǎng)液)，提取質(zhì)粒用BamHⅠ及XhoⅠ雙酶切，核酸電泳后膠回收。連接產(chǎn)物與表達(dá)載體pET-32a得到重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌(E.coliTop 10)中，培養(yǎng)后取樣重復(fù)測(cè)序一次，測(cè)序正確后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.7 誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白Der p 8 鑒定正確后的序列轉(zhuǎn)入表達(dá)菌大腸埃希菌BL21(DE3)中，涂板培養(yǎng)，挑選合適的菌落接種于LB50 mL+AMP50 μL(LB∶AMP=1 000∶1)液體培養(yǎng)基中，37 ℃振搖(150 r/min)過夜培養(yǎng)。第2 d于新鮮液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)(OD600=0.6～0.8)，應(yīng)用1 mmol/L的誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。4～5 h后離心棄上清，菌體用平衡液重懸。菌液冰上超聲破碎、4 ℃離心后，收集上清及沉淀，取部分進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以檢測(cè)Der p 8的表達(dá)情況。

1.2.8 親和層析法純化重組蛋白Der p 8 將收集到的沉淀于6 mol/L鹽酸胍中混勻，超聲破碎15 min，于4 ℃放置過夜，離心(10 000 r/min)20 min后棄沉淀取上清。將上清上樣至用平衡緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl)預(yù)平衡好的鎳-氨三乙酸親和層析柱(Ni-NTA)上，上樣速度為2 mL/min。上樣后，用平衡緩沖液平衡10倍柱體積，然后分別用低濃度咪唑(40 mmol/L)和高濃度咪唑(300 mmol/L)的平衡緩沖液洗脫雜質(zhì)蛋白和目的蛋白Der p 8，取部分高濃度咪唑的洗脫液用于SDS-PAGE電泳。純化后的重組蛋白保存于-20 ℃冰箱。

1.2.9 Western blotting鑒定重組蛋白Der p 8免疫原性 SDS-PAGE電泳將純化后的Der p 8重組蛋白分離，轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜(PVDF膜)上，室溫下將膜于5% BSA+TBS中孵育2 h，以Der p IgE陽性患者的血清作為一抗，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgE(Mouse anti human IgE-HRP)作為二抗孵育，TBST 將膜清洗5次后，加入化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色，根據(jù)顯色結(jié)果鑒定Der p 8重組蛋白的免疫原性。

1.2.10 生物信息學(xué)分析Derp8基因 將本實(shí)驗(yàn)得到的Derp8基因(圖5)與NCBI中公布的Derp8序列進(jìn)行比對(duì)，比較兩者的同源性。

2 結(jié) 果

2.1 Der p 8重組表達(dá)載體的鑒定 將測(cè)序正確的Der p 8重組質(zhì)粒用BamHⅠ及XhoⅠ雙酶切，進(jìn)行核酸電泳。結(jié)果顯示目的基因的分子量約為700 bp，與Der p 8 的cDNA片段大體一致，證明Der p 8重組表達(dá)載體成功構(gòu)建(圖1)。

注：M為DNA marker：1為PET-32a-Der p 8重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果。圖1 重組Der p 8質(zhì)粒酶切后瓊脂糖電泳結(jié)果Fig.1 Identification of Der p 8 cDNA

2.2 Der p 8的大量表達(dá) 用1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白Der p 8的表達(dá)，誘導(dǎo)前后Der p 8重組蛋白產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE電泳(圖2)。結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的菌液中，在分子量約 38 kDa 處可見明顯的條帶，與 Der p 8預(yù)期分子量相近。根據(jù)誘導(dǎo)后的上清液和沉淀電泳結(jié)果，誘導(dǎo)后沉淀有較明顯條帶而上清未見明顯條帶，且樣品未做鹽酸胍溶解處理，因此可知Der p 8重組蛋白為包涵體。

注：M為蛋白marker；1為誘導(dǎo)前菌液；2為誘導(dǎo)后菌液；3為誘導(dǎo)后上清液；4為誘導(dǎo)后沉淀。圖2 不同誘導(dǎo)時(shí)間Der p 8基因產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of Der p 8 gene products

2.3 Der p 8重組蛋白的純化鑒定 用1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白Der p 8的表達(dá)，經(jīng)親和層析法純化后，取部分進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示分子量約38 kD處可見一清晰蛋白條帶，而其余分子量處未見條帶，純化純度較高。該蛋白條帶的分子量與Der p 8重組蛋白預(yù)計(jì)分子量相符(圖3)。

注：M為蛋白marker；1為純化后的Der p 8蛋白。圖3 純化的Der p 8蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of purified Der p 8 protein

2.4 Der p 8重組蛋白的免疫原性鑒定 以Der p IgE陽性患者血清為一抗，以Mouse anti human IgE-HRP為二抗進(jìn)行Western blotting。結(jié)果顯示在38 kD處可見一明顯條帶，提示Der p 8重組蛋白能與Der p IgE陽性患者血清中IgE特異性結(jié)合，證明其具有免疫原性(圖4)。

注：M為蛋白marker；1為純化后的 Der p 8蛋白。圖4 Western blotting檢測(cè) Der p 8蛋白的表達(dá)Fig.4 Western blotting detection of the expression of Der p 8 protein

2.5Derp8基因的同源性分析 將酶切鑒定陽性的重組質(zhì)粒測(cè)序，得到的基因序列如圖5所示。將序列與NCBI基因庫(kù)中的塵螨Derp8基因序列(GenBank:S75286.1)進(jìn)行比對(duì)，兩者相似性為76.97%(圖6)。

2.6Derp8的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 將得到的Derp8基因序列與NCBI基因庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，將相似序列以Fasta格式輸出，用MEGA 7.0構(gòu)建分子進(jìn)化樹；分析可知，其基因序列與屋塵螨的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因序列最相近(Dermatophagoidespteronyssinus,GenBank:S75286.1)，推測(cè)其功能相似；此外，通過分子進(jìn)化樹可知，屋塵螨與粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae,KC305499.1)、綿羊癢螨(Psoroptesovis,GenBank:AF078684.2)的親緣關(guān)系較近(圖7)。

3 討 論

塵螨是引起多種過敏性疾病的重要過敏原之一，而屋塵螨在亞熱帶和熱帶國(guó)家具有重要臨床意義，哮喘或其他過敏患者對(duì)屋塵螨過敏原的致敏率可高達(dá)80%～90%[4]。因而對(duì)其重要變應(yīng)原成分的免疫學(xué)、分子生物學(xué)特性進(jìn)行深入研究，有助于臨床診療。目前臨床采用ASIT療法，通過反復(fù)給過敏患者注射特定的過敏原，形成對(duì)過敏原的免疫耐受，從而減少過敏原暴露后的癥狀[13]。隨著重組技術(shù)的發(fā)展，重組過敏原替代粗提取物進(jìn)行脫敏治療成為可能，如治療白楊花粉和草花粉過敏的重組低過敏原以及野生型重組過敏原[14-15]。此外，重組過敏原還廣泛應(yīng)用于基于分子的過敏診斷，如蛋白質(zhì)微陣列或懸浮陣列[16]。

塵螨過敏原重組疫苗的研究也取得了新的進(jìn)展。Chen等設(shè)計(jì)的Der p 1-Der p 2融合蛋白在動(dòng)物體內(nèi)能有效降低過敏原性，并誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性IgG抗體，抑制1組和2組過敏原過敏患者的IgE活性[17]。Hesse等的研究顯示在小鼠體內(nèi)應(yīng)用純化的屋塵螨過敏原Der p 1和Der p 2進(jìn)行皮下免疫治療，在抑制Th2細(xì)胞和塵螨誘導(dǎo)的肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞激活相較粗塵螨提取物具有明顯的優(yōu)越性。這顯示純化后的塵螨過敏原有可能提高皮下免疫治療的臨床療效[18]。

圖5 Der p 8的cDNA序列Fig.5 cDNA sequence of Der p 8

圖6 Der p 8基因的同源性分析Fig.6 Homology analysis of the Der p 8 gene

圖7 Der p 8的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.7 Phylogenetic tree analysis of Der p 8

O’Neill等的研究發(fā)現(xiàn)塵螨表達(dá)的與GSTs具有很大同源序列的過敏原Der p 8能與40%的塵螨過敏患者血清中特異性IgE結(jié)合，40%中有一半以上的反應(yīng)是正常對(duì)照組的10倍[19]。本實(shí)驗(yàn)克隆的Derp8序列與GenBank上的基因序列進(jìn)行比對(duì)，具有76.97%的同源性，表明國(guó)外所報(bào)道的屋塵螨過敏原Derp8基因序列與中國(guó)地區(qū)屋塵螨過敏原Derp8基因序列存在一定的地區(qū)差異性?；诓煌貐^(qū)變應(yīng)原的基因多樣性，建立高效表達(dá)重組過敏原Der p 8的表達(dá)載體，并對(duì)其進(jìn)行大量表達(dá)和純化，對(duì)研制純度較高的重組變應(yīng)原疫苗以及分子免疫診斷仍有一定意義。

本研究提取了屋塵螨總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增后將其連接至表達(dá)載體PET-32a，經(jīng)雙酶切鑒定和測(cè)序后，顯示所克隆序列為目的基因片段，導(dǎo)入到表達(dá)菌大腸桿菌BL21(DE3)。經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)表達(dá)及鎳柱親和層析法的純化，結(jié)果顯示誘導(dǎo)的重組蛋白Der p 8成功地大量表達(dá)，Western blotting分析顯示重組蛋白Der p 8具有良好的免疫原性。隨著過敏性疾病發(fā)病率的上升，人們對(duì)其診斷和治療的需要程度也越來越高，因此過敏性疾病的特異性診斷和治療需要作出更多改變和突破。本實(shí)驗(yàn)所克隆的Der p 8重組蛋白經(jīng)檢驗(yàn)具有較強(qiáng)的免疫原性，一方面可應(yīng)用于塵螨過敏性疾病的特異性診斷，另一方面應(yīng)用于塵螨過敏的特異性免疫治療，為制作重組的過敏原疫苗奠定基礎(chǔ)。