MYB基因家族在桃不同育性品種中的表達模式分析

萬淑媛，李 琴，趙彩平

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

桃是我國最重要的落葉果樹之一，花粉不育品種在我國桃生產(chǎn)中大量應(yīng)用，如沙紅、安農(nóng)水蜜、八月脆、川中島白桃等，均是我國桃的主栽品種?；ǚ蹟∮贩N在栽培時需要配置授粉樹才能保證果實產(chǎn)量，且易受花期不良氣候的影響而導(dǎo)致減產(chǎn)。目前，科研人員在桃花粉不育方面已開展了一些研究，在細胞學(xué)方面，桃花粉不育主要表現(xiàn)為花粉母細胞發(fā)育異常，絨氈層細胞體積增大，導(dǎo)致出現(xiàn)花藥空囊、花粉空粒、花粉形態(tài)正常但生活力低等不育表現(xiàn)[1-3]；在花粉不育的遺傳定位方面，研究者利用SSR、RFLP、SNP等分子標記將花粉不育基因Ps(pollen sterility)定位在桃第6號染色體上[4-7]。Eduardo等[8]通過傳統(tǒng)制圖方法，利用重測序數(shù)據(jù)將Ps基因精細定位到近160 kb的區(qū)間，并推測Prupe.6G024900為花粉不育的關(guān)鍵候選基因。Huang等[9]篩選到位于第6號染色體的PpABCG26含有顯著的SNP標記，推測該基因是控制桃花粉不育的候選基因。此外，Rios等[10]對不同休眠階段的桃花蕾進行轉(zhuǎn)錄組測序，分析預(yù)測了參與桃花粉不育的相關(guān)基因。但關(guān)于桃花粉不育的分子機制還有待進一步明確。

MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、細胞周期、代謝及逆境反應(yīng)等調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。MYB轉(zhuǎn)錄因子含有一段高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由1～4個不完全重復(fù)的氨基酸序列(R)組成，根據(jù)R序列的數(shù)量和位置，MYB轉(zhuǎn)錄因子分為1R-MYB(MYB-related)、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB等4類[11-13]。已有大量研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物花粉發(fā)育調(diào)控中起關(guān)鍵作用。在擬南芥中，AtMYB80在絨氈層和小孢子中表達，通過調(diào)控絨氈層細胞程序性死亡從而控制花粉育性[14]；TDF1突變可導(dǎo)致花藥發(fā)育過程中絨氈層的功能障礙，小孢子從四分體中釋放失敗，從而導(dǎo)致花粉不育[15]；AtMYB99也在絨氈層細胞中表達，通過與AtMYB24、AtMYB21形成三聚體，調(diào)控苯丙烷類物質(zhì)的生物合成，進而影響花粉壁的形成[16]。此外，擬南芥中的AtMYB32突變和過表達均會引起雄性不育，其功能可能也是通過改變苯丙烷代謝而影響花粉發(fā)育[17]。棉花GhMYB24、小白菜BcMF28均在調(diào)控花粉發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[18-19]。蘋果MdMYB39L通過調(diào)控己糖吸收、細胞壁形成和與小孢子發(fā)生相關(guān)的靶基因，參與蘋果雄蕊發(fā)育和花粉管生長[20]。同樣，OsCSA通過調(diào)控水稻雄性生殖生長過程在糖分配相關(guān)基因的表達來影響花粉發(fā)育[21]。除此之外，MYB轉(zhuǎn)錄因子還可通過參與茉莉酸、生長素、赤霉素等途徑調(diào)控相關(guān)基因的表達，從而影響花藥發(fā)育[17,22-23]。但綜觀現(xiàn)有研究，關(guān)于MYB轉(zhuǎn)錄因子是否涉及桃花粉不育的調(diào)控尚未見報道。為此，本研究以桃不育品種沙紅和可育品種紅芙蓉不同發(fā)育時期的花芽為材料，比較觀察其花藥形態(tài)特征，在前期通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選出差異表達的MYB基因家族成員的基礎(chǔ)上，分析這些差異表達的MYB基因家族成員與已報道的同花粉育性相關(guān)的MYB基因的親緣關(guān)系，并通過qRT-PCR檢測花粉發(fā)育過程中MYB轉(zhuǎn)錄因子表達量變化的差異，旨在鑒定與桃雄性不育相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子，為探究桃花粉不育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為桃花粉不育品種沙紅和可育品種紅芙蓉，在盛花前30，24，18和15 d(分別對應(yīng)S1、S2、S3和S4時期)，采集其花芽及盛花期花蕾。所有樣品均采自西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院園藝場。

1.2 桃不同育性品種花藥形態(tài)觀察

取采集到的不同發(fā)育時期的花芽，剝除芽鱗，切除多余的組織后解剖出花藥，置于體視熒光顯微鏡(Leica MZ10F)下，觀察比較花藥形態(tài)并拍照。

1.3 桃不同育性品種花芽轉(zhuǎn)錄組測序

采集沙紅和紅芙蓉S1～S3時期的花芽，每個時期3個生物學(xué)重復(fù)。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行cDNA文庫構(gòu)建，用Illumina Novaseq 6000測序平臺測序，將獲得的各樣品質(zhì)控后的序列(clean reads)與桃基因組(ftp://ftp.bioinfo.wsu.edu/species/Prunus_persica/Prunus_persica-genome.v2.0.a1)進行序列比對，獲得能比對到基因組上的數(shù)據(jù)(mapped data)，以FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)值計算基因的表達量。

1.4 MYB基因家族差異表達成員的鑒定

通過美吉生物云平臺，對桃不同育性品種進行差異基因表達分析，鑒定出差異表達基因。采用方法為DESeq2，篩選標準為：多重檢驗校正后的P值(P-adjust)<0.5，差異倍數(shù)(fold change)≥2。利用前人以MYB結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PF00249)檢索并提交至NCBI和InterProScan驗證后，鑒定得到的256個桃MYB成員[24]，與差異表達基因進行韋恩分析，篩選出差異表達的MYB家族成員；通過層級聚類對篩選出的在桃花芽中差異表達的MYB家族成員進行聚類分析，并根據(jù)其FPKM值繪制熱圖。

1.5 MYB基因家族的系統(tǒng)進化分析

根據(jù)前人研究報道的與花粉育性相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子(表1)，通過NCBI、TAIR等數(shù)據(jù)庫共獲得擬南芥、水稻等物種的28條與花粉育性相關(guān)的MYB蛋白序列。利用MEGA6軟件，對桃花芽發(fā)育過程中差異表達的MYB轉(zhuǎn)錄因子與其他物種的MYB蛋白序列進行多重比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。構(gòu)建方法為最大似然法，蛋白替換模型為LG+G，bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000。

表1 28條與花粉育性相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子Table 1 The 28 MYB transcription factors related to pollen fertility

表1(續(xù)) Continued table 1

1.6 桃部分MYB基因在不同育性品種中相對表達量的比較

為了進一步驗證上述MYB基因家族成員在桃花粉發(fā)育中的調(diào)控作用，選擇Prupe.3G046900、Prupe.1G551400、Prupe.4G192000、Prupe.1G323400、Prupe.1G273900和Prupe.2G192100等6個表達趨勢可能與育性相關(guān)并且與其他物種同源性較高的成員，在桃不同育性品種中進行qRT-PCR分析。利用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生物)提取紅芙蓉和沙紅S1～S3時期花芽的總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度計(ThermoNanoDrop 2000，USA)檢測RNA的完整性和濃度。使用EvoM-MLVRT Kit with gDNA Clean反轉(zhuǎn)錄試劑盒(艾科瑞生物)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過Primer Premier 6軟件設(shè)計特異性引物(表2)，利用CFX Connect Real-Time System實時定量PCR儀(Bio-Rad, USA)，以桃PrupeTUA5和PrupeCYP2為內(nèi)參基因，使用SYBR Green Pro Taq HS Premix (2×)實時熒光定量試劑盒(艾科瑞生物)進行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系與反應(yīng)程序參照說明書設(shè)置，以2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

表2 用于桃部分MYB基因相對表達量測定的實時熒光定量PCR引物Table 2 qRT-PCR analysis primers for relative expression of MYB gene in peach

2 結(jié)果與分析

2.1 不同育性桃品種花藥的比較

對桃可育品種紅芙蓉和不育品種沙紅不同發(fā)育時期的花藥進行觀察比較，結(jié)果(圖1)表明，隨著花藥的發(fā)育，紅芙蓉花藥體積逐漸增大，從S1～S4時期，花藥顏色由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榻瘘S色，花藥表面由透明狀變?yōu)榘胪该鳡?，且有明顯增厚；相比之下，沙紅的花藥體積雖有所增大，但花藥顏色略發(fā)白，在S3時期之后，花藥較可育品種干癟，表面增厚不明顯。

圖1 紅芙蓉和沙紅不同發(fā)育時期的花藥形態(tài)Fig.1 Anther morphology of Hongfurong and Shahong at different developmental stages

除此之外，由盛花期花器官觀察結(jié)果(圖1)可知，紅芙蓉成熟花藥飽滿且體積較大，最終呈橙紅色；而沙紅成熟花藥的體積明顯小于紅芙蓉，且顏色為淡黃色。

2.2 桃MYB基因家族差異表達成員分析

Zhang等[24]對桃MYB基因家族成員進行鑒定，共鑒定到256個桃MYB基因。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，有233個MYB基因家族成員在桃花芽中表達；多重檢驗校正后,當P值<0.5、差異倍數(shù)≥2時，有39個MYB基因家族成員在桃不同育性品種中差異表達。根據(jù)39個差異表達MYB家族成員的FPKM值繪制聚類熱圖，結(jié)果(圖2)顯示,所有差異表達的MYB家族成員被分為3簇，其中簇1中的MYB基因普遍在紅芙蓉中高表達，尤其在S3時期的表達量顯著高于沙紅。簇2中的MYB家族成員基因普遍在沙紅中的表達量較高，且在S3時期表達量顯著高于紅芙蓉，其中Prupe.1G405300和Prupe.1G405400在沙紅花粉發(fā)育的S1～S3時期的表達量均高于紅芙蓉。簇3中的MYB成員在紅芙蓉花粉發(fā)育的S1～S3階段，基因表達量隨花粉發(fā)育呈下降趨勢，且Prupe.1G273900在紅芙蓉中的表達量均高于沙紅；而在沙紅花粉發(fā)育的S1～S3階段，MYB家族成員的表達無明顯規(guī)律性。

HS1、HS2、HS3分別代表紅芙蓉S1、S2、S3時期的花芽樣本，SS1、SS2、SS3分別代表沙紅S1、S2、S3時期的花芽樣本。左側(cè)為基因聚類的樹狀圖和子聚類的模塊圖，右側(cè)為基因名稱，2個基因分支離得越近，說明其表達量越接近；圖中的色卡表示基因在每個樣本中標準化處理后的表達量值，粉紅色代表該基因在該樣本中表達量較高，藍色代表表達量較低HS1,HS2 and HS3 represent the flower bud samples of Hongfurong at stage S1,S2 and S3,respectively,while SS1,SS2 and SS3 represent the flower bud samples of Shahong at stage S1,S2 and S3,respectively.The left side is the dendrogram of gene clustering and the module of sub clustering,and the right side is the name of gene.Closer distances among two gene branches indicates closer expression.The color bar in the figure shows the expression value of the gene in each sample after standardized treatment.Pink represents high expression,while blue represents low expression圖2 桃花芽轉(zhuǎn)錄組中差異表達的MYB家族成員在不同育性品種中的表達模式Fig.2 Expression patterns of differentially expressed MYB family members in peach flower buds transcriptome in different fertility cultivars

2.3 不同物種MYB家族成員的系統(tǒng)進化分析

為了探究差異表達的MYB家族成員在桃花粉育性形成中的潛在作用，將其與擬南芥、水稻等不同物種花藥發(fā)育中起調(diào)控作用的MYB蛋白序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果(圖3)顯示，所有39個差異表達的PrupeMYB被分成16簇，其中根據(jù)R結(jié)構(gòu)的重復(fù)次數(shù)，簇1～12為R2R3-MYB，簇13～16為1R-MYB[24]。簇2、簇10、簇11和簇14不含桃MYB成員。在簇1～12中，多個桃MYB成員與其他物種中參與花粉形成的MYB家族成員同源性較高，如簇3中的桃Prupe.3G046900與擬南芥AtMYB26，簇4中的桃Prupe.3G017100與擬南芥AtMYB99，簇9中的桃Prupe.3G0006300與擬南芥AtMYB108；同時，簇12中的桃Prupe.1G276300與擬南芥AtMYB25、AtMYB1相似性較高，Prupe.1G551400、Prupe.1G323400與AtMYB4和AtMYB32成為1簇(簇7)。在簇16中，桃Prupe.8G028700、Prupe.1G273900與水稻OsCAS同源性較高，單獨為一簇。

2.4 桃部分MYB基因在不同育性品種中的相對表達量

圖4結(jié)果表明，在花芽發(fā)育的S1～S3階段，Prupe.3G046900和Prupe.1G273900在可育的紅芙蓉花芽中的相對表達量均高于不育的沙紅，且分別在S3、S2時期二者差異顯著。Prupe.2G192100、Prupe.1G323400和Prupe.4G192000在S1～S3階段的表達特性呈現(xiàn)相似的趨勢，即在S1、S2時期相對表達量比較穩(wěn)定，且在2個品種間無顯著差異；在S3時期可育的紅芙蓉花芽中，其表達量仍然較為穩(wěn)定，而在不育的沙紅花芽中其表達量迅速上升，并顯著高于紅芙蓉。Prupe.1G551400的相對表達量在兩品種中均表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢，且在S2時期沙紅中的相對表達量顯著高于紅芙蓉。

3 討 論

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與調(diào)控植物的各種生物學(xué)過程[45]，其中R2R3-MYB類成員最多[46-47]，擬南芥等物種中多個與花粉育性調(diào)控相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子都屬于這一類，如擬南芥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子MYB24和MYB21與bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，并與JAZs(JA ZIM-domain proteins)相互作用通過茉莉酸途徑調(diào)控花粉育性[29]；油菜BcMF28編碼R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄激活因子，在擬南芥中過表達會使雄蕊發(fā)育異常[19]；辣椒CaMYB108同樣編碼R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控雄蕊發(fā)育[48]。本試驗結(jié)果顯示，在花芽中差異表達的39個桃MYB家族成員中，有27個屬于R2R3-MYB類，與已有研究報道結(jié)果[24]類似。

同源基因的生物學(xué)功能可能相同或相似[45-50]。本研究的系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，桃中有多個MYB成員與擬南芥、蘋果等物種中與花粉育性相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子的同源性較高，而這些成員均通過苯丙烷代謝、JA信號通路、糖代謝等多種途徑參與花藥藥室內(nèi)壁增厚、花藥開裂、花粉形成等花粉育性的調(diào)控。如在擬南芥中，MYB108在雄蕊中特異表達，隨著花藥發(fā)育其表達水平升高，特別在花藥發(fā)育后期表達水平較高，在MYB21的下游介導(dǎo)茉莉酸反應(yīng)，與MYB24協(xié)同正調(diào)控雄蕊和花粉成熟[27]。Prupe.1G111700、Prupe.3G006300與AtMYB108親緣關(guān)系較近，同屬于簇9，同時二者在不育品種沙紅各時期花芽中的表達量均高于可育品種紅芙蓉，且在S3時期二者差異顯著，因此推測桃中的Prupe.1G111700和Prupe.3G006300可能參與花粉育性的調(diào)控，但區(qū)別于AtMYB108的正調(diào)控作用。擬南芥AtMYB26在木質(zhì)素合成途徑的上游起作用，對花藥藥室內(nèi)壁次生增厚和花藥開裂起重要作用[31-32]，桃Prupe.3G046900與其同源性較高，在可育品種紅芙蓉花芽發(fā)育過程中的表達量均高于不育品種沙紅，且在S3時期二者差異顯著，同時，在S3～S4時期兩品種間花藥形態(tài)差異明顯，因此推測Prupe.3G046900與AtMYB26具有相似的功能，即在育性發(fā)育中期起正調(diào)控作用。擬南芥AtMYB32和AtMYB4表達水平的高低影響苯丙烷途徑多種關(guān)鍵酶的合成，從而影響花粉壁的形成[17]。AtMYB4還對肉桂酸-4-羥化酶(Cinnamate-4-hydroxylase, C4H)的表達起抑制作用[34]，C4H是苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶，與孢粉素前體形成有關(guān)[17,51]。桃Prupe.1G551400、Prupe.1G323400與擬南芥AtMYB4、AtMYB32親緣關(guān)系較近，且在不育品種中的基因表達量高于可育品種，因此推測Prupe.1G551400和Prupe.1G323400可能通過負調(diào)控C4H的積累而參與花粉壁的形成，進而調(diào)控桃的花粉育性。蘋果中的MdMYB39L通過糖代謝調(diào)控雄蕊發(fā)育和花粉管伸長，在反義轉(zhuǎn)化株系中，參與己糖合成、細胞壁形成和小孢子發(fā)生的靶基因的轉(zhuǎn)錄水平的降低[20]。桃Prupe.6G188300、Prupe.4G192000與蘋果MdMYB39L同源性較高，且在不育品種沙紅S3時期的花芽中，Prupe.4G192000的相對表達量顯著高于可育品種紅芙蓉，因此推測Prupe.6G188300、Prupe.4G192000與MdMYB39L功能接近，可能通過糖代謝途徑調(diào)控桃的花粉發(fā)育。

4 結(jié) 論

本研究對桃可育品種紅芙蓉和不育品種沙紅不同發(fā)育時期的花藥進行了觀察比較，前者花粉呈橙紅色且飽滿，后者呈淡黃色且癟小。在2個桃品種中，差異表達的MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員有39個，其中27個屬于R2R3-MYB類。系統(tǒng)進化樹和表達特性分析結(jié)果表明，MYB家族成員Prupe.3G046900、Prupe.1G551400、Prupe.1G323400、Prupe.4G192000可能參與桃花粉發(fā)育的調(diào)控。