牛優(yōu)勢卵泡膜細胞黃體化相關(guān)基因的篩選

孟金柱，伍春亞，潘春威，安清明，吳震洋，趙園園

(1 銅仁學(xué)院 貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護與利用重點實驗室，貴州 銅仁 554300；2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

卵巢是雌性動物的生殖器官，其通過卵母細胞(oocytes)與顆粒細胞(granulosa cells,GCs)、膜細胞(theca cells,TCs)、基質(zhì)細胞(stromal cells,SCs)之間的相互作用來調(diào)控卵泡的發(fā)育及排卵[1]。GCs中表達的細胞色素P450家族19亞家族A成員1(cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1,CYP19A1)可將TCs分泌的雄激素轉(zhuǎn)化為雌二醇(estradiol,E2)，抑制下丘腦中促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)的產(chǎn)生，從而觸發(fā)促黃體素(luteinizing hormone,LH)的激增，引發(fā)排卵[2]。此時，卵泡壁上的GCs和TCs分別分化成為大黃體細胞(large luteal cells,LLCs)和小黃體細胞(small luteal cells,SLCs)，LLCs直徑大于25 μm，SLCs直徑為12～25 μm[3]。SLCs對LH的強烈響應(yīng)使其分泌孕酮(progesterone，P4)的能力得以增強，而LLCs分泌孕激素的能力是SLCs的20倍[4-5]。然而，目前關(guān)于LLCs、SLCs的起源和譜系問題還不清楚。

Hatzirodos等[6]對牛直徑3～5 mm和9 mm以上卵泡的GCs和TCs進行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)MGARP、GLDC、CHST8、GPX3是GCs新的潛在標記物。Ticianelli等[7]對熱應(yīng)激下不同品種牛的卵泡卵母細胞和卵丘細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序后發(fā)現(xiàn)，品種對卵母細胞的凋亡有顯著影響，品種和溫度對卵丘細胞(cumulus cells,CCs)凋亡基因的表達有影響。Christenson等[8]對牛卵泡出現(xiàn)LH和前列腺素(prostaglandin,PG)峰時GCs與TCs的形態(tài)變化進行了闡釋，但關(guān)于卵泡到黃體的轉(zhuǎn)變調(diào)控機制尚不清楚。

思南黃牛是貴州省重要的黃牛品種，身軀強健，適應(yīng)性強。近幾十年來，由于外來品種的不斷引進及雜交導(dǎo)致純種思南黃牛品種嚴重退化，數(shù)量急劇減少。本研究擬篩選GEO數(shù)據(jù)庫GSE83524基因表達芯片中SLCs和TCs之間的差異表達基因，利用生物信息學(xué)技術(shù)對其功能進行分析，篩選出與TCs黃體化相關(guān)的關(guān)鍵基因，并以思南黃牛為對象加以驗證，旨在為深入研究細胞特異性及TCs向SLCs分化的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RNAiso Plus，Invitrogen公司產(chǎn)品；瓊脂糖、TBE，均為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(含Oligo(dT)primer、gDNA remover)、TransStart?Tip Green qPCR SuperMix，均為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 SLCs和TCs中差異表達基因的篩選與分析

1.2.1 芯片數(shù)據(jù)的獲取 本研究所用到的RNA-seq表達譜數(shù)據(jù)來源于NCBI中GEO數(shù)據(jù)庫(http：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。對牛卵泡發(fā)育相關(guān)的數(shù)據(jù)進行檢索，獲得基于GPL16500平臺(Bovine Gene 1.0 ST Array)的GSE83524 數(shù)據(jù)集，其中包含了3頭牛優(yōu)勢卵泡中的3個TCs樣本和3頭牛的3個 SLCs樣本。

1.2.2 差異表達基因的篩選 利用R軟件limma包中的DESeq2來篩選TCs和SLCs中的差異表達基因，具體篩選標準為：每1 000堿基轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段(FPKM)≥2，|lb差異倍數(shù)|≥1，校正后P<0.01；同時使用R軟件中g(shù)gplot2包繪制差異表達基因火山圖。

1.2.3 GO、KEGG信號通路和PPI分析 使用R軟件中的goseq包對TCs和SLCs中的差異表達基因進行GO功能富集分析，同時使用kobas軟件對其進行KEGG信號通路分析；最后使用String軟件構(gòu)建差異表達蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，并將互作數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，利用其自帶Cyto-Hubba插件的MCC算法篩選出連通度最大的10個關(guān)鍵(hub)基因，進一步篩選出可能在TCs增殖分化形成SLCs過程中發(fā)揮重要作用的基因。

1.3 差異表達基因轉(zhuǎn)錄水平的驗證

1.3.1 引物設(shè)計與合成 以篩選出的差異表達的6個基因(促卵泡素受體FSHR、磷脂酶A2-IVA基因PLA2G4A、細胞色素P450家族19亞家族A成員1基因CYP19A1、細胞色素P450家族17亞家族A成員1基因CYP17A1、蘇氨酸激酶B基因BUB1B、驅(qū)動蛋白家族成員20A基因KIF20A)作為候選基因，以核糖體蛋白側(cè)柄亞單位P0基因RPLP0為內(nèi)參基因，根據(jù)GenBank中登錄的牛屬(Bostaurus)各基因序列，用在線NCBI軟件分別設(shè)計上述候選基因和內(nèi)參基因的熒光定量PCR引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 試驗所用引物及序列Table 1 Sequences of primers used in this study

1.3.2 候選基因在TCs和SLCs中轉(zhuǎn)錄水平的驗證 在貴州省銅仁市萬山區(qū)肉牛屠宰場，選擇1歲齡健康青年思南黃牛母牛5頭，屠宰后采集雙側(cè)卵巢上的最大卵泡(直徑810 mm)，參照本課題組前期的研究方法[9]篩選優(yōu)勢卵泡。將篩選出的優(yōu)勢卵泡置于生理鹽水中，使用眼科剪刀剪開并刮去位于卵泡內(nèi)膜上的GCs后，收集TCs；使用淘洗法[10]從卵巢黃體中分離出黃體細胞并經(jīng)孔徑約30 μm(500目)細胞篩過濾，篩選出SLCs，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

從-80 ℃ 冰箱中取出3個樣本的GCs和TCs置于冰盒上解凍，用Trizol法分別提取TCs和SLCs的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性并經(jīng)NanoDrop 2000測量濃度合格后，通過EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix將TCs和SLCs的總RNA分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA，同時利用gDNA Remover 去除其中的gDNA。

分別以TCs和SLCs的cDNA為模板，利用表1中的引物，經(jīng)TransStart?Tip Green qPCR SuperMix通過LightCycler 480平臺進行熒光定量PCR。試驗設(shè)樣本重復(fù)(n=3)和技術(shù)重復(fù)(n=5)，建立20 μL PCR反應(yīng)體系：模板cDNA 4 μL，上、下游引物各0.5 μL， SYBR MIX 10 μL，ddH2O 5 μL；PCR反應(yīng)程序設(shè)定為： 95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 變性15 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。

1.3.3 統(tǒng)計分析 各基因的相對表達量采用2-ΔΔCt來計算，并使用SPSS 17.0軟件進行差異顯著性分析，結(jié)果用“均值±標準誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達基因的篩選

DESeq2分析后，共獲得237個差異表達基因，其中上調(diào)表達基因115個，下調(diào)表達基因122個；差異倍數(shù)較高的前25個基因見表2。

表2 牛SLCs與TCs差異表達倍數(shù)較高的25個基因及其功能分析Table 2 Functional analysis of the top 25 differentially expressed genes between SLCs and TCS of cattle

由表2可見，25個差異表達倍數(shù)較高的基因分別為細胞色素P450家族19亞家族A成員1基因CYP19A1、纖維蛋白原γ鏈(fibrinogen gamma chain)基因FGG、細胞色素P450家族17亞家族A成員1基因CYP17A1、乳腺癌雌激素調(diào)控蛋白1(growth regulation by estrogen in breast cancer 1)基因GREB1、烯酰ACP還原酶(enoyl-ACP reductase)基因INHA、鈣粘蛋白12(cadherin-12)基因CDH12、共濟失調(diào)蛋白3(ataxin-3)基因ATXN3、穿透素3(pentraxin 3)基因PTX3、合子運動缺陷蛋白(ookinete motility deficient)基因OMD、生長激素抑制素(somatostatin)基因SST、絲氨酸蛋白酶抑制劑E家族成員2(serpin family E member 2)基因SERPINE2、骨甘氨酸(osteoglycin)基因OGN、原蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌素1型(proprotein convertase subtilisin type 1)基因PCSK1、無孢蛋白(asporin)基因ASPN、未知功能基因LOC506828、糖蛋白非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤蛋白B(glycoprotein non-metastatic melanoma protein B)基因GPNMB、卵泡抑素(follistatin)基因FST、脂蛋白受體相關(guān)蛋白8(lipoprotein receptor-related protein 8)基因LRP8、碳酸酐酶(carbonic anhydrase 13)基因CA13、多能蛋白聚糖(versican)基因VCAN、Rho家族GTP酶1(Rho family GTPase 1)基因RND1、谷氨酸受體輔助蛋白3(glutamate receptor auxiliary protein)基因CNIH3、促卵泡素受體(follicle stimulating hormone receptor)基因FSHR、膠原Ⅻ型α1鏈(collagen type Ⅻ alpha1 chain)基因COL12A1、絲裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8)基因MAP3K8。該結(jié)果顯示，部分基因已經(jīng)明確與卵巢中激素的合成、應(yīng)答及釋放直接相關(guān)。

2.2 差異表達基因GO功能富集分析

通過goseq軟件對237個差異表達基因進行GO功能分析，結(jié)果(表3)顯示，參與生物學(xué)過程的有147個基因，占差異表達基因總數(shù)的53.6%，分別富集于30個組，其中負調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄、細胞增殖調(diào)節(jié)、細胞粘附以及負調(diào)控細胞增殖組富集的基因最多；參與細胞組分的有125個基因，占差異表達基因總數(shù)的21.4%，分別富集于12個組，其中細胞外外泌體、細胞外空間、細胞外基質(zhì)及蛋白質(zhì)的細胞外基質(zhì)組富集的基因最多；參與分子功能的有98個基因，占差異表達基因總數(shù)的25.0%，分別富集于14個組，其中轉(zhuǎn)錄激活因子活性、鈣離子結(jié)合和生長因子活性組富集的基因較多。

表3 牛SLCs與TCs中差異表達基因的GO分析Table 3 GO analysis of differentially expressed genes between SLCs and TCs of cattle

表3(續(xù)) Continued table 3

2.3 差異表達基因KEGG信號通路分析

KEGG信號通路分析結(jié)果(圖1)顯示,共獲得17條通路，其中HTLV-I感染通路富集的基因最多。在17條通路中，可能與卵泡內(nèi)膜細胞黃體化相關(guān)的通路為卵巢類固醇生成通路，其中包含F(xiàn)SHR和磷脂酶A2-IVA(phospholipase A2-IVA)基因PLA2G4A、CYP19A1、CYP17A1等4個基因，表明這些基因在卵巢類固醇激素的合成及釋放過程中起著至關(guān)重要的作用。

圖1 牛 SLCs與TCs中差異表達基因的KEGG信號通路分析Fig.1 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes between SLCs and TCs of cattle

2.4 差異表達基因PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析

使用String軟件對差異表達基因之間的相互作用情況進行預(yù)測，同時將得到的互作數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件進行可視化分析，篩選連通度最大的前10位關(guān)鍵基因。結(jié)果(圖2)表明，蘇氨酸激酶B(threonine kinase B)基因BUB1B、驅(qū)動蛋白家族成員20A(kinesin family member 20A)基因KIF20A的連通度最高，最具代表性；其次分別為中心體相關(guān)蛋白E(centrosome-associated protein E)基因CENPE、驅(qū)動蛋白家族成員11(kinesin family member 11)基因KIF11、核分裂周期80蛋白(nuclear division cycle 80)基因NDC80、細胞周期素A2(cyclin A2)基因CCNA2、細胞分裂周期蛋白20(cell-division cycle protein 20)基因CDC20、泛素E2連接酶C(ubiquitin E2 ligase C)基因UBE2C、MK167及爪蟾驅(qū)動蛋白2的靶蛋白(target protein for xenopus kinesin protein 2)基因TPX2等，這些關(guān)鍵基因間存在顯著相互作用。

圖2 牛SLCs與TCs中hub基因的PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析Fig.2 PPI network interaction analysis of hub genes between SLCs and TCs of cattle

2.5 差異表達基因轉(zhuǎn)錄水平的驗證

選取卵巢類固醇生成通路中的4個差異表達基因(FSHR、PLA2G4A、CYP19A1、CYP17A1)及連通度最大的2個hub基因(BUB1B、KIF20A)進行熒光定量 PCR驗證分析。結(jié)果(圖3)表明，F(xiàn)SHR、PLA2G4A、CYP19A1、CYP17A1、BUB1B及KIF20A在SLCs和TCs中的表達趨勢與GEO芯片數(shù)據(jù)結(jié)果一致，表現(xiàn)為FSHR、CYP19A1和CYP17A1在TCs中的表達量極顯著高于SLCs (P<0.01)，PLA2G4A、BUB1B及KIF20A在TCs中的表達量顯著高于SLCs (P<0.05)。

圖柱上標不同小寫字母表示同一基因在不同細胞中的表達水平差異顯著(P<0.05)，標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)Different lowercase letters indicate significant differences in expression levels of same gene in different types of cells (P<0.05),and different capital letters indicate extremely significant difference (P<0.01)圖3 差異表達基因在牛SLCs與TCs中的轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 Transcriptional levels of differentially expressed genes in SLCs and TCs of cattle

3 討 論

卵泡膜是由內(nèi)膜和外膜組成的包裹在顆粒細胞周圍的一層結(jié)締組織，內(nèi)膜上含有內(nèi)分泌細胞，外膜是由成纖維細胞衍生而來的結(jié)締組織層[11]。卵泡的膜層不僅能夠維持卵泡結(jié)構(gòu)的完整性、合成關(guān)鍵的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子，而且還可以向顆粒細胞層、卵丘細胞和卵母細胞運送營養(yǎng)物質(zhì)[12]。在大多數(shù)哺乳動物中，卵泡TCs和GCs都參與黃體的形成，并維持不同的功能和形態(tài)[13]。靈長類動物的膜-黃體細胞形態(tài)明顯，位于黃體的外邊緣；而顆粒-黃體細胞則位于中央[14]。膜-黃體細胞生產(chǎn)雄激素，而顆粒-黃體細胞則是黃體酮和雌二醇的主要來源[15]。

研究發(fā)現(xiàn)，類固醇樣原急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,STAR)可以將膽固醇運輸?shù)骄€粒體，以調(diào)節(jié)雄激素的分泌[16]。而負責(zé)分泌雄激素的TCs所表達的CYP11A1、CYP17A1和羥基-5-甾體脫氫酶，3-和甾體-異構(gòu)酶2(hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase,3 beta- and steroid delta-isomerase 2,HSD3B2)均為雄激素生物合成的關(guān)鍵酶[17]。CYP17A1是催化孕烯酮轉(zhuǎn)化為17-羥基孕烯酮和孕酮轉(zhuǎn)化為17-羥基孕酮的調(diào)節(jié)劑，是雄激素生物合成的限速步驟[18]。CYP17主要表達于腎上腺、睪丸間質(zhì)細胞和卵巢膜細胞，這種酶的活性增加能夠顯著促進TCs中雄激素的生物合成和分泌[19]。體外研究表明，雄激素分泌的增加是由LH以劑量依賴性的方式驅(qū)動的[20-21]，這是TCs的一個關(guān)鍵特征。在促黃體素受體(luteinizing hormone receptor，LHR)不變的情況下，胰島素受體(insulin receptor，IR)的缺失促進了CYP17A1和CYP11A1的表達，從而導(dǎo)致雄激素過剩、發(fā)情周期紊亂甚至喪失生育能力[22]。本研究對GEO數(shù)據(jù)庫GSE83524 基因表達芯片數(shù)據(jù)進行分析，共篩選出6個可能與TCs黃體化相關(guān)的基因。熒光定量 PCR驗證分析結(jié)果顯示，F(xiàn)SHR、PLA2G4A、CYP19A1、CYP17A1、BUB1B及KIF20A在SLCs和TCs中的表達趨勢與GEO芯片數(shù)據(jù)結(jié)果一致。

類固醇激素通過調(diào)控下丘腦分泌GnRH或者直接作用于垂體前葉促性腺激素分泌細胞，從而影響LH和促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)的產(chǎn)生[23]。FSH與其同源受體相互作用誘導(dǎo)CYP19A1的表達，將來自TCs的雄激素轉(zhuǎn)化為E2，從而驅(qū)動卵泡發(fā)育，導(dǎo)致排卵[24]。此外，E2繼續(xù)作用于GCs，促進其合成FSHR和LHR，使CYP19A1活性增強，進一步促進E2的分泌，使卵泡迅速生長[25]，敲除小鼠CYP19A1，則會導(dǎo)致小鼠排卵[26]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)在卵母細胞中特異表達并影響卵泡發(fā)育，BMP15的過表達會抑制GCs中FSHR的表達從而導(dǎo)致卵泡閉鎖[27]。本研究通過Real time PCR研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR、CYP19A1和CYP17A1在TCs中的表達量極顯著高于SLCs (P<0.01)，表明其在TCs中發(fā)揮了重要作用，可能會抑制卵泡增殖分化形成黃體。

PLA2G4A是一個被排卵前促黃體素/人絨毛膜促性腺激素(luteinizing hormone/human chorionic gonadotrophin，LH/hCG)峰刺激誘導(dǎo)的潛在的候選基因，LH/hCG峰誘導(dǎo)牛卵泡排卵的過程要早于PLA2G4A的誘導(dǎo)[28]。注射hCG后，GCs中PLA2G4AmRNA的表達水平顯著增加[29]。Lussier等[30]通過對優(yōu)勢卵泡和排卵卵泡GCs進行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，PLA2G4AmRNA在排卵卵泡GCs中的含量高于優(yōu)勢卵泡，可能其在促進排卵方面發(fā)揮著重要作用。BUB1B是催化蛋白質(zhì)磷酸化過程的酶，能夠在卵母細胞中被細胞質(zhì)聚腺苷酸化元素結(jié)合蛋白(cytoplasmicpolyadenylation element-binding protein，CPEB)特異性結(jié)合，從而調(diào)控聚腺苷酸誘導(dǎo)的翻譯[31]。在CPEB敲除小鼠中，由于突觸復(fù)合體蛋白mRNA的翻譯受到抑制，粗線處減數(shù)分裂進程被中斷[32]。KIF20A可以促進癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[33]。KIF20A高表達的膀胱癌患者腫瘤分化較慢，預(yù)后較差，因此其可能成為影響膀胱癌患者預(yù)后的獨立因素和膀胱癌的治療靶點[34]，關(guān)于其在動物繁殖中的作用尚未見報道。PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析表明，BUB1B和KIF20A為連通度最大的2個hub基因，表明這2個基因與牛優(yōu)勢卵泡TCs增殖、分化形成SLCs關(guān)系密切。綜上，本研究結(jié)果為深入探討TCs和SLCs的特異性及TCs向SLCs的分化機制提供了參考依據(jù)。