六經(jīng)辨證指導(dǎo)下桂枝新加湯治療頸椎病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)作用機(jī)制探究

賀美宇，李兆勇，于 瀾，楊少鋒*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410208)

頸椎病是最常見的脊柱退行性疾病之一，是由于頸椎間盤發(fā)生退行性改變累及周圍神經(jīng)、血管、脊髓等組織而出現(xiàn)一系列與影像學(xué)改變相一致的臨床癥狀[1]。該病多見于40歲以上的中老年患者，但發(fā)病年齡正趨向年輕化[2]，其臨床癥狀與《傷寒論》中的“項強(qiáng)”“身疼痛”“目?！钡认嚓P(guān)證候較為相符，六經(jīng)辨證是《傷寒論》的辨證核心，其六經(jīng)本質(zhì)是臟腑經(jīng)絡(luò)由表及里發(fā)病、轉(zhuǎn)歸規(guī)律的總結(jié)。因此，目前普遍認(rèn)為《傷寒論》中經(jīng)方不僅可用于外感熱病，也適用于內(nèi)傷雜病。通過總結(jié)多年六經(jīng)辨證指導(dǎo)下對骨傷科慢性筋骨疾病的診療經(jīng)驗，發(fā)現(xiàn)慢性筋骨疾病中以太陽病、少陽病、太陰病、少陰病較為常見。其中，部分年老、久病或術(shù)后的慢性筋骨疾病患者，因直接或間接耗損氣血，致氣血不足，筋脈失榮，不榮則痛，筋脈弛緩，發(fā)為痿痹；且營衛(wèi)不和，腠理失司，營氣易泄，易感外邪，客于肌表、筋骨、關(guān)節(jié)，此屬太陽營血虧虛證，可治以桂枝新加湯以補(bǔ)氣養(yǎng)血、調(diào)和營衛(wèi)、榮養(yǎng)筋脈。施杞教授[3]也認(rèn)為慢性筋骨疾病以“正氣虧虛、外邪侵襲、經(jīng)絡(luò)閉阻”為病機(jī)特點，應(yīng)以“調(diào)和氣血法”為原則，防治慢性筋骨病。

于麗萍[4]運用桂枝新加湯治療產(chǎn)后身痛，通過將該方加減調(diào)和營衛(wèi)以調(diào)理脾胃化生氣血，緩解身痛效果明顯。畢春和等[5]運用桂枝新加湯結(jié)合西醫(yī)常規(guī)方案治療心絞痛患者，發(fā)現(xiàn)較單純西醫(yī)常規(guī)治療，心絞痛緩解更為明顯，表明桂枝新加湯具有一定的緩解疼痛作用。本研究課題組運用桂枝新加湯加減治療氣血不足證型頸椎病患者，臨床療效也較為明顯[6]。不過由于前期研究缺乏現(xiàn)代理論及基礎(chǔ)研究的驗證，故本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桂枝新加湯治療頸椎病的可能藥效成分及潛在靶點，并采用分子對接技術(shù)進(jìn)行對接驗證，為今后實驗和臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 桂枝新加湯主要成分的活性成分與作用靶點篩選

應(yīng)用TCMSP[7](https：//tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMAN數(shù)據(jù)庫[8]，分別以“桂枝、白芍、人參、生姜、甘草、大棗”為檢索詞，按照OB≥30%以及DL≥0.18的限定條件篩選活性成分；通過TCMSP里Related Targets功能與BATMAN關(guān)聯(lián)靶點，按照“Score≥20、 P-value<0.05”的條件篩選藥物作用靶點。

1.2 頸椎病的疾病靶點與藥物-疾病交集靶點的獲取

以“cervical myelopathy”或”cervical spondylosis”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards(https：//www.genecards.org/)、OMIM(http：/www.omim.org/)、DisGeNET(http：//www.disgenet.org/)、Drugebank(https：//go.drugbank.com/)、CTD[9](http：//ctdbase.org/detail.go?type=disease&acc=MESH%3AD055009)等數(shù)據(jù)庫。刪除重復(fù)的檢索致病靶點，分別將所獲得的藥物作用靶點和疾病致病靶點輸入Uniport數(shù)據(jù)庫(https：// www.uniprot.org/)，篩選物種為“人源(homo sapiens)”，已驗證“reviewed”的靶點基因。借助Venny數(shù)據(jù)庫(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲取藥物-疾病交集靶點。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將交集靶點導(dǎo)入 STRING Version11.0數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，選擇物種為“人類(homo sapiens)”，設(shè)置最低相互作用閾值“highest confidence(≥0.9)”。導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，運用”Network Analyzer”進(jìn)行拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)分析，根據(jù)節(jié)點連接度(degree)篩選得到核心靶點。

1.4 KEGG通路和GO富集分析與“藥物-活性成分-疾病-交集靶點”網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建

借助DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫，設(shè)定閾值P<0.05進(jìn)行GO富集分析；通過KEGG Mapper(https：//www.kegg.jp/kegg/tool/map_pathway2.html)數(shù)據(jù)庫預(yù)測相關(guān)信號通路；運用R軟件繪制氣泡圖和柱狀圖。運用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)模型圖。

1.5 分子對接驗證

從PDB數(shù)據(jù)庫(http：//www.rcsb.org/)中下載篩選的靶點蛋白結(jié)構(gòu)文件，利用PyMol 1.8軟件去除水分子并摘取出自身配體，分別保存為*qdb格式文件。通過PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載活性成分3D結(jié)構(gòu)。將靶點蛋白導(dǎo)入 Autodock Tools 1.5.6 軟件中，加氫，計算總電荷，設(shè)置原子類型，保存為*pdbqt格式文件；運用Autodock Tools軟件將配體分子設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵后保存為*pdbqt格式文件。運行Vina對接，Grid box為原配體中心的周圍所有氨基酸殘基，選擇剛性對接，按照每個配體與受體對接的最優(yōu)結(jié)合能進(jìn)行排序，選取結(jié)合能最小的對接構(gòu)象導(dǎo)出*pdbqt格式文件，最后運用PyMol 軟件將對接構(gòu)象繪制成可視化模型。

2 結(jié)果

2.1 桂枝新加湯活性成分、作用靶點與頸椎病疾病靶點

共篩選出434個活性成分、2 050個潛在作用靶點；選取degree值排名前15的活性成分，詳細(xì)信息見表1。通過GeneCards、OMIM、Drugebank、DisGeNET、CTD數(shù)據(jù)庫，檢索到疾病靶點分別為549、3、24、12、687個，刪除重復(fù)檢索的靶點，排除非人源靶點，共篩選獲取到976個疾病靶點。

表1 degree值排名前15的活性成分的基本信息

2.2 交集靶點集與Venny圖

通過Venny數(shù)據(jù)庫獲得桂枝新加湯與頸椎病的交集靶點143個，見圖1。導(dǎo)出交集靶點集數(shù)據(jù)，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫查詢其Uniprot ID，以便后續(xù)進(jìn)行GO、KEGG分析。

圖1 degree值排名前15的活性成分的基本信息

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點數(shù)143個，線條數(shù)272條，平均節(jié)點degree值3.8；選取BC >中位數(shù)0.004 871 63、CC>中位數(shù)0.368 421 05、degree>2倍中位數(shù)的靶點蛋白，包括PIK3CA、STAT3等10個蛋白，提示其在PPI網(wǎng)絡(luò)中占有重要地位。蛋白拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)見表2，PPI網(wǎng)絡(luò)見圖2。

表2 10個核心靶點蛋白拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)

圖2 桂枝新加湯交集靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 KEGG分析和 GO 富集分析

應(yīng)用R語言對共同靶點進(jìn)行GO分析，主要涉及對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌病原體的反應(yīng)、上皮細(xì)胞增殖等過程。獲得247條預(yù)測的信號通路，排除廣泛的信號通路，MAPK、PI3K-Akt信號通路等富集值較高，見圖3、圖4。

注：MF(1)，BP(2)，CC(3)，KEGG(4)。

注：黃色倒三角形為桂枝新加湯，綠色矩形為藥物共有活性成分，淺綠色三角形為藥味，藍(lán)色六邊形為活性成分，紅色圓形為核心靶點，深紅色菱形為頸椎病。

2.5 分子對接結(jié)果分析

選取活性成分與PPI選取的靶點蛋白進(jìn)行對接，蛋白及自身配體信息見表3。

表3 參與分子對接的受體蛋白信息

以兩兩對接的結(jié)合能制表，見表4。其中橫坐標(biāo)為靶點蛋白，縱坐標(biāo)為活性成分，熱圖中顏色越深表示結(jié)合能越小。最低結(jié)合能<-5.0 kJ·mol-1即表明藥效分子與蛋白對接效果良好，結(jié)合能越低，表明分子與蛋白結(jié)合能力越佳。結(jié)果表明，絕大部分結(jié)合能>-5.0 kJ·mol-1，表示結(jié)合能力較弱，對接效果不佳。同時發(fā)現(xiàn)Betulin與10個靶點蛋白對接結(jié)合能均<-5.0 kJ·mol-1。Stigmasterol除了與STAT3外，其余結(jié)合能均<-5.0 kJ·mol-1。并且Betulin與ESR1，Betulin、Quercetin、Shyobunone、Stigmasterol與FGF23，Betulin與IL-1B 靶點的結(jié)合能值均低于原配體，提示可能為發(fā)揮藥效作用的關(guān)鍵活性成分，分別繪制8個最低結(jié)合能的“藥效成分-靶點”對接結(jié)合模型，見圖5。

表4 桂枝新加湯活性成分與核心靶點蛋白對接結(jié)合能信息

圖5 “藥效成分-靶點”結(jié)合模型

3 討論

目前頸椎病的治療可分為手術(shù)治療和保守治療兩種方式，在脊髓型頸椎病確診時，原則上應(yīng)盡早手術(shù)；其余各型頸椎病以保守治療為首選治療方案[1]，中醫(yī)藥在保守治療中占據(jù)重要地位。本研究根據(jù)課題組專家運用六經(jīng)辨證理論體系治療慢性筋骨疾病的診療思路，借用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對桂枝新加湯活性成分-作用靶點與頸椎病致病靶點之間冗雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析，明確了Betulin、Stigmasterol等15個活性成分與PIK3CA、STAT3、TP53、IL-6、TNF、MAPK14等10個核心作用靶點；其中Betulin和Stigmasterol不僅為degree值最高的兩個活性成分，同時從分子對接的角度驗證了其對接能力。研究表明，Betulin具有五環(huán)三萜類化合物的抗炎、抗菌、抗病毒等活性[10]。傅增輝等[11]通過細(xì)胞實驗，發(fā)現(xiàn)Betulin對β淀粉樣蛋白(Aβ)誘導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有明顯抑制作用。Stigmasterol可通過下調(diào)NF-κB p65和p38MAPK的表達(dá)，顯著抑制促炎介質(zhì)(TNF-β、IL-6、IL-1、iNOS和COX-2)的表達(dá)，增加抗炎細(xì)胞因子(IL-10)的表達(dá)[12]。GABAY等[13]通過Stigmasterol干預(yù)IL-1β刺激培養(yǎng)下的人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞和新生小鼠軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Stigmasterol能抑制誘導(dǎo)OA軟骨的促炎和基質(zhì)降解介質(zhì)。

本研究通過分子對接模擬，發(fā)現(xiàn)MAPK14(p38-α)與Betulin、Shyobunone、Stigmasterol、Sylvestrene結(jié)合效果較好，提示桂枝新加湯緩解頸椎病疼痛可能與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteink-inase，MAPK)信號通路密切相關(guān)。MAPK信號通路參與了細(xì)胞的基因表達(dá)、增殖、分化、遷移、凋亡和新陳代謝等多種功能[14]。哺乳動物中至少有四組MAPK，p38 MAP激酶(MAPK)參與一個信號級聯(lián)，是MAPK家族控制炎癥反應(yīng)最重要的成員。p38MAPK通路是促炎性細(xì)胞因子在生物轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上合成的關(guān)鍵調(diào)控通路[15]，主要被促炎因子、應(yīng)激刺激、脂多糖、蛋白合成抑制劑、細(xì)菌病原體及其產(chǎn)物等激活[16]。大量研究指出p38MAPK也參與椎間盤退變過程中炎癥因子的表達(dá)，與椎間盤退變程度呈正相關(guān)；抑制p38MAPK的激活，能減少外界炎癥刺激下椎間盤炎癥的表達(dá)[17]。TOSHINORI等[18]在神經(jīng)鞘內(nèi)應(yīng)用特異性阻斷p38MAPK活性的抑制劑SB203580，發(fā)現(xiàn)能夠減少LDH患者的觸誘發(fā)痛。因此，LIN等[19]提出特異性靶向p38MAPK分子及其信號通路是治療疼痛的潛在策略，并且一些天然產(chǎn)物和生物成分也可能成為潛在p38MAPK抑制劑。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析桂枝新加湯可能是通過影響p38 MAPK信號通路抑制頸椎退變椎間盤中炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮緩解頸椎病身疼痛的作用。然而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究是基于生物信息網(wǎng)絡(luò)理論、數(shù)據(jù)庫、算法等基礎(chǔ)上預(yù)測出來的結(jié)果[20]，其真實性仍需進(jìn)一步的實驗驗證。運用桂枝新加湯治療頸椎病，只是六經(jīng)辨證指導(dǎo)下經(jīng)方治療慢性疾病的一部分內(nèi)容，本研究為臨床六經(jīng)辨證理論體系應(yīng)用于慢性筋骨疾病的診治，提供了新的思路。