蘭香草中總黃酮和木犀草素提取工藝優(yōu)化及其含量動態(tài)分析

郭 慶，陳美安，張欣影，李宗澤，黃星海

(廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530001)

蘭香草，為馬鞭草科蕕屬植物蘭香草(Caryopterisincana(Thunb.) Miq.)的全草或帶根全草[1]，其別名較多，比較常見的有婆絨花、石母草、段菊等。蘭香草藥用資源豐富，易采集，我國有13種、2變種、1變型，主要分布于廣西、廣東、湖南、江西等地，其味辛，氣香，性微溫，具有疏風(fēng)解表、祛寒除濕、散瘀止痛之功效，可用于治療風(fēng)寒感冒、慢性支氣管炎、皮膚瘙癢、風(fēng)濕痹痛、跌打腫痛、外傷出血等癥[2-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明蘭香草有抗氧化、抗炎、抗菌、止咳、祛痰等作用[5-8]，蘭香草全草中含有精油、生物堿、黃酮、酚酸、氨基酸、甾體、有機酸、鞣質(zhì)等成分，其中黃酮類成分含量最多[9-10]，具有良好的藥用價值。課題組前期從蘭香草乙酸乙酯部位中分離出若干個黃酮類化合物，其中1個鑒定為木犀草素[11]。目前，關(guān)于蘭香草的化學(xué)成分、提取工藝、質(zhì)量分析等研究報道甚少，且尚未見其黃酮類成分含量動態(tài)積累研究的報道，亦無統(tǒng)一種植和采收規(guī)范標準，難以保證市場上蘭香草藥材的質(zhì)量。因此，本文采用正交試驗優(yōu)化提取蘭香草中總黃酮和木犀草素的工藝，為其提取工藝研究奠定一定基礎(chǔ)。同時，探討蘭香草中總黃酮和木犀草素含量在不同采收期的動態(tài)變化趨勢，明確其含量與采收時間之間的關(guān)系，為指導(dǎo)蘭香草藥材的合理采收，后續(xù)藥理活性、質(zhì)量分析及藥用價值的開發(fā)利用等方面奠定了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

12個不同月份蘭香草藥材，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室朱意麟藥師鑒定為馬鞭草科蕕屬植物蘭香草(Caryopterisincana(Thunb.) Miq.)的干燥全草，陰干，粉碎成粗粉，備用。

表1 蘭香草藥材信息

蘆丁對照品(規(guī)格：20 mg/支，供含量測定用，純度：98%，批號：100080-201811，中國藥品生物制品檢定所)；木犀草素對照品(規(guī)格：20 mg/支，供含量測定用，純度：98%，批號：111520-201605，中國藥品生物制品檢定所)。乙腈、甲醇均為色譜純(美國Fisher公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；JADE-PAK ODS-AQ C18色譜柱(5μm，250 mm×4.6 mm，太瑋科技)；BP211D電子分析天平(德國賽多利斯公司)；TGL-16B高速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；KQ5200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHB-III循環(huán)水式多樣真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；UPC-11-10T實驗室超純水器(四川優(yōu)譜超純科技有限公司/成都超純科技有限公司)。

1.2 總黃酮含量測定

1.2.1 溶液制備 取干燥至恒重的蘆丁對照品約3 mg，精密稱定，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成濃度為0.296 0 mg/mL的蘆丁對照品溶液。取蘭香草粉末約1 g，精密稱定，稱重，按一定條件超聲提取，放冷，用提取溶劑補足重量，搖勻，定量過濾，定容至100 mL容量瓶中，即得供試品溶液Ⅰ。

1.2.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“1.2.1”項下蘆丁對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，精密加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，充分振搖后放置5 min，精密加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，充分振搖后放置5 min，精密加入4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，用甲醇定容至刻度，充分振搖后放置15 min。以甲醇作空白，在500 nm測定相應(yīng)溶液吸光度(A)。以蘆丁對照品濃度(C，mg/mL)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線。求得蘆丁的回歸方程為：Y=12.874 9X-0.006 189 98(r=0.999 9)。結(jié)果表明對照品溶液在0～0.059 2 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。蘆丁標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁對照品標準曲線

1.3 木犀草素含量測定

1.3.1 溶液制備 取干燥至恒重的木犀草素約3 mg，精密稱定，置于25 mL的容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，配制成濃度為120μg/mL的木犀草素對照品溶液。取供試品溶液Ⅰ40 mL，濃縮至干，定容至2 mL容量瓶中，即得供試品溶液Ⅱ。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：JADE-PAK ODS-AQ 柱(5μm，250 mm×4.6 mm)；流動相：甲醇-0.2%磷酸(55∶45)；檢測波長：350 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10μL。木犀草素的色譜峰與相鄰色譜峰之間分離度均大于1.5，拖尾因子均在0.90～1.05之間；理論塔板數(shù)按木犀草素計均大于10 000，滿足定量要求。色譜見圖2和圖3。

圖 2 木犀草素對照品高效液相色譜

圖 3 蘭香草供試品高效液相色譜

1.3.3 線性關(guān)系考察 精密吸取“1.2.1”項下木犀草素對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，按“1.3.2”項下色譜條件，分別取上述6個不同濃度的對照溶液注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以木犀草素對照品溶液進樣濃度(C，μg/mL)為橫坐標，色譜峰峰面積(A)為縱坐標，繪制標準工作曲線，求得木犀草素的回歸方程為：Y=55.461 624 7X-30.948 509(r=0.999 9)。結(jié)果表明對照品溶液在6～60μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。木犀草素標準曲線見圖4。

圖4 木犀草素對照品標準曲線

1.4 蘭香草總黃酮和木犀草素提取工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素實驗 稱取同一批次編號C6蘭香草粉末，每份約1 g，精密稱定，固定其他因素不變的條件下，分別考察提取溶劑(30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、乙醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、甲醇)，料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)，提取時間(30、60、90、120 min)和提取次數(shù)(1次、2次、3次)等四個因素對蘭香草提取總黃酮含量和木犀草素含量的影響，以篩選出各因素最優(yōu)提取條件。

1.4.2 正交實驗 稱取同一批次編號C6蘭香草粉末，每份約 1 g，精密稱定，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以蘭香草中總黃酮含量和木犀草素含量的綜合評分為考察指標，選擇乙醇濃度(A)、物料比(B)、提取時間(C)、提取次數(shù)(D)作為考察因素，采用L9(34)正交實驗設(shè)計進行實驗，因素水平見表2。

表2 L9(34)正交實驗設(shè)計

1.5 蘭香草總黃酮和木犀草素含量動態(tài)測定

分別稱取12個不同月份的蘭香草粉末，各3份，每份約1 g，精密稱定，按“1.2.1”項下和“1.3.1”項下方法平行制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液Ⅰ2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，按“1.2.2”項下所述方法進行測定，計算總黃酮的含量及RSD值；精密吸取供試品溶液Ⅱ10μL，按“1.3.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積，計算木犀草素的含量及RSD值。

總黃酮的含量(mg/g)= (C1×V1×N1)/m，式中，C1為樣品中總黃酮的濃度，mg/mL；V1為測定時定容的體積，mL；N1為稀釋倍數(shù)；m為生藥材量。

木犀草素的含量(μg/g)= (C2×V2×N2)/m，式中，C2為樣品中木犀草素的濃度，mg/mL；V2為測定時定容的體積，mL；N2為稀釋倍數(shù)；m為生藥材量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 提取溶劑的影響 結(jié)果見圖5和圖6，可知乙醇和甲醇在相同濃度的條件下，以不同濃度乙醇的提取量相對較高；其中，在不同乙醇濃度中，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮和木犀草素提取量不斷增大，當(dāng)乙醇濃度增加至70%時提取量達到最高值，此時再繼續(xù)增加乙醇濃度，提取量反而降低。因此采用70%乙醇作為提取溶劑。

圖5 提取溶劑對總黃酮含量的影響

圖6 提取溶劑對木犀草素含量的影響

2.1.2 料液比的影響 結(jié)果見圖7和圖8，料液比按照10倍量不斷遞增考察，發(fā)現(xiàn)隨著溶劑量的增加，總黃酮和木犀草素提取量先升高，當(dāng)料液比為1∶40 g/mL時達到最高值后再降低?？赡茉蚴窃黾尤軇┝窟^多，導(dǎo)致其他成分溶出量增加，反而影響了指標成分的溶出。因此采用料液比為1∶40最適宜。

圖7 料液比對總黃酮含量的影響

圖8 料液比對木犀草素含量的影響

2.1.3 提取時間的影響 結(jié)果見圖9和圖10，當(dāng)提取時間為60 min時，總黃酮和木犀草素提取量最高，繼續(xù)延長提取時間，反而有稍有降低，趨于平穩(wěn)。在60 min左右，溶解藥材組織細胞內(nèi)外指標成分的濃度達到動態(tài)平衡，因此采用提取時間為60 min最適宜。

圖9 提取時間對總黃酮含量的影響

圖10 提取時間對木犀草素含量的影響

2.1.4 提取次數(shù)的影響 結(jié)果見圖11和圖12，當(dāng)提取次數(shù)為2次時，有利于總黃酮和木犀草素的溶出，提取量最高。因此采用提取次數(shù)為2次最適宜。

圖11 提取次數(shù)對總黃酮含量的影響

圖12 提取次數(shù)對木犀草素含量的影響

2.2 正交實驗結(jié)果與分析

正交實驗結(jié)果及方差分析見表3和表4。由表3可知，R值越大，表明該因素的水平變動對試驗結(jié)果的影響越大，四因素對蘭香草總黃酮和木犀草素提取影響的順序為乙醇濃度(A)>提取次數(shù)(D)>提取時間(C)>料液比(B)。由表4可知，四個因素對蘭香草總黃酮和木犀草素含量的提取均無顯著性差異(P>0.05)。綜合考慮最佳提取工藝條件組合為：A2B2C2D2，即乙醇濃度為70%，料液比為1∶40，提取時間為60 min，提取次數(shù)為2次。

表3 正交實驗結(jié)果

表4 正交試驗方差分析結(jié)果

2.3 驗證試驗

為進一步考察提取工藝的穩(wěn)定可靠，稱取同一批次編號C6蘭香草粉末3份，每份約1 g，精密稱定，根據(jù)“2.2”項下正交實驗優(yōu)化得到的最佳提取工藝進行驗證試驗。此工藝條件下總黃酮和木犀草素含量，結(jié)果見表5。

表5 正交試驗驗證結(jié)果

2.4 蘭香草總黃酮和木犀草素含量動態(tài)測定結(jié)果與分析

結(jié)果見表6、圖13和圖14，不同采收期蘭香草藥材中總黃酮及木犀草素含量不同，兩者總體變化趨勢均隨著藥材生長不斷遞增，1月和2月含量最低，9月達到峰值(總黃酮平均含量為96.95 mg/g，RSD為0.50%；木犀草素平均含量為226.48μg/g，RSD為1.05%)，之后逐漸減低。其中，總黃酮和木犀草素含量1月與2月無顯著性差異(P>0.05)，但與其他采收時間差異顯著(P<0.01)；總黃酮含量9月與其他采收時間差異顯著(P<0.01)；木犀草素含量8月與9月無顯著性差異(P>0.05)，但與其他采收時間差異顯著(P<0.01)。

表6 不同采收期蘭香草中總黃酮和木犀草素含量測定結(jié)果

圖13 不同采收期蘭香草中總黃酮含量

圖14 不同采收期蘭香草中木犀草素含量

3 討論

蘭香草為壯族民間常用草藥，目前尚未明確蘭香草的藥效成分，但蘭香草中含有豐富的黃酮類成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)痛、降血糖、心血管系統(tǒng)保護及防治阿爾茨海默病等藥理活性[12-16]。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，存在于許多中藥中，課題組前期從蘭香草中分離鑒定出來木犀草素，在蘭香草中含量比較高，同樣具有很好的藥理活性，如抗過敏、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、心臟保護和神經(jīng)保護等[17-21]，臨床主要用于治療肝炎、心血管疾病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、降尿酸和止咳化痰等。因此，本實驗選擇總黃酮和木犀草素作為評價蘭香草藥材質(zhì)量的重要指標之一，建立其含量測定方法，優(yōu)化提取工藝，并分析其含量動態(tài)積累變化趨勢，以指導(dǎo)該藥材制定合理采收時間。

在含量測定方法建立中，采用紫外-可見分光光度法總黃酮含量測定，以蘆丁為對照品，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH作為顯色系統(tǒng)，使蘆丁的鄰二酚羥基形成絡(luò)合物而顯色，在500 nm處有最大吸收。同時，采用高效液相色譜法木犀草素含量測定，并對流動相和檢測波長這兩個色譜條件進行了摸索。流動相曾考察了乙腈-水(28∶72)、甲醇-水(45∶55)、乙腈-0.2%磷酸溶液(28∶72)、甲醇-0.2%磷酸溶液(45∶55)，結(jié)果表明以甲醇-0.2%磷酸溶液(45∶55)為流動相時，圖譜基線平緩，木犀草素的響應(yīng)值好，峰形好，與相鄰色譜峰分離度好，理論塔板數(shù)、拖尾因子等均符合要求。檢測波長的選擇，采用二極管陣列檢測器在波長為190～400 nm范圍內(nèi)進行掃描，發(fā)現(xiàn)木犀草素在254 nm和350 nm處有最大紫外吸收，因此本實驗根據(jù)掃描結(jié)果結(jié)合文獻報道考察了254 nm、280 nm、350 nm、360 nm這4個不同波長圖譜情況，結(jié)果表明在350 nm處測定時，木犀草素有較強吸收，且干擾甚少，圖譜特征性也很強。另外，進行了總黃酮和木犀草素含量測定的方法學(xué)考察，結(jié)果表明本測定方法儀器精密度好，操作簡便、穩(wěn)定可行，可作為蘭香草中總黃酮和木犀草素含量測定的方法。

提取工藝優(yōu)化考察，根據(jù)此單因素試驗結(jié)果，選擇乙醇濃度、料液比、提取時間和提取次數(shù)作為考察超聲提取的四個影響因素，采用L9(34)正交實驗優(yōu)化提取蘭香草總黃酮和木犀草素的最佳工藝，結(jié)果顯示最佳超聲提取工藝條件為：乙醇濃度為70%，料液比為1∶40，提取時間為60 min，提取次數(shù)為2次。正交實驗結(jié)果剛好跟單因素考察結(jié)果是一致的，提示該超聲提取工藝簡單合理、提取率高、穩(wěn)定性好，為蘭香草工業(yè)化生產(chǎn)奠定了實驗基礎(chǔ)。

蘭香草的藥用部位是全草或帶根全草，1月和2月為休眠期，植株枯萎倒塌，此時總黃酮和木犀草素含量是最低的。3月初蘭香草種子萌芽展葉，植株非常小，總黃酮和木犀草素含量低。隨著月份增加，4-5月不斷抽生新枝展葉生長，植株逐漸長高，總黃酮和木犀草素含量有所增加。6-8月為植株營養(yǎng)生長旺盛期，枝條迅速抽長，株高和冠幅增長也非?？欤傸S酮和木犀草素含量增加幅度很大。8月底進入生殖生長期，9月底植株達到最大生長高度，總黃酮和木犀草素含量達到最大值，且木犀草素含量在8月與9月無顯著性差異(P>0.05)。由此可知，在營養(yǎng)生長旺盛和生殖生長期，陽光和雨水充足，溫度適宜，植株生長迅速，利于總黃酮和木犀草素的生物合成。10月開始，天氣逐漸轉(zhuǎn)涼，總黃酮和木犀草素含量逐漸降低，12月植株地上部分枯萎落葉，進入休眠期，其含量大幅度降低。因此，本實驗認為廣西宜州蘭香草藥材的采收，以總黃酮含量為評價指標時，9月采收最佳；以木犀草素含量為評價指標時，8月和9月采收最佳。