廣金錢草藥材的UPLC特征圖譜及其質(zhì)量評(píng)價(jià)

賈小舟，楊小龍，梁月儀，潘曉君，李振雨，林碧珊，陳向東，魏 梅，孫冬梅*

(1.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510400；3.國(guó)藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528305)

廣金錢草來(lái)源于豆科植物廣金錢草Desmodiumstyracifolium(Osb.)Merr.的干燥地上部分[1]，采收季節(jié)為夏季、秋季，去雜曬干。廣金錢草是我國(guó)常用的傳統(tǒng)中藥之一，氣微香，味甘、性涼，歸于肝、腎、膀胱經(jīng)[2]，其藥用部位為干燥地上部分?，F(xiàn)代藥理研究表明，廣金錢草具有清熱除濕、利尿通淋、排石等作用，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)治腎、肝、膽結(jié)石，尿路感染、消炎及改善心血管等病癥[3-4]。廣金錢草含有黃酮、生物堿、多糖等多種成分，其中黃酮類化合物為廣金錢草的主要組成成分，具有多種藥理作用，如降血壓、利尿、利膽及溶解或預(yù)防泌尿系結(jié)石等。廣金錢草中的芹菜素黃酮碳苷類成分主要是夏佛塔苷及其同分異構(gòu)體異夏佛塔苷，在抗炎、清熱祛濕、利尿通淋等方面具有重要活性作用[5]。因夏佛塔苷預(yù)防腎結(jié)石效果顯著，該化合物的葡萄糖苷或阿拉伯糖苷的注射劑或口服劑型已在日本獲得專利授權(quán)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立廣金錢草特征圖譜檢測(cè)方法，結(jié)合特征圖譜相似度分析、化學(xué)成分聚類分析，綜合特征圖譜及多指標(biāo)含量測(cè)定，對(duì)市售藥材廣金錢草的質(zhì)量情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UPLC(Waters H-Class，USA)；美國(guó)賽默飛四極桿-靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(UHPLC-Q-Exactive Obitriap MS，Thermos)；UPLC CORTECS T3色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.6 μm，Waters)；百萬(wàn)分之一天平(XP 26，瑞士梅特勒多)；數(shù)顯超聲波清洗器(KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(HWS28，上海一恒科技有限公司)；超純水系統(tǒng)(Milli-QDirect 8，Merck KGAA)。

1.2 試劑與試藥

甲醇、乙腈(默克股份有限公司)，磷酸、甲酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)為色譜純，其余試劑皆為分析純。夏佛塔苷(批號(hào)：111912-201302，NIFDC)；異葒草苷(批號(hào)：111974-201401，NIFDC)；異夏佛塔苷(批號(hào)：DST170323-019，Desite)；異牡荊苷(批號(hào)：DST170214-054，Desite)；廣金錢草對(duì)照藥材(批號(hào)：121248-201104，NIFDC)。18批廣金錢草藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定其來(lái)源為豆科植物廣金錢草Desmodiumstyracifolium(Osb.)Merr.的干燥地上部分，見(jiàn)表1。

表1 18批廣金錢草藥材來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

UPLC CORTECS T3色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.6 μm，Waters)；乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸(質(zhì)譜分析為0.1%甲酸溶液)為流動(dòng)相B，設(shè)定梯度洗脫程序(0～10 min，15%A；10～11 min，15→16%A；11～15 min，16%A)；柱溫：30 ℃；流速設(shè)置為0.2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為340 nm。

2.2 質(zhì)譜條件

高分辨質(zhì)譜為電噴霧離子源(HESI)，噴霧電壓設(shè)置為3.80 kV，輔助氣溫設(shè)置為350 ℃，離子傳輸管溫度設(shè)置為350 ℃；鞘氣流速設(shè)置為35 psi；輔助氣流速設(shè)置為10 psi；離子模式設(shè)置正、負(fù)模式，并分別掃描采集，掃描質(zhì)量范圍為120～1 000 Da；S-lens電壓50 V；二級(jí)碰撞能量設(shè)置為20、40、60 eV。

2.3 供試品溶液制備

取18批廣金錢草藥材、廣金錢草對(duì)照藥材，粉碎，過(guò)三號(hào)篩，取約1 g，精密稱量，放置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，稱定其總質(zhì)量，超聲波處理(功率500 W，頻率40 kHz)20 min，冷卻至室溫后，再次稱其質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減量，搖晃均勻，過(guò)0.22 μm的濾膜，取其續(xù)濾液，置于液相小瓶，即得待測(cè)溶液。

2.4 特征圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取其中一批廣金錢草藥材(S8)，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，根據(jù)“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣 6 次，記錄色譜圖，以夏佛塔苷峰為參照峰，計(jì)算各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，RSD值均小于3%，這個(gè)結(jié)果說(shuō)明儀器精密度狀態(tài)良好。

2.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取其中一批廣金錢草藥材(S8)，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，根據(jù)“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣測(cè)定。以夏佛塔苷峰為參照峰，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，待測(cè)液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD值均小于3%。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取其中一批廣金錢草藥材(S8)，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，根據(jù)“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以夏佛塔苷色譜峰為參照峰，計(jì)算其相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積，結(jié)果證實(shí)RSD值均小于 3%，這個(gè)結(jié)果說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.5 廣金錢草特征圖譜建立

2.5.1 共有峰的確定 取廣金錢草藥材共18批，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，根據(jù)“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，18批廣金錢草藥材特征圖譜共有峰標(biāo)識(shí)使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件》，并自動(dòng)生成對(duì)照?qǐng)D譜，圖1為18批廣金錢草藥材特征圖譜疊加圖，以平均數(shù)法生成藥材廣金錢草對(duì)照特征圖譜，見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，7個(gè)特征峰存在于18批廣金錢草藥材的特征圖譜中，其中，色譜峰3夏佛塔苷由于分離效果好、出峰穩(wěn)定，因此選為參照峰，色譜峰4為異葒草苷，色譜峰6為異夏佛塔苷，色譜峰7為異牡荊苷，具有與廣金錢草對(duì)照藥材保持一致性的特征峰。通過(guò)計(jì)算廣金錢草特征圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積，得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.00%～1.46%，相對(duì)峰面積的RSD在0.00%～20.34%，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地廣金錢草藥材的各特征峰峰面積存在一定差異，色譜峰2相對(duì)峰面積范圍為0.289～0.348，色譜峰4相對(duì)峰面積范圍為0.131～0.259，色譜峰5相對(duì)峰面積范圍為0.168～0.253，色譜峰6相對(duì)峰面積范圍為0.568～0.663，色譜峰7相對(duì)峰面積范圍為0.174～0.258。結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

圖1 18批廣金錢草藥材特征圖譜

注：峰3(S)：夏佛塔苷；峰4：異葒草苷；峰6：異夏佛塔苷；峰7：異牡荊苷。

表2 18批廣金錢草藥材特征圖譜相對(duì)保留時(shí)間

表3 18批廣金錢草藥材特征圖譜峰面積

2.5.2 相似度評(píng)價(jià)[6]通過(guò)以18批廣金錢草藥材生成的共有模式(S0)作為對(duì)照特征圖譜，與18批廣金錢草藥材進(jìn)行相似度比較，相似度范圍均超過(guò)0.9，這表明不同產(chǎn)地廣金錢草藥材相似度接近。市售廣金錢草藥材的相似度也較為接近，說(shuō)明市售廣金錢草質(zhì)量較穩(wěn)定。

2.5.3 廣金錢草樣品聚類分析[7]運(yùn)用SIMCA 14.1軟件對(duì)18批廣金錢草藥材樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類，聚類結(jié)果為廣金錢草藥材樣品分為3類，Ⅰ類包括S4、S5、S7；Ⅱ類包括S8、S9、S12、S13、S15、S16、S18；Ⅲ類包括S2、S3、S17、S14、S6、S1、S10、S11。總體看，廣東、廣西市售的廣金錢草藥材質(zhì)量差別不明顯。見(jiàn)圖3。

圖3 18批廣金錢草藥材聚類分析結(jié)果

2.5.4 共有峰指認(rèn)[8]通過(guò)與相應(yīng)對(duì)照品保留時(shí)間比較，結(jié)合二級(jí)管陣列檢測(cè)器光譜吸收曲線比對(duì)，初步確定色譜峰3為夏佛塔苷，色譜峰4為異葒草苷，色譜峰6為異夏佛塔苷，色譜峰7為異牡荊苷，結(jié)果見(jiàn)圖4。取其中一批廣金錢草藥材(S1)待測(cè)液，參照“2.1”項(xiàng)下色譜條件和“2.2”項(xiàng)下質(zhì)譜條件對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行分析，根據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的準(zhǔn)確分子量與廣金錢草已知組分的分子量進(jìn)行對(duì)比，對(duì)于質(zhì)量偏差小于3 ppm 的組分予以確認(rèn)，且根據(jù)目標(biāo)色譜峰的二級(jí)質(zhì)譜信息，與 mzVault 標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

圖4 廣金錢草總離子流及紫外吸收色譜

表4 廣金錢草藥材共有峰質(zhì)譜信息

3 討論

廣金錢草主要功效是清熱除濕、利尿通淋，為嶺南地區(qū)傳統(tǒng)中藥，臨床上用于醫(yī)治泌尿系結(jié)石，療效十分顯著[9-10]。黃酮類成分為廣金錢草的主要藥理活性成分，具有降血壓，增加冠狀動(dòng)脈、腦、腎血流，有利尿、利膽及溶解或預(yù)防泌尿系結(jié)石等作用。廣金錢草起抗炎、清熱祛濕、利尿通淋等作用[9]的重要活性成分——夏佛塔苷及異夏佛塔苷[11-12]兩者互為同分異構(gòu)體，屬于芹菜素黃酮碳苷類化合物。作為常用且用量較大的中藥，廣金錢草藥材品質(zhì)的優(yōu)劣備受人們關(guān)注[13]，而更好地快速評(píng)價(jià)廣金錢草藥材的質(zhì)量尤為重要。

本研究對(duì)特征圖譜方法中的液相色譜柱、最佳吸收波長(zhǎng)、流動(dòng)相種類、流速及柱溫分別進(jìn)行了耐用性考察。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，UPLC CORTECS T3色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.6 μm，Waters)分離效果最好，峰型比較好；考察了不同流動(dòng)相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各色譜峰分離效果最好的條件是流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸溶液。全波長(zhǎng)掃描采用PDA，比較了不同檢測(cè)波長(zhǎng)下各色譜峰的響應(yīng)，根據(jù)色譜結(jié)果，色譜峰最多的在340 nm 處，且各色譜峰響應(yīng)值較高。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)特征圖譜特征峰相似度評(píng)價(jià)分析，結(jié)合聚類分析對(duì)市售不同產(chǎn)地的廣金錢草藥材特征圖譜進(jìn)行分析總結(jié)，得出18批廣金錢草藥材特征圖譜相似度超過(guò)0.9，這個(gè)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地種植的廣金錢草藥材具有較高的相似度。本研究所用的18批廣金錢草藥材經(jīng)由聚類分析軟件分為3類，結(jié)合聚類分析、峰面積測(cè)定結(jié)果可知，兩廣地區(qū)生產(chǎn)的廣金錢草藥材質(zhì)量穩(wěn)定性好、差異性小。本研究通過(guò)廣金錢草特征圖譜特征峰方法，為廣金錢草藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一定依據(jù)，為今后深入研究廣金錢草藥材奠定了基礎(chǔ)。