HPLC法測定苗藥觀音座蓮中紫萁內(nèi)酯苷的含量

封云倩，史辛夷，楊瓊亞，郎天瓊，羅國勇

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

苗藥觀音座蓮，別名馬蹄蕨，為觀音座蓮科觀音座蓮屬的植物福建觀音座蓮(AngiopterisfokiensisHieron.)的根，具有祛風(fēng)解毒、止血之效[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，觀音座蓮還具有抗HIV[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5-6]和改善心絞痛[7]等作用，極具開發(fā)價值。藥用資源的開發(fā)和利用，以建立可行的質(zhì)量標準為前提。目前，觀音座蓮的質(zhì)量標準僅包括水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物等方面[8]，缺少有效成分的含量控制。根據(jù)Taveepanich S等[3]的研究結(jié)果，紫萁內(nèi)酯苷具有顯著抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，并對肺癌細胞表現(xiàn)出顯著的細胞毒作用，表明紫萁內(nèi)酯苷是觀音座蓮中潛在的活性組分?；诖耍Y(jié)合前期開展的化學(xué)成分研究結(jié)果，擬建立苗藥觀音座蓮中紫萁內(nèi)酯苷的HPLC含量測定方法，以期為苗藥觀音座蓮的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。同時，對葉子與根中紫萁內(nèi)酯苷的含量差異進行比較分析，為觀音座蓮以根入藥提供了理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2030C高效液相色譜儀(日本島津公司)，超聲波清洗儀KQ-400KDB型(昆山市超聲儀器有限公司)，萬分之一電子分析天平(上海卓精電子科技有限公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海力辰邦西儀器科技有限公司)。

1.2 材料

紫萁內(nèi)酯苷對照品(實驗室前期分離)；實驗用苗藥觀音座蓮來源見表1，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)趙俊華教授鑒定為觀音座蓮科觀音座蓮屬的福建觀音座蓮，植物標本存放于貴州中醫(yī)藥大學(xué)民族藥重點實驗室；甲醇為色譜純(美國TEDIA天地試劑公司)；磷酸為分析純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；分析用水購于華潤怡寶飲料有限公司。

表1 苗藥觀音座蓮樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液等度洗脫(2∶98)；流速1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：220 nm；進樣量：2 μL。理論塔板數(shù)按紫萁內(nèi)酯苷峰計算不低于11 360。

2.2 溶液配置

2.2.1 對照品溶液制備 稱取紫萁內(nèi)酯苷對照品10 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶，加入適量甲醇溶解，再加甲醇定容至刻度，搖勻即得1.094 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 稱取福建觀音座蓮粉末0.5 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密移取提取溶劑30%甲醇30 mL，稱定質(zhì)量，50 ℃下，加熱回流提取1 h，冷卻后補重，過濾，取續(xù)濾液，過0.22 μm微孔濾膜即得供試品溶液。

2.3 專屬性實驗

分別取對照品溶液、供試品溶液按“2.1”項下方法進樣，在該色譜條件下，供試品中紫萁內(nèi)酯苷與對照品色譜峰保留時間一致，與鄰峰分離度>1.5。說明該方法專屬性良好。色譜見圖1。

注：A：對照品溶液；B供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項下對照品溶液1.0 mL、1.8 mL、2.6 mL、3.4 mL、4.2 mL、5.0 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，按“2.1”項下方法測定。以紫萁內(nèi)酯苷濃度(mg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程：Y=2 260 576.03X+4 710.3(Y為峰面積，X為對照品濃度)，r=0.999 9。紫萁內(nèi)酯苷在0.101～0.505 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

取“2.2.1”項下對照品溶液按“2.1”項下方法連續(xù)進樣6次，測得紫萁內(nèi)酯苷峰面積的RSD為0.54%。表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

按“2.2.2”項下的操作制備福建觀音座蓮供試品溶液于室溫下放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h后，按“2.1”項下色譜條件進行進樣分析，測得紫萁內(nèi)酯苷峰面積的RSD為0.63%，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

按“2.2.2”項下的操作平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行進樣分析，測得紫萁內(nèi)酯苷峰面積的RSD為1.2%，表明該方法重復(fù)性良好。該批次樣品的平均含量為1.1%。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的觀音座蓮末6份，每份0.25 g，含量按1.1%計算，精密量取1.034 mg/mL的紫萁內(nèi)酯苷對照品溶液3 mL，分別加入6份樣品中，按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行進樣分析，計算回收率。結(jié)果紫萁內(nèi)酯苷平均回收率(n=6)為97.33%，RSD為2.02%，表明本方法具有較好的加樣回收率。見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果

2.9 樣品含量測定

實驗前期對福建觀音座蓮的提取工藝進行考察，最終確定的提取方法為精密稱取觀音坐蓮粉末1 g，以20%的甲醇作為溶劑，料液比為1∶20，在40 ℃下，超聲時間為10 min，超聲功率為240 W。分別取11批次福建觀音座蓮的葉子與根共22個樣品按照上述提取方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行進樣分析，并計算含量。樣品含量測定結(jié)果見表3。

表3 11批次福建觀音座蓮的含量測定 (%)

2.10 統(tǒng)計學(xué)處理

表4 各組紫萁內(nèi)酯苷的含量

表5 單因素ANOVA分析結(jié)果

3 討論

3.1 檢測波長選擇

在紫外檢測器220 nm及254 nm下進行掃描，發(fā)現(xiàn)在末端吸收220 nm下待測成分有良好的吸收，分離效果較理想，因此選擇220 nm作為檢測波長。

3.2 結(jié)果分析

通過對采集的11個批次藥材進行分析發(fā)現(xiàn)，葉子中紫萁內(nèi)酯苷的含量顯著低于根中的含量(1.25% VS 3.97%；P<0.01)，這為苗藥觀音座蓮以根入藥提供了理論依據(jù)。導(dǎo)致葉和根中有效成分含量差異的原因可能有：①根莖類藥材宜在秋冬季節(jié)采摘，而葉類藥材則適合在其光合作用最強時采集。本次分析樣品均在秋季采樣，導(dǎo)致根中累積的紫萁內(nèi)酯苷較多，而葉子的光合作用較弱，其紫萁內(nèi)酯苷的含量較低。②在生長過程中，觀音座蓮的根部可能更有利于化學(xué)成分貯存。事實上，同一成分在同一植物的不同部位存在差異極其常見，如許婷等[9]通過對淫羊藿藥材葉片、葉柄及莖3個部位進行研究表明，其葉片中黃酮類成分含量顯著高于莖及葉柄；李紅娟等[10]的研究結(jié)果顯示，白茯苓、茯神與赤茯苓中三萜酸成分存在顯著差異，以后者的茯苓酸含量最高。

4 結(jié)語

基于HPLC，建立了苗藥觀音座蓮中活性成分紫萁內(nèi)酯苷的含量測定方法。該方法簡便快速、準確可行，為該藥用資源的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。進一步的含量分析結(jié)果顯示，紫萁內(nèi)酯苷在福建觀音座蓮根中的平均含量顯著高于其在葉子中的含量，這為苗藥觀音座蓮以根入藥提供了理論依據(jù)。