小薊內(nèi)生真菌Chaetomium Bostrychodes次級(jí)代謝產(chǎn)物及其生物活性研究

吳 迪，徐奧然，牟青林，鮮鵬杰，柳樹(shù)直，黃澤雕，楊 健，王文靜*，楊小龍*

(1.中南民族大學(xué) 藥學(xué)院 湖北省少數(shù)民族醫(yī)學(xué)現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430074；2.重慶大學(xué) 藥學(xué)院，重慶 401331；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 國(guó)家中藥資源中心道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700)

真菌次級(jí)代謝物具有結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著等特征，是藥物先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源[1]。植物內(nèi)生真菌[2]是指生活在健康植物組織中，與宿主植物互利共生的一類(lèi)特殊真菌[3]。因其生活環(huán)境的特殊性而具有獨(dú)特的代謝體系，可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎，活性?xún)?yōu)良的次級(jí)代謝產(chǎn)物[4]。研究表明，植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生萜類(lèi)、生物堿、聚酮、酯類(lèi)、醌類(lèi)、酚類(lèi)等類(lèi)型多樣的天然產(chǎn)物，且部分化合物具有顯著抗菌活性[5-12]。因此，從植物內(nèi)生真菌中尋找新型的抗菌藥物先導(dǎo)化合物研究前景廣闊。

毛殼屬(Chaetomium)真菌具有豐富的次生代謝產(chǎn)物，至今已從該屬真菌中分離得到300多個(gè)化合物[13-14]，是微生物天然產(chǎn)物研究的熱點(diǎn)之一。旋絲毛殼(Chaetomiumbostrychodes)為毛殼屬的分支，是一種植物病源真菌，最早由Zopf分類(lèi)并鑒定[15]。研究表明，旋絲毛殼對(duì)病原菌有較強(qiáng)的拮抗作用[16]。目前，關(guān)于其次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究選擇一株小薊內(nèi)生旋絲毛殼菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵，并對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)分離，以期從中分離得到具有抗菌活性的先導(dǎo)化合物。最終從該菌株大米發(fā)酵產(chǎn)物中共分離得到9個(gè)單體化合物，并進(jìn)行抗菌活性測(cè)試。對(duì)該菌次級(jí)代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)及生物活性的研究，可為該種屬真菌的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株來(lái)源 該菌株分離自2017年采自寧夏銀川的小薊葉片，編號(hào)為XL-1371，經(jīng)ITS序列鑒定為旋絲毛殼菌(C.bostrychodes)，GenBank編號(hào)為MW960270，現(xiàn)保存于中南民族大學(xué)藥學(xué)院民族藥與藥用菌研究組。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基(每升水中含0.5% 馬鈴薯浸粉，1.5% 葡萄糖，1% 蛋白胨，0.5% 氯化鈉)，MEB培養(yǎng)基(每升水中含2% 的麥芽浸粉，2% 的蔗糖，1% 的蛋白胨)，LB培養(yǎng)基(每升水中包含1% 胰蛋白胨，0.5% 酵母提取物，10% NaCl)。

1.1.3 植物病源真菌和臨床耐藥細(xì)菌 8株植物病原真菌(油菜菌核菌Sclerotiniasclerotiorum，水稻紋枯菌Rhizoctoniasolani，玉米小斑菌Helminthosporiummaydis，花生黑斑菌Cercosporapersonata，番茄灰霉病菌BotrytiscinereaPers，小麥赤霉菌Gibberellasaubinetii，黃瓜褐斑菌Corynesporacassiicola，煙草赤星菌Alternarialongipes)，8株臨床耐藥細(xì)菌(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌Methicinllin-resistantStaphylococcusaureus，多耐藥性表皮葡萄球菌Multidrug-resistantStaphylococcusepidermidis，多耐藥性屎腸球菌Multidrug-resistantEnterococcusfaecium，多耐藥性糞腸球菌Multidrug-resistantEnterococcusfaecalis，耐碳青霉烯銅綠假單胞菌Carbapenems-resistantPseudomonasaeruginosa，耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌Carbapenems-resistantAcinetobacterbaumannii，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌Carbapenems-resistantKlebsiellapneumoniae，耐碳青霉烯大腸埃希菌Carbapenems-resistantEscherichiacoli)。

1.1.4 儀器和試劑 10%次氯酸鈉、75%乙醇、甘油、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等有機(jī)試劑(分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司)；GF254薄層色譜硅膠板，柱層析硅膠(80～100目，100～200目)(安徽良臣硅源材料有限公司)；葡聚糖凝膠LH-20(上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司)；BHC-1300IIA2型超凈工作臺(tái)(蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司)；SPK-250BIII型生化培養(yǎng)箱購(gòu)自上海天呈科技有限公司；LDZM-80KCS型壓力蒸汽滅菌鍋購(gòu)自森塔實(shí)驗(yàn)室科技服務(wù)有限公司；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自上海愛(ài)朗儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；恒溫水浴鍋購(gòu)自上海愛(ài)朗儀器有限公司；C-18液相柱購(gòu)自Waters 公司(4.6 mm×250 mm)；Bruker Avance Ⅲ 600 MHz 購(gòu)自瑞士Bruker 公司。Autopol Ⅳ 旋光儀購(gòu)自美國(guó)魯?shù)婪蚬?。Q ExactiveTMObitrap 高分辨質(zhì)譜儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離純化 植物內(nèi)生真菌的分離純化采用組織切塊法，首先用自來(lái)水沖掉小薊葉片受損的部位，然后用75%的乙醇浸泡3 min，無(wú)菌水沖洗3次，再用10%次氯酸鈉溶液浸泡3 min，無(wú)菌水沖洗3次，放置于超凈工作臺(tái)中晾干。用無(wú)菌手術(shù)刀將葉片部分切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，用無(wú)菌鑷子將下表皮揭開(kāi)，正面朝上置于含有0.12 g/L氯霉素的PDA平板上，每個(gè)平板均勻放置3～4塊，平板密封后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱。當(dāng)葉片塊邊緣有肉眼可見(jiàn)的菌落后，采用菌絲頂端純化法，用接種針挑取少許單一菌落邊緣的菌絲，按照平板劃線(xiàn)法，將其轉(zhuǎn)接到含氯霉素的PDA平板，封口，倒置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌落或菌絲后重復(fù)上述操作3～4次，定時(shí)觀察并記錄菌落生長(zhǎng)狀態(tài)，經(jīng)多次純化后，得到單一菌落。

1.2.2 菌種鑒定 單一菌種經(jīng)ITS序列鑒定，ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)為正向引物，ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)為反向引物。

1.2.3 種子液制備 2 000 mL PDB液體培養(yǎng)基分裝入7個(gè)1 000 mL錐形瓶中，每瓶約300 mL，封口膜封住，121 ℃滅菌30 min。滅完菌后放至常溫，在超凈工作臺(tái)中將于PDA平板活化好的菌種切成小塊，均勻接入錐形瓶中，于136 rpm，28 ℃的條件下?lián)u床培養(yǎng)4 d，待長(zhǎng)出明顯菌球即種子液制備完畢。

1.2.4 大規(guī)模發(fā)酵 發(fā)酵培養(yǎng)基為大米+MEB液體培養(yǎng)基。每個(gè)錐形瓶(1 000 mL)中加入250 g大米和250 mL MEB培養(yǎng)基，封口膜封住，121 ℃滅菌30 min。滅完菌后放至常溫，在超凈工作臺(tái)中，加入10 mL種子液，混合均勻，28 ℃靜置中培養(yǎng)30 d，共發(fā)酵200瓶。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物提取 發(fā)酵完成后，每個(gè)錐形瓶中加入300 mL甲醇，浸泡6 h，將溶劑和發(fā)酵物轉(zhuǎn)移出來(lái)，甲醇提取3次，減壓濃縮后得到甲醇提取物，再加水進(jìn)行分散，并用等體積乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮，最終獲得60 g粗浸膏。

1.2.6 次級(jí)代謝產(chǎn)物分離 首先選擇硅膠色譜柱進(jìn)行分離，洗脫劑為二氯甲烷/甲醇(比例：100∶0-50∶1-20∶1-10∶1-5∶1-2∶1-1∶1)，分離得到6個(gè)組分(編號(hào)為A-F)。B組分再次采用硅膠柱進(jìn)行分離，洗脫劑為二氯甲烷/甲醇(比例為60∶1-40∶1-20∶1-10∶1-0∶1),得到2個(gè)組分(編號(hào)為Fr.B.1和Fr.B.2)，F(xiàn)r.B.1經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠柱(洗脫劑為二氯甲烷∶甲醇=1∶1)得到5個(gè)組分(編號(hào)為Fr.B.1.1-Fr.B.1.5)，F(xiàn)r.B.1.2經(jīng)HPLC(MeOH-H2O，85∶15，v/v)純化得到化合物3 (tR= 22.2 min) (2 mg)，F(xiàn)r.B.1.3經(jīng)HPLC(MeOH-H2O，20%→100%，30 min，v/v)純化得到化合物6 (tR=18.8 min) (4.5 mg)。C組分經(jīng)過(guò)硅膠柱層析，洗脫劑為二氯甲烷/甲醇(比例為30∶1-20∶1-10∶1-0∶1)，得到4個(gè)組分(編號(hào)為Fr.C.1-Fr.C.4)，F(xiàn)r.C.2經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠色譜柱(洗脫劑為甲醇)得到化合物7 (10 mg)。Fr.C.3經(jīng)HPLC(MeOH-H2O，20→100，30 min，v/v)純化得到4 (tR= 11.1 min)(7 mg)和5 (tR=7.39 min)(5.5 mg)。D組分采用硅膠柱層析，洗脫劑為二氯甲烷/甲醇(洗脫比例為60∶1-40∶1-20∶1-10∶1-0∶1)，得到7個(gè)組分(編號(hào)為Fr.D.1-Fr.D.7)，F(xiàn)r.D.2經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠色譜柱(洗脫劑為二氯甲烷∶甲醇=1∶1)，得到4個(gè)組分Fr.D.2.1-Fr.D.2.4，F(xiàn)r.D.2.3經(jīng)過(guò)HPLC(MeOH-H2O，93∶7，v/v)純化得到化合物2 (tR=24.8 min)(7 mg)和1(1.7 mg)(tR=27.1 min)。Fr.D.3經(jīng)過(guò)HPLC(MeOH-H2O，70∶30，v/v)純化得到化合物8(tR=18.6 min)(6 mg)，F(xiàn)r.D.6經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠色譜柱(洗脫劑為甲醇)，得到化合物9(4 mg)。

1.2.7 活性檢測(cè) (1)單體化合物抗細(xì)菌活性評(píng)價(jià)：采用二倍稀釋法評(píng)價(jià)單體化合物的抗細(xì)菌活性。具體步驟如下：配制抗細(xì)菌活性所需的LB培養(yǎng)基并分裝至試管中，每只試管裝入15 mL培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌后晾涼備用。選取實(shí)驗(yàn)所需的8株臨床耐藥細(xì)菌，分別接種至已滅菌處理的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min振搖培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)液渾濁且不沉淀，培養(yǎng)完成。將被測(cè)單體化合物和陽(yáng)性對(duì)照(環(huán)丙沙星)分別用DMSO配置成濃度為10 mg/mL的樣品溶液。在超凈工作臺(tái)中取試管中培養(yǎng)好的細(xì)菌液體100μL，加入100 mL LB培養(yǎng)基中稀釋1 000倍。在96孔板的第一排加入198μL稀釋后的菌液，第二至八排中分別加入100μL稀釋后的菌液。第一排孔中分別加入待測(cè)樣品、空白(DMSO)、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照2μL，移液槍抽吸混合均勻(此時(shí)第一排孔的樣品與陽(yáng)性對(duì)照的濃度均為100μg/mL)后吸取100μL混合液至第二排，將其混合均勻后吸取100μL混合液至第三排，后面幾排操作同上，最后一排孔中吸出的混合液當(dāng)廢液打入廢液缸中。使每排樣品終濃度依次為100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.12μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL。將處理好的96孔板置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，每隔2 h觀察1次，待陰性對(duì)照組長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)菌，記錄活性結(jié)果，將最后一排澄清的孔所對(duì)應(yīng)的樣品濃度定為該化合物的最小抑菌濃度，同時(shí)記錄陽(yáng)性對(duì)照的最小抑菌濃度。將觀察完結(jié)果的96孔板及所用實(shí)驗(yàn)器材進(jìn)行滅菌后處理。

(2)單體化合物抗真菌活性評(píng)價(jià)：采用二倍稀釋法評(píng)價(jià)單體化合物的抗真菌活性。具體步驟如下：將需要測(cè)活性的單體化合物、陽(yáng)性對(duì)照(酮康唑)用DMSO配置成濃度為10 mg/mL的樣品。配制抗菌活性所需的PDB培養(yǎng)基，分裝至錐形瓶中，每瓶裝入100 mL培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌后晾涼，選取實(shí)驗(yàn)所需的8株植物病原真菌接種至PDB培養(yǎng)基中，28 ℃，160 r/min振搖培養(yǎng)2 d。在超凈工作臺(tái)中操作，取錐形瓶中培養(yǎng)好的真菌液1 mL加入100 mL PDB培養(yǎng)基中稀釋100倍。在96孔板的第一排加入198稀釋后的菌液，第二至八排中加入100μL稀釋后的菌液。第一排孔中分別加入樣品、空白、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照2μL，移液槍抽吸混合均勻(此時(shí)第一排孔的樣品與陽(yáng)性對(duì)照的濃度均為100μg/mL)后吸取100μL混合液至第二排，將其混合均勻后吸取100μL混合液至第三排，后面幾排操作同上，最后一排孔中吸出的混合液當(dāng)廢液打入廢液缸中。使每排樣品終濃度依次為100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.12μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL。將處理好的96孔板置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每隔4 h觀察1次，待陰性對(duì)照組長(zhǎng)滿(mǎn)真菌記錄活性結(jié)果，將最后一排澄清的孔所對(duì)應(yīng)的樣品濃度定為該化合物的最小抑菌濃度，同時(shí)記錄下陽(yáng)性對(duì)照的最小抑菌濃度。將觀察完結(jié)果的96孔板及所用實(shí)驗(yàn)器材進(jìn)行滅菌后處理。

2 結(jié)果與分析

采用大米+MEB培養(yǎng)基對(duì)C.bostrychodes進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)各種色譜柱和HPLC半制備等方法對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到9個(gè)單體化合物(圖1)，經(jīng)NMR和HRESIMS圖譜分析結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)分別鑒定為aurasperone A(1)、fonsecinone A (2)、granulolactone (3)、4-hydroxyphenylacetone (4)、latifolicinin C (5)、p-hydroxy-benzoic acid ethylester (6)、p-hydroxybenzoic acid (7)、phallac acid A (8)、1，2，4-benzenetriol (9)。

2.1 化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定

綠色固體，C32H26O10，HRESIMSm/z571.159 4 [M + H]+(calcd for C32H27O10，571.160 4)，1H NMR (600 MHz，CDCl3-d1)，δH：2.48(3H，s，2-CH3)，6.34 (1H，s，H-3)，12.84 (1H，s，5-OH)，7.05 (1H，s，H-6)，6.97 (1H，s，H-7)，3.78 (3H，s，8-OCH3)，3.42 (3H，s，10-OCH3)，2.12 (3H，s，2′-CH3)，6.01 (1H，s，H-3′)，15.25 (1H，s，5′-OH)，4.03 (3H，s，6′-OCH3)，6.43 (1H，d，J=2.4 Hz，H-7′)，3.61 (3H，s，8′-OCH3)，6.19 (1H，d，J=3.0 Hz，H-9′)；13C NMR (150 MHz，CDCl3-d1)，δC：167.7 (C-2)，20.6 (C-2-CH3)，110.7 (C-3)，182.9 (C-4)，109.4 (C-4a)，156.7(C-5)，106.0 (C-6)，140.8 (C-6a)，101.6 (C-7)，160.0 (C-8)，56.0 (C-8-OCH3)，117.1 (C-9)，156.9 (C-10)，108.0 (C-10a)，155.1 (C-10b)，166.9 (C-2′)，20.7 (C-2′-CH3)，107.4 (C-3′)，184.6 (C-4′)，104.2 (C-4′a)，162.8 (C-5′)，108.6 (C-5′a)，161.1 (C-6′)，56.2 (C-6′-OCH3)，97.0 (C-7′)，161.6 (C-8′)，55.2 (C-8′-OCH3)，96.0 (C-9′)，140.6 (C-9′a)，105.0 (C-10′)，150.8 (C-10′a)。對(duì)比文獻(xiàn)[17]結(jié)構(gòu)確定為aurasperone A。

2.2 化合物2的結(jié)構(gòu)鑒定

綠色固體，C32H26O10，HRESIMSm/z571.159 3 [M + H]+(calcd for C32H27O10，571.160 4)，1H NMR(600 MHz，CDCl3-d1)，δH：2.41 (3H，s，2-CH3)，6.05 (1H，s，H-3)，14.83 (1H，s，5-OH)，3.46 (3H，s，6-OCH3)，3.78 (3H，s，8-OCH3)，6.97 (1H，s，H-9)，7.15 (1H，s，H-10)，2.12 (3H，s，2′-CH3)，5.98 (1H，s，H-3′)，15.25(1H，s，5′-OH)，4.02 (3H，s，6′-OCH3)，6.41 (1H，d，J=2.3 Hz，H-7′)，3.62 (3H，s，8′-OCH3)，6.21 (1H，d，J=2.3 Hz，H-9′)；13C NMR (150 MHz，CDCl3-d1)，δC：167.8 (C-2)，21.0 (C-2-CH3)，107.6 (C-3)，184.6 (C-4)，104.9 (C-4a)，162.1 (C-5)，111.6 (C-5a)，158.7 (C-6)，62.2 (C-6-OCH3)，117.8 (C-7)，160.3 (C-8)，56.1 (C-8-OCH3)，101.5 (C-9)，140.9 (C-9a)，101.4 (C-10)，153.5 (C-10a)，167.8 (C-2′)，20.9 (C-2′-CH3)，107.4 (C-3′)，184.8 (C-4′)，104.4 (C-4′a)，162.9 (C-5′)，108.7 (C-5′a)，161.2 (C-6′)，56.4 (C-6′-OCH3)，97.0 (C-7′)，161.6 (C-8′)，55.3 (C-8′-OCH3)，96.6 (C-9′)，140.7 (C-9′a)，105.3 (C-10′)，151.0 (C-10′a)。對(duì)比文獻(xiàn)[17]結(jié)構(gòu)確定為fonsecinone A。

2.3 化合物3的結(jié)構(gòu)鑒定

白色無(wú)定型粉末，C15H18O2，HRESIMSm/z231.137 8 [M + H]+(calcd for C15H19O2，231.138 5)，1H NMR (600 MHz，CDCl3-d1)，δH：2.70 (2H，s，H-1)，4.49 (2H，t，J=6.0 Hz，H-4)，2.93 (2H，t，J=5.9 Hz，H-5)，7.77 (1H，s，H-8)，2.75 (2H，s，H-10)，1.14 (3H，s，H-12)，1.14 (3H，s，H-13)，2.17 (3H，s，H-15)；13C NMR (150 MHz，CDCl3-d1)，δC：47.2 (C-1)，149.3 (C-2)，130.7 (C-3)，66.7 (C-4)，25.1 (C-5)，136.1 (C-6)，123.5 (C-7)，124.1 (C-8)，142.4 (C-9)，47.5 (C-10)，39.7 (C-11)，39.7 (C-11)，28.8 (C-13)，166.2 (C-14)，15.2 (C-15)。對(duì)比文獻(xiàn)[18]確定其結(jié)構(gòu)為granulolactone。

2.4 化合物4的結(jié)構(gòu)鑒定

褐色油狀物，C9H10O2，HRESIMSm/z151.075 20 [M + H]+(calcd for C9H11O2，151.075 9)，1H NMR (600 MHz，CD3OD-d4)，δH：6.73 (2H，d，J=10.2Hz，H-2，6)，7.02 (2H，d，J=10.2Hz，H-3，5)，3.62 (2H，s，H-7)，2.15 (3H，s，H-9)；13C NMR (150 MHz，CD3OD-d4)，δC：157.6 (C-1)，116.4 (C-2，6)，131.5 (C-3，5)，126.6 (C-4)，50.6 (C-7)，210.2 (C-8)，29.0 (C-9).對(duì)比文獻(xiàn)[19]結(jié)構(gòu)確定為4-hydroxyphenylacetone。

2.5 化合物5的結(jié)構(gòu)鑒定

白色粉末，[α]25 D +12 (c0.1，MeOH)，C10H12O4，HRESIMSm/z197.080 6 [M + H]+(calcd for C10H13O4，197.081 4)，1H NMR (600 MHz，CD3OD-d4)，δH：6.70 (2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6)，7.04 (2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5)，2.95 (1H，dd，J=5.24，13.8 Hz，H-7a)，2.83 (1H，dd，J=7.79，14.08 Hz，H-7b)，4.30 (1H，dd，J=5.15，7.56 Hz，H-8)，3.68 (3H，s，H-10)；13C NMR (150 MHz，CD3OD-d4)，δC：157.2 (C-1)，116.0 (C-2，6)，131.5 (C-3，5)，129.1 (C-4)，157.2 (C-1)，40.8 (C-7)，175.8 (C-9)，52.3 (C-10)。對(duì)比文獻(xiàn)[20]結(jié)構(gòu)確定為latifolicinin C。

2.6 化合物6的結(jié)構(gòu)鑒定

黃色粉末，C9H10O3，HRESIMSm/z167.070 1 [M + H]+(calcd for C10H11O3，167.070 8)，1H NMR (600 MHz，CD3OD-d4)，δH：6.82 (2H，d，J=8.8 Hz，H-2，6)，7.86 (2H，d，J=8.8 Hz，H-3，5)，4.31 (2H，q，J=7.1 Hz，H-8)，1.36 (3H，t，J=6.0 Hz，H-9)；13C NMR (150 MHz，CD3OD--d4)，δC：163.7 (C-1)，116.1 (C-2，6)，132.7 (C-3，5)，122.5 (C-4)，168.3 (C-7)，61.7 (C-8)，14.6 (C-9)。對(duì)比文獻(xiàn)[21]確定結(jié)構(gòu)為p-hydroxy-benzoic acid ethylester。

2.7 化合物7的結(jié)構(gòu)鑒定

白色固體，C7H6O3，HRESIMSm/z139.038 8 [M + H]+(calcd for C7H7O3，139.039 5)，1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)，δH：6.82 (2H，d，J=7.79 Hz，H-2，6)，7.78 (2H，d，J=7.79 Hz，H-3，5)，10.22 (1H，br s，-COOH)；13C NMR (150 MHz，DMSO-d6)，δC：161.8 (C-1)，115.3 (C-2，6)，131.7 (C-3，5)，121.5 (C-4)，167.4 (C-7)。對(duì)比文獻(xiàn)[22]確定為p-hydroxybenzoic acid。

2.8 化合物8的結(jié)構(gòu)鑒定

橙紅色油狀物，[α]25 D +22 (c0.1，MeOH)，C15H26O4，HRESIMSm/z293.172 1 [M + Na]+(scalcd for C15H26O4Na，293.172 9)，1H NMR (600 MHz，CDCl3-d1)，δH：5.68 (1H，br s，H-2)，2.19 (2H，m，H-4)，2.25 (2H，m，H-5)，5.14 (1H，t，J=7.8Hz，H-6)，2.09 (1H，m，H-8a) 2.21 (1H，m，H-8b)，1.55 (2H，m，H-9)，3.34 (1H，d，J=12.6 Hz，H-10)，1.15 (3H，s，H-12)，1.20 (3H，s，H-13)，1.61 (3H，s，H-14)，2.16 (3H，s，H-15)；13C NMR (150 MHz，CDCl3-d1，δC：171.1 (C-1)，115.5 (C-2)，162.2 (C-3)，40.9 (C-4)，26.3 (C-5)，123.6 (C-6)，135.9 (C-7)，36.5 (C-8)，29.4 (C-9)，77.7 (C-10)，73.4 (C-11)，22.8 (C-12)，25.6 (C-13)，15.8 (C-14)，18.9 (C-15)。對(duì)比文獻(xiàn)[23]結(jié)構(gòu)確定為phallac acids A。

2.9 化合物9的結(jié)構(gòu)鑒定

淡黃色粉末，C6H6O3，HRESIMSm/z127.039 0 [M + H]+(calcd for C6H7O3H，127.039 5)，1H NMR (600 MHz，CD3OD-d4)，δH：7.44 (2H，m，H-3，5)，6.81 (1H，d，J=8.1 Hz，H-6)；13C NMR (150 MHz，CD3OD-d4)，δC：123.9 (C-1)，146.0 (C-2)，115.7 (C-3，5)，151.4 (C-4)，117.7 (C-6)。對(duì)比文獻(xiàn)[24]結(jié)構(gòu)確定為1，2，4-benzenetriol。

2.10 單體化合物的活性評(píng)價(jià)

選擇8株植物病源真菌及8株臨床耐藥細(xì)菌對(duì)化合物1～9的抗菌活性進(jìn)行了測(cè)試，當(dāng)觀察到96孔板上陰性對(duì)照變渾濁時(shí)，開(kāi)始記錄活性結(jié)果。結(jié)果顯示，測(cè)試化合物在不同濃度下均變渾濁，最高濃度與最低濃度給藥量組間無(wú)明顯差異，說(shuō)明測(cè)試化合物在實(shí)驗(yàn)濃度下對(duì)植物病原真菌或臨床耐藥細(xì)菌無(wú)抑制活性。所有化合物最小抑菌濃度均>100μg/mL。見(jiàn)圖1、表2、表3。

圖1 化合物1～9的結(jié)構(gòu)

表2 化合物1～9的抗細(xì)菌活性

表3 化合物1～9的抗真菌活性

3 討論

微生物天然產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物功能多樣，是新藥研發(fā)的重要資源。旋絲毛殼菌作為毛殼屬的一個(gè)大分支，其次生代謝產(chǎn)物還未見(jiàn)報(bào)道。本文對(duì)一株小薊內(nèi)生旋絲毛殼菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)及抗菌活性進(jìn)行了研究，從其大米加MEB培養(yǎng)基固體發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到9個(gè)單體化合物，通過(guò)NMR和HRESIMS數(shù)據(jù)確定為aurasperone A (1)、fonsecinone A (2)、granulolactone (3)、4-hydroxyphenylacetone (4)、latifolicinin C (5)、p-hydroxybenzoic acid ethylester (6)、p-hydroxybenzoic acid (7)、phallac acid A (8)、1，2，4-benzenetriol (9)，均為首次從該種真菌中發(fā)現(xiàn)。采用二倍稀釋法對(duì)這些單體化合物的抗臨床耐藥細(xì)菌和植物病源真菌活性進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示9個(gè)單體化合物均無(wú)顯著活性。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研，發(fā)現(xiàn)化合物1和2對(duì)幽門(mén)螺桿菌具有顯著的抗菌活性，最小抑菌濃度16μg/mL[25]，化合物6和7是可用作的防腐劑[26]，在后續(xù)的研究中，可以選擇其他病原菌對(duì)這些化合物的抗菌活性進(jìn)行挖掘。本研究為首次關(guān)于旋絲毛殼屬C.bostrychodes真菌次生代謝產(chǎn)物及生物活性的研究，豐富了該種真菌的化學(xué)成分，為進(jìn)一步挖掘旋絲毛殼真菌的活性代謝產(chǎn)物奠定了基礎(chǔ)。