植物內(nèi)生菌16S rRNA基因擴增子高通量測序中降低宿主污染的方法

程丹丹，楊嘉麒，王 牧，趙 菁

(中國地質大學(武漢)環(huán)境學院，湖北 武漢 430078)

附著在植物表面和內(nèi)部以及植物生長環(huán)境中的所有微生物統(tǒng)稱為植物微生物組[1-2]，根據(jù)其分布的部位可分為內(nèi)生微生物、葉際微生物、根際微生物。植物內(nèi)生菌作為植物微生物的重要組成之一，能夠影響植物的生理代謝，增強其抗逆性[3-4]，生產(chǎn)多種生物活性或拮抗物質，增強宿主抵抗病蟲害的能力[5-6]，對植物的生長起促進作用[7-8]，也對環(huán)境調控有重要意義。

近年來，植物輔助土壤修復已成為國內(nèi)外研究的熱點[9]。植物體內(nèi)參與激素合成、污染物降解等基因編碼的代謝途徑使植物內(nèi)生菌具有解毒的能力，能夠改變植物的生理代謝過程，以適應其生境[10]，并能與植物協(xié)同合作使其在降解污染物、控制污染方面有巨大的潛力[11-12]。重金屬污染是最常見的土壤污染之一，已有大量試驗報道植物內(nèi)生菌對土壤中鉛(Pb)、鎘(Cd)、銅(Cu)、鉻(Cr)、鎳(Ni)等重金屬元素具有強耐受性[13-17]，如假單胞菌、伯克氏菌、芽孢桿菌等[18-20]，且一種植物內(nèi)生菌能夠對土壤中多種重金屬具有耐受性[21-22]，能夠使土壤中重金屬元素富集到植物體內(nèi)從而進行環(huán)境修復，為植物-內(nèi)生菌體系治理土壤重金屬污染提供了廣闊的應用前景。有機物污染也嚴重危害著土壤，植物內(nèi)生菌對土壤中一些有機物也能夠進行有效降解，如Zhu等[23]從紅車軸草與小蓬草中均分離得到能夠對土壤中多環(huán)芳烴進行降解的植物內(nèi)生細菌；Anderolli等[24]從楊樹內(nèi)分離得到菌株DBT1，該菌株對土壤中多環(huán)芳烴具有極高的降解效率。也有試驗證明植物內(nèi)生菌能夠對土壤中部分有機農(nóng)藥進行降解，如噻蟲嗪、苯磺隆、二甲四氯等[25-27]。此外，在植物入侵機制研究方面，已從多種入侵植物中得到功能性內(nèi)生菌[28-30]，將植物內(nèi)生菌與植物入侵機制相聯(lián)系能夠為植物入侵機制的研究與防治提供參考，也為探討微生物在植物入侵機制中的作用提供了新視角。

植物內(nèi)生菌是具有巨大應用潛力的資源庫，植物內(nèi)生菌研究對生態(tài)環(huán)境的健康發(fā)展具有重要意義。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，近年來采用第二代測序技術能夠在免培養(yǎng)條件下對植物內(nèi)生菌的16S rRNA (small subunit ribosomal RNA)基因進行擴增，進而確定細菌群落種類組成和多樣性。但由于植物葉綠體和線粒體基因序列與細菌在系統(tǒng)發(fā)育上有著高度的同源性，在植物內(nèi)生菌的16S rRNA基因擴增子高通量(16S-seq)測序過程中不可避免地會出現(xiàn)宿主基因污染問題，而目前能夠有效減輕這種宿主基因污染而不會對細菌16S rRNA基因擴增產(chǎn)生任何偏好仍舊是一個挑戰(zhàn)。本文通過閱讀相關文獻，總結歸納了降低植物內(nèi)生菌16S-Seq測序中宿主基因污染的主要方法。

1 植物內(nèi)生菌

植物內(nèi)生菌泛指那些在其生活史中的某一階段或全部階段生活在植物組織內(nèi)，不改變植物的表觀性狀，對宿主植物不引起明顯病害癥狀的微生物，包括內(nèi)生細菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌[31]，其廣泛存在于幾乎所有植物中。植物內(nèi)生菌由德國科學家Bary在1886年提出[32]，20世紀70年代木本植物內(nèi)生真菌的研究逐漸興起，但主要針對部分重要的經(jīng)濟林木和熱帶雨林原始林木[33]。隨著研究的進一步開展，在多種灌木、草本植物以及栽培作物、果樹甚至藻類、苔蘚和蕨類植物中也發(fā)現(xiàn)了植物內(nèi)生菌的存在[34]。植物內(nèi)生菌幾乎存在于植物的所有組織中，包括植物的根、莖、葉、花、果實、胚、種子[35]。

Compant等[36]研究認為，植物微生物與宿主植物的關系取決于植物基因型、環(huán)境和共定殖微生物群在內(nèi)的許多因素。但一般認為，植物內(nèi)生菌能與寄主植物建立和諧共生的關系[37]， 因此植物內(nèi)生菌與致病菌之間的明確區(qū)分需要詳細的功能分析。作為非致病性微生物，植物內(nèi)生菌可以改善植物健康狀態(tài)、增強植物對脅迫的耐受性[38]，也能夠為宿主植物提供生物防治和作為植物生長的促進劑[39]。植物內(nèi)生菌的傳播方式有多種：第一種傳播方式是垂直傳播，即植物內(nèi)生菌能通過種子或無性繁殖從母代植株傳遞到子代植株中，種子內(nèi)微生物的代際傳播對植物健康、生長和微生態(tài)有著深遠的影響[40]；第二種傳播方式是微生物通過植物根部的裂縫進入到植物體內(nèi)成為植物內(nèi)生菌，根部是外界微生物進入植物內(nèi)部的主要部位；第三種傳播方式是外界微生物通過降解植物細胞纖維素進入到植物組織內(nèi)成為植物內(nèi)生菌。

植物內(nèi)生菌是一個多樣性十分豐富的微生物類群，如Hardoim等[41]對已經(jīng)報道過的內(nèi)生細菌和內(nèi)生真菌的DNA序列進行了數(shù)據(jù)庫構建，結果發(fā)現(xiàn):內(nèi)生細菌可歸為21門，其中變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)的序列數(shù)占比較高，最主要的綱為γ-變形菌綱，而占比較高的內(nèi)生細菌屬有腸桿菌屬(Enterobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)等；內(nèi)生真菌門類主要有球囊菌門(Glomeromycota)、子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)等，最主要的綱為糞殼菌綱(Sordariomycetes)，而占比較高的內(nèi)生真菌屬有瘤座菌屬(Balansia)、Epichlo?屬、碳墊菌屬(Nemania)、炭角菌屬(Xylaria)、炭疽菌屬(Colletotrichum)等。常見的內(nèi)生放線菌有鏈霉菌屬(Streptomyces)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、原小單胞菌屬(Promicromonospora)等[42-43]。

2 細菌16S rRNA基因的擴增子高通量測序

植物內(nèi)生菌可以從經(jīng)過嚴格表面消毒的植物組織和汁液中分離培養(yǎng)獲得，即將經(jīng)過嚴格表面消毒的樣品轉移到培養(yǎng)基中，分離純化目的菌并進行生理生化檢測、分類、鑒定等一系列研究，這種方法被稱之為傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法。隨著分子生物學技術的發(fā)展，現(xiàn)在也可以從植物組織內(nèi)直接擴增出微生物DNA進行測序，從而分析植物內(nèi)生菌的群落組成和多樣性。目前利用測序技術對細菌基因進行擴增主要有兩種方法：一種是基于16S小亞基核糖體RNA(16S rRNA)基因的擴增子高通量測序方法;另一種是基于環(huán)境基因組DNA的宏基因組測序方法。這兩種方法各有優(yōu)缺點，相比之下，基于16S rRNA基因的擴增子高通量測序(16S-seq)技術更加常用，且分析方法也相對成熟。相較于傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法，16S-seq技術為植物內(nèi)生菌群落多樣性檢測提供了更為有效的手段[44]。

細菌16S rRNA基因約由1 540個堿基構成，序列長度適中且所含遺傳信息較充足，既有保守性序列片段，也有相對于每個細菌可變的可變性序列片段，利用保守區(qū)片段可以得到細菌的通用引物，擴增過程中不會與非細菌DNA結合；利用可變區(qū)片段，通過分析各個細菌可變區(qū)的差異可以區(qū)分不同的細菌(見圖1)[44]。因此，選擇細菌16S rRNA基因進行細菌鑒定以及遺傳多樣性的分析比較合理。

圖1 細菌16S rRNA基因保守區(qū)和可變區(qū)的分布Fig.1 Distribution of conserved and variable regions of bacterial 16S rRNA gene

3 宿主基因污染對植物內(nèi)生菌群落研究的影響

很多研究發(fā)現(xiàn)，在植物內(nèi)生菌16S-seq結果中存在大量宿主細胞器基因序列。如劉喬等[45]在對湖北省神農(nóng)架泥炭蘚共生細菌群落分析研究中發(fā)現(xiàn)，擴增建庫得到的藍細菌序列與泥炭蘚中葉綠體16S rRNA基因序列高度相似，葉綠體16S rRNA基因序列在未經(jīng)過表面消毒樣品總序列數(shù)中占比為38.19%，在經(jīng)過表面消毒樣品總序列數(shù)中占比為39.75%；陳澤斌等[46]在利用Illumina MiSeq高通量測序技術分析白芨內(nèi)生細菌多樣性研究中發(fā)現(xiàn)，部分基因序列歸屬于線粒體和葉綠體，存在宿主污染現(xiàn)象，該課題組在針對其他植物的研究中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象；Tian等[47]在針對番茄根樣本內(nèi)生菌16S-seq結果中發(fā)現(xiàn)，測序得到的基因序列中內(nèi)生菌序列的占比很小。

植物內(nèi)生菌16S-seq結果中出現(xiàn)葉綠體的干擾，是因為就植物組織而言，葉綠體與細菌在系統(tǒng)發(fā)育上具有高度的同源性[48]。1905年，Mereschkowsky提出了葉綠體的內(nèi)共生假說，認為高等植物體內(nèi)的葉綠體是由長期共生于植物內(nèi)部且具有光合作用的細菌逐步演化而來的。1967年，美國波士頓大學的Margulis提出了線粒體和葉綠體的共生形成學說，認為自由的細菌被原核細胞吞噬到細胞內(nèi)未被消化而存活下來，逐漸發(fā)展成共生性質，最后成為細胞器[49]，即細胞器的內(nèi)共生起源學說，線粒體和葉綠體至今保存著部分與細菌和藍細菌高度相似的基因片段。

雖然在數(shù)據(jù)處理中可以將葉綠體、線粒體基因序列和無法鑒定的基因序列剔除掉，以免影響數(shù)據(jù)分析。如?iarovská等[50]在研究小麥發(fā)育早期內(nèi)生菌多樣性時去除了基因序列擴增結果中的葉綠體和線粒體基因序列。但是，植物內(nèi)生菌16S-seq過程中宿主基因污染仍舊是存在的，嚴重的宿主基因污染會影響對植物內(nèi)生菌的多樣性分析，也會導致研究成本增加，所以這個問題仍然是需要解決和攻克的難題。

4 減少植物內(nèi)生菌16S rRNA基因擴增子高通量測序中宿主基因污染的主要方法

通過查閱文獻，對近年來用于減少植物內(nèi)生菌16S-seq中宿主細胞器基因序列污染的方法進行了匯總，主要方法有尋找特異性錯配引物、添加特異性阻斷物、Cas-16S-seq方法、巢式PCR技術4種，詳見表1。

表1 減少植物內(nèi)生菌16S rRNA基因擴增子高通量測序中宿主基因污染的方法匯總Table 1 Advances in methods to reduce host genetic pollution in high-throughput sequencing of 16S rRNA gene amplicon sequencing of plant endophytic bacteria

4.1 尋找特異性錯配引物

許多學者通過尋找特異性錯配引物用來擴增細菌16S rRNA基因，以減少植物內(nèi)生菌16S rRNA基因擴增子高通量測序(16S-seq)過程中的宿主基因污染。如Chelius等[51]開發(fā)了第一個特異性錯配引物799F，該引物設計圍繞著葉綠體16S rRNA基因序列中798和799位的兩個堿基對錯配以及783和784位的另外兩個堿基對錯配，并在對玉米根內(nèi)生菌的研究中，通過查閱文獻以及比對玉米根內(nèi)葉綠體和線粒體基因序列，使用了799F-1492R這對引物，其中引物799F能放大細菌序列測序結果約1.5倍，且能排除葉綠體的干擾，而引物1492R能在匹配大多細菌的同時，還能使線粒體基因序列長度擴增到1090bp，且細菌16S序列長度只有約735bp，通過基因序列長度的差異來區(qū)分線粒體和細菌擴增序列；Sakai等[52]針對小麥和菠菜根部細菌進行分析時，將引物799F修飾為引物783F，結果發(fā)現(xiàn)在檢測到高峰值細菌16S rRNA基因序列的同時，基本消除了植物細胞器基因序列的干擾。

但是，引物799F并不適用于所有植物。如Thijs等[54]選用了多對不同的細菌通用引物擴增楊樹的根、莖、葉內(nèi)生菌，結果發(fā)現(xiàn)引物799F及其變體相比于其他引物對消除非目標DNA和對細菌OTUs的檢索都有較好的效果，可將測序結果中的葉綠體基因序列污染降到最低程度，但仍有部分線粒體基因序列被污染。針對特定的植物樣本，有文獻提出了減少宿主基因污染效果更好的引物對。如Nakano[55]在對蔬菜產(chǎn)品細菌多樣性的研究中使用了335F/769R引物對，結果發(fā)現(xiàn)特異性335F/769R引物對對葉綠體和線粒體基因序列的退火親和力最低，可以減少非細菌基因序列的擴增，擴增產(chǎn)物當中葉綠體和線粒體基因序列僅占總基因序列的0.84%。

綜合來看，特異性錯配引物799F及其變體能夠對大部分植物樣本中宿主基因污染有較好的抑制效果。表2列出了在植物內(nèi)生菌16S-seq中常用的特異性錯配引物，這些引物都被證實能夠減少PCR擴增結果中的宿主基因污染。但是某種植物樣本應當選擇何種特異性錯配引物，則需要參考相關文獻或者設計針對性的特異性錯配引物，才能更好地減少宿主基因污染。

表2 植物內(nèi)生菌16S rRNA基因擴增子高通量測序(16S-seq)中常用的特異性錯配引物Table 2 Specific primers commonly used in 16S-seq sequencing of plant endophytic bacteria

4.2 添加特異性阻斷物

一些學者通過添加特異性阻斷物用來抑制宿主基因序列的擴增，主要有PNA-PCR和LNA-PCR鉗位技術。

4.2.1 PNA-PCR鉗位技術

Lundberg等[57]設計了一種肽核酸(Peptide nucleic acids，PNA)PCR鉗位技術，將PNA加入到植物內(nèi)生菌16S-seq的PCR擴增過程中，用來抑制宿主細胞器基因序列的擴增。PNA是經(jīng)過設計的較短的肽核酸鏈，它能與宿主葉綠體或者線粒體16S rRNA基因序列中的一段序列緊密結合，從而阻斷該基因序列的擴增。此外，他還在同一個擴增流程中使用兩種PNA，分別用來阻斷葉綠體和線粒體基因序列的擴增，且不影響細菌基因序列的擴增，結果發(fā)現(xiàn)：同樣的樣本，沒有使用PNA-PCR鉗位技術進行處理，宿主基因污染高達85%；而使用PNA-PCR鉗位技術進行處理，則成功阻斷了宿主細胞器基因序列的擴增，且細菌16S擴增子序列也增加了8倍之多。

上述方法在一定程度上減少了植物內(nèi)生菌16S-seq中的宿主基因污染。如De Souza等[58]在研究甘蔗細菌微生物組時，針對葉綠體和線粒體16S rRNA基因序列，使用PNA-PCR鉗位技術，增加了細菌基因序列的擴增，同時大多數(shù)宿主細胞器基因序列擴增被抑制；Coleman-Derr等[59]在對栽培和野外龍舌蘭內(nèi)生菌的研究中，應用了PNA-PCA鉗位技術，測序結果中只有少量葉綠體的干擾。但也有文獻提到PNA-PCR鉗位技術對于一些特定植物類群的微生物群組，減少宿主基因污染的效果并不顯著。如Lu-Irving等[62]在研究黃矢車菊(Centaurea solstitialis)微生物群落時利用PNA來阻止植物葉綠體和線粒體16S rRNA基因序列的擴增，但最后仍得到83%的葉綠體基因序列，刪除葉綠體基因序列后剩余擴增序列數(shù)目也相對較低，無法對葉片內(nèi)生細菌群落進行研究。一項對水生植物微生物群落的研究也表明，PNA阻止了水生植物內(nèi)生菌中某些細菌基因序列的擴增，從而給微生物群落結構分析帶來一定的偏差[70]。如Fitzpatrick等[71]也證實，Lundberg等最初設計的特異性阻斷物PNA的阻斷效率在不同植物類群中的差異很大(從6%到100%)。針對PNA-PCR鉗位技術在一些應用當中出現(xiàn)的問題，有研究人員在應用這項技術的同時也使用了特異性錯配引物。如Johnston-Monje等[60]研究幼嫩玉米根際菌群時，在PCR中添加了抗葉綠體和抗線粒體PNA阻斷物來阻斷葉綠體和線粒體基因序列的擴增，同時也使用了特異性錯配引物799F，但擴增結果中仍舊有一小部分沒有被PNA有效阻斷的線粒體和葉綠體基因序列。

此外，Simmons等[72]指出不同植物的葉綠體和線粒體16S rRNA基因序列存在差異，認為在實驗設計過程中從生物信息學方面檢查PNA與植物細胞器基因序列的互補性是很重要的，這關系著PNA能否成功阻止宿主細胞器基因序列的擴增；Fitzpatrick等[71]也強調了宿主細胞器基因序列變化在決定PNA有效性方面的重要性，指出PNA阻止DNA基因序列擴增的能力依賴于PNA-DNA相對于DNA-DNA雙鏈增加的熱穩(wěn)定性(即升高的DNA熔解溫度，Tm)，而PNA與DNA基因序列之間的單核苷酸不匹配可導致Tm降低8～20℃，因此在通用的PNA與宿主細胞器基因序列差別較大的情況下，設計一個與宿主細胞器基因序列互補的PNA是一種更有效地減少宿主細胞器基因污染的方法。

4.2.2 LNA-PCR鉗位技術

Ikenaga等[73]提出一種鎖核酸(Locked nucleic acid，LNA) PCR鉗位技術。LNA是一種人工核苷酸類似物，含有一個亞甲基連接核糖的2′-oxygen和4′-carbon。LNA寡核苷酸可以設計成與正常引物相似的引物，可以選擇性擴增細菌基因序列，同時能夠抑制宿主細胞器基因序列的擴增。他也指出LNA-PCR鉗位技術的優(yōu)勢是使用覆蓋范圍更大的引物集來擴增幾乎全部的細菌16S rRNA基因，而且隨著LNA濃度的增加，宿主細胞器基因序列擴增產(chǎn)物也隨之減少。

Yu等[61]在對大豆和玉米根部相關細菌群落結構的研究當中使用LNA-PCR鉗位技術對宿主基因污染進行抑制，得到的擴增基因序列中葉綠體和線粒體基因序列的占比大幅下降；Ikenaga等[74]認為LNA原先所使用的引物對63F/1492R的抑制效率較低，故設計了3個新的正向引物KU63F、KU64F、KU68F和1個新的反向引物KU1494R用來改善其抑制效率，結果發(fā)現(xiàn)KU63F/KU1484R引物對最適用于植物內(nèi)生菌的PCR擴增。雖然已有實驗證明該種方法能夠降低植物內(nèi)生菌16S-seq中宿主基因的污染率，但其對植物的普適性還有待深入研究。

4.3 Cas-16S-seq方法

Song等[64]在實際應用PNA-PCR鉗位技術的過程中，發(fā)現(xiàn)該技術不高效且對微生物群落分析時會引起偏差，因此開發(fā)了Cas-16S-seq方法。該方法利用Cas9核酸酶和特異性導向RNA(gRNA)在文庫構建過程中剪切靶向16S rRNA基因，從而去除16S-seq中的宿主基因污染。在實際應用過程中，Cas-16S-seq方法基于常規(guī)的16S-seq方法，使用兩步PCR來擴增和標記16S rRNA基因：第一輪PCR擴增，使用帶接頭的通用引物(Rd-universal-F/R)擴增16S rRNA基因的可變區(qū)域，并用Cas9和特異性gRNA剪切PCR擴增產(chǎn)物中的宿主細胞器16S rRNA基因；第二輪PCR擴增，使用含標簽序列和Illumina測序儀接頭序列的引物(P5-index-Rd-F和P7-index-Rd-R)來擴增酶解產(chǎn)物，獲得最終擴增子庫。宿主細胞器的16S rRNA基因片段在第二輪PCR擴增中不能進行擴增，從而在最后的16S-seq數(shù)據(jù)中被去除。此外，他還比較了Cas-16S-seq方法與常規(guī)的16S-seq方法在研究稻田土、水稻根和葉際樣品細菌群落結構的效果，結果發(fā)現(xiàn)：對比常規(guī)的16S-seq方法，利用Cas-16S-seq方法處理的水稻根中宿主基因的污染率從63.2%降低到2.9%，在葉際樣品中宿主基因的污染率也從99.4%降低到11.6%，兩者幾乎顯示了相同的土壤細菌群落?？梢?，Cas-16S-seq方法可以有效地阻斷水稻內(nèi)生細菌16S-seq測序過程中宿主基因造成的污染，同時不會對細菌群落結構結果分析造成偏差。

4.4 巢式PCR技術

巢式PCR技術可以通過兩套引物對有限的DNA模板進行兩輪PCR擴增，能夠很大程度地提高對靶DNA的特異性和靈敏度。如Chelius等[51]研究認為在擴增效率低下或初始模板濃度較低的情況下，可以使用巢式PCR方法來增強擴增效率；Dos Santos等[66]對巢式PCR擴增和直接PCR擴增進行了比對，直接PCR擴增使用通用引物27F/1492R，而巢式PCR擴增以第一輪通用引物27F/1492R進行PCR擴增的產(chǎn)物為模板，使用799F和U1492R嵌套引物進行第二輪PCR擴增，結果發(fā)現(xiàn)巢式PCR擴增降低了葉綠體基因序列在擴增產(chǎn)物中的比例；渝江等[65]首先利用LNA-PCR鉗位技術進行第一輪PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物后純化，再以純化擴增產(chǎn)物稀釋液為模板并以引物對341F/907R進行了第二輪PCR擴增。目前很多研究人員利用巢式PCR方法，在第一輪PCR擴增中減少宿主基因污染，純化后再使用特異性引物擴增出更多的細菌16S rRNA基因序列。

Lundberg等[67]引入了宿主基因相關微生物PCR(ham PCR)擴增流程，同樣需要兩步PCR擴增流程。首先需要引物共擴增宿主基因和一個或多個微生物區(qū)域，如16S rRNA基因，以得到微生物種群大小相對于宿主組織葉綠體和線粒體數(shù)量的比率，即微生物負荷；然后在完成測序文庫后，擴增子能被純化并以任一比例進行混合，通過這一步PCR擴增，可以得出下一步PCR壙增是否需要調整引物比例，或者對宿主與微生物比例不理想的樣本進行調整。此外，他還利用ham PCR技術準確檢測出模式植物擬南芥的細菌群落結構，且該技術不會引起細菌組成偏差。

5 總結與展望

植物內(nèi)生菌普遍存在于各種植物當中，可以改善植物健康狀態(tài)，促進植物生長，也可以作為病原體為宿主植物提供生物防治和作為宿主植物的生長促進劑。研究植物內(nèi)生菌，對于我們理解植物生長情況、健康狀態(tài)具有重要的意義。研究植物內(nèi)生菌最常使用16S rRNA基因擴增子高通量測序(16S-seq)技術，但這項技術伴隨著宿主基因的污染問題，目前解決這個問題的辦法主要有以下4種方法：①尋找特異性錯配引物，使引物能特異性結合植物內(nèi)生菌16S rRNA基因，擴增出足夠豐富的細菌OTUs，并能夠抑制宿主細胞器基因序列擴增；②添加特異性阻斷物用來阻斷植物葉綠體和線粒體基因序列擴增，如PNA-PCR和LAN-PCR鉗位技術；③在文庫構建過程中剪切宿主細胞器的16S rRNA基因，如Cas-16S-seq方法；④改變PCR擴增流程，以盡可能減少宿主細胞器基因序列擴增，如巢式PCR方法和ham PCR方法。

但是上述這些方法在應用過程中都有一定的缺陷，如：特異性錯配引物應用于不同的植物樣品時，減少宿主基因污染的效果各異；添加特異性阻斷物能夠阻斷宿主細胞器基因序列擴增，但最常用的PNA-PCR鉗位技術在研究過程中也出現(xiàn)了阻斷效果變差的問題；巢式PCR方法和ham PCR方法在現(xiàn)有的研究中雖均有很好的減少宿主細胞器基因污染的效果，但其普適性還有待證明。因此，目前還沒有一種方法能夠對不同種類的植物、不同的植物部位、不同的植物生長時期都有很好的減少宿主基因污染的效果。在后續(xù)植物內(nèi)生菌研究中，要想降低16S-seq中宿主細胞器基因序列的污染，還需要對不同植物樣本選擇相應的減少宿主細胞器基因污染的方法，并根據(jù)宿主細胞器基因細胞器序列選擇或設計相應的特異性引物或阻斷物，同時嘗試將不同方法相結合，用于彌補單一方法的缺陷，在加強對宿主細胞器基因序列抑制的同時，以保證植物內(nèi)生菌基因序列的大量擴增。