培養(yǎng)皿中的眼睛：眼組織類器官技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用

李金燕 綜述 羅莉霞，劉奕志，陳舒怡 審校

(中山大學(xué)中山眼科中心，眼科學(xué)國家重點實驗室，廣東省眼科視覺科學(xué)重點實驗室，廣州 510060)

眼睛負(fù)責(zé)視覺接收，約80%的外界信息由眼睛接收，是最重要的感覺器官之一。眼球由屈光傳導(dǎo)系統(tǒng)和視覺感知神經(jīng)系統(tǒng)2個部分組成：角膜和晶狀體是主要的屈光傳導(dǎo)系統(tǒng)，視網(wǎng)膜負(fù)責(zé)視覺感知和視覺信息初步處理。經(jīng)眼睛感知和初步加工形成的視覺神經(jīng)信號由視神經(jīng)投射到大腦視覺中樞，最終形成視覺。眼睛各組分的結(jié)構(gòu)、功能異常都將影響視力，甚至失明。位于眼球最外層的是角膜，作為外界光線進(jìn)入眼球的窗口，角膜起著屏障和屈光的作用。全球因角膜完整性破壞或混濁而致盲的患者數(shù)超過490萬人[1]。角膜移植是角膜不可逆性損傷的唯一有效治療方法，但角膜供體不足、術(shù)后免疫排斥等問題是角膜移植術(shù)的應(yīng)用瓶頸[2]。晶狀體位于角膜后，外界光線進(jìn)入眼球后經(jīng)晶狀體完成第2次屈光。白內(nèi)障是全球首位的致盲性眼病，它是晶狀體光學(xué)質(zhì)量下降的一類退行性病變，全球有超過1700萬人因白內(nèi)障致盲[3]。當(dāng)前，白內(nèi)障摘除聯(lián)合人工晶體植入術(shù)已相當(dāng)成熟，可有效治療大多數(shù)老年白內(nèi)障。但一方面，人工晶體植入術(shù)后可誘發(fā)青光眼、角膜內(nèi)皮損傷等并發(fā)癥；另一方面，由于嬰幼兒晶狀體仍然處于發(fā)育狀態(tài)，白內(nèi)障摘除后不適宜人工晶體植入，嚴(yán)重阻礙了患兒的視覺發(fā)育，是當(dāng)前白內(nèi)障治療的難點問題[4-5]。視網(wǎng)膜是光線經(jīng)角膜、晶狀體屈光后最終到達(dá)的部位。青光眼、年齡相關(guān)黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病變均為全球主要致盲性眼病，是一類最終以視網(wǎng)膜細(xì)胞受損，導(dǎo)致感光或投射功能失代償為特點的視網(wǎng)膜退行性疾病[6]。雖通過控制病因或激光等治療方法可改善或延緩早期視網(wǎng)膜損傷，但對于晚期病例，因人類視網(wǎng)膜再生修復(fù)能力幾乎為零，終將導(dǎo)致不可逆性盲[7-9]。調(diào)查[3]顯示：直至2020年，全球有超過4300萬盲人和2.9億患者罹患中度或重度視力障礙；由于視功能受損導(dǎo)致殘疾、失業(yè)等問題，造成全球生產(chǎn)力損失超過4100億美元。

對于致盲性眼病防、診、治新方法的開發(fā)，需要我們對眼睛各組份的發(fā)育、生理和病理調(diào)控機制有全面、深入的理解?；诎唏R魚、小鼠等動物模型的研究為揭示眼組織發(fā)育、生理和病理機制以及診療方法開發(fā)提供了寶貴信息。但由于物種間存在差異，動物模型無法完全模擬人器官發(fā)育和病理過程，限制了這些基礎(chǔ)研究成果向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。干細(xì)胞是具有自我更新和多向分化潛能的特殊細(xì)胞，可在體外擴增、分化，已成為研究發(fā)育、疾病病理、藥物篩選的有力工具，還具有發(fā)展為細(xì)胞替代治療的應(yīng)用前景。近年來發(fā)展迅速的類器官技術(shù)將干細(xì)胞體外定向分化推向新的高度，而眼組織類器官技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用成為其中典型代表。目前已實現(xiàn)了視網(wǎng)膜、角膜、晶狀體等類器官誘導(dǎo)[10-11]，為眼發(fā)育、眼病的機制研究、藥物篩選和替代治療開辟了新的道路(圖1)。本文將針對眼組織類器官的誘導(dǎo)體系發(fā)展和相關(guān)應(yīng)用進(jìn)行綜述。

圖1 眼類器官及其應(yīng)用Figure 1 Ocular organoids and their application

1 類器官概述

1.1 類器官的定義

類器官是指通過類似體內(nèi)發(fā)育過程中的細(xì)胞歸集和空間定向譜系命運分化過程，干細(xì)胞或組織祖細(xì)胞在體外自我組裝，最終形成具有組織特異性細(xì)胞組份的三維細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物，并可在體外部分再現(xiàn)該器官特有的功能[12-14]。

并不是所有干細(xì)胞的誘導(dǎo)產(chǎn)物都可稱為類器官。類器官技術(shù)實現(xiàn)了從細(xì)胞層面向組織層面的轉(zhuǎn)化，與傳統(tǒng)的平面干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)相比，類器官技術(shù)對培養(yǎng)體系細(xì)節(jié)要求(如細(xì)胞品系、細(xì)胞密度等)更高，但優(yōu)勢也是明顯的：類器官培養(yǎng)可更好模擬了組織特異的生長或形態(tài)發(fā)生過程；此外，產(chǎn)物具有與原生器官/組織相似的細(xì)胞組成和組織結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生器官特異的大部分細(xì)胞類型，還具有器官部分特異生理功能[12]。

1.2 類器官的技術(shù)發(fā)展

雖然類器官在近十年來發(fā)展迅猛，但是人們很早就開始嘗試在體外再現(xiàn)類似體內(nèi)組織/器官結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)。1975年Michalopoulos和Pitot團(tuán)隊[15]提取鼠尾膠原懸浮培養(yǎng)原代的肝細(xì)胞，在體外重現(xiàn)了類似肝小葉的結(jié)構(gòu)，還可分泌細(xì)胞色素P450。這些早期由組織細(xì)胞/干細(xì)胞/前體細(xì)胞自我組裝形成的類組織結(jié)構(gòu)相對簡單，使用的細(xì)胞來源非常有限，限制了這些技術(shù)的推廣應(yīng)用。

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESC)/誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)由于其強大的自我更新和多向分化潛能，早已被廣泛開發(fā)，定向誘導(dǎo)分化成各胚層的終末分化細(xì)胞，以用于理論研究和臨床轉(zhuǎn)化。過去的定向誘導(dǎo)方案多以二維平面培養(yǎng)形成分散存在的各種終末分化細(xì)胞為終點。2008年，Eiraku等[16]改良懸浮培養(yǎng)方法，利用低黏附V孔板，促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞形成快速成團(tuán)無血清擬胚體(quickly aggregated serum free embryonic body，SFEBq)，經(jīng)進(jìn)一步定向分化培養(yǎng)，體外重現(xiàn)了體內(nèi)大腦皮層的發(fā)育過程，分化為皮層特異各種神經(jīng)元，形成與皮層類似的立體結(jié)構(gòu)，并具有一定的電生理功能，首創(chuàng)了利用胚胎干細(xì)胞構(gòu)建類器官的培養(yǎng)體系。從2008年至今的十余年間，各種類器官的體外誘導(dǎo)體系不斷涌現(xiàn)，基于ESC或iPSC已實現(xiàn)肝、肺、大腦皮質(zhì)等組織/器官特異種子細(xì)胞的體外分化[17-19]。

原發(fā)組織來源的種子細(xì)胞，包括發(fā)育期組織中的祖細(xì)胞或成熟組織中的成體干細(xì)胞，解決了多能干細(xì)胞成瘤性高、目標(biāo)器官分化調(diào)控不明確的問題。2009年，Muthuswamy等[14]將Lgr5+小腸成體干細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該體系可體外自組裝為小腸微絨毛單位，建立了利用成體干細(xì)胞構(gòu)建類器官的培養(yǎng)體系。目前，利用成體干細(xì)胞已實現(xiàn)了胰腺、肝、乳腺小葉、小腸和胃等類組織/器官的體外誘導(dǎo)分化[19]。

作為良好的研究工具，類器官可結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，拓寬了對發(fā)育過程、特別是人體組織/細(xì)胞發(fā)育過程的了解；可結(jié)合重編程技術(shù)、基因編輯技術(shù)，構(gòu)建了疾病模型用以發(fā)病機制的研究；可結(jié)合藥物學(xué)和化學(xué)，促進(jìn)了藥物篩選進(jìn)程；還可結(jié)合組織生物工程，拓展了細(xì)胞/組織替代治療新途徑[20-21]。其中，眼類器官作為其中典型的代表，在生物和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊，或許可成為一些致盲性眼病的最終解決方案。

2 眼組織類器官研究進(jìn)展

2.1 角膜

角膜是位于眼球最外層的無血管透明組織，主要由前部的上皮層、后部的內(nèi)皮層和位于中間的基質(zhì)細(xì)胞組成。角膜發(fā)育源于表皮外胚層和神經(jīng)嵴：表皮外胚層經(jīng)神經(jīng)嵴來源的眼周間充質(zhì)細(xì)胞的作用分化為角膜上皮細(xì)胞；而這些間充質(zhì)細(xì)胞則形成部分角膜基質(zhì)細(xì)胞和角膜內(nèi)皮細(xì)胞[22-23]。角膜上皮類似皮膚上皮，每天都有細(xì)胞從表面脫落丟失。目前認(rèn)為，角膜上皮的自我更新由角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cell，LSC)維持。角膜緣干細(xì)胞缺陷(limbal stem cell deficiency，LSCD)，是導(dǎo)致角膜混濁的主要病因[24]。以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的替代治療有望解決角膜移植供體不足等臨床治療難題。

2.1.1 角膜類器官技術(shù)的發(fā)展

目前角膜體外誘導(dǎo)研究可分為角膜緣干細(xì)胞-復(fù)層角膜上皮組織和角膜類器官2個研究方向。

角膜緣干細(xì)胞-復(fù)層角膜上皮組織的研究旨在探究角膜緣干細(xì)胞/角膜上皮細(xì)胞的體外擴增方案。Pellegrini團(tuán)隊[25]最早利用3T3細(xì)胞作為支持細(xì)胞，對人角膜緣干細(xì)胞體外擴增進(jìn)行了探索，并建立了體外長時間存活和擴增的培養(yǎng)方案。隨著多能干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，研究者們通過模擬角膜發(fā)育的體內(nèi)調(diào)控分子機制，在體外重現(xiàn)角膜上皮組織/角膜類器官的發(fā)展過程。例如，通過序貫性抑制Nodal和Activin通路、抑制SMAD信號通路，可激活Zic和Fox家族，使多能干細(xì)胞向神經(jīng)外胚層細(xì)胞分化；進(jìn)一步抑制TGFβ和WNT信號通路，神經(jīng)外胚層細(xì)胞將趨向分化為角膜上皮細(xì)胞[26-27]。此外，通過與角膜緣基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，多能干細(xì)胞可在神經(jīng)生長因子、內(nèi)皮生長因子和表皮生長因子的作用下分化出角膜上皮樣細(xì)胞[28]。2014年，Ouyang等[29]發(fā)現(xiàn)在PAX6和WNT7A是維持角膜上皮細(xì)胞命運的關(guān)鍵因子，并結(jié)合重編程技術(shù)，在皮膚上皮干細(xì)胞中過表達(dá)PAX6可將其重編程為LSC，解決了角膜緣干細(xì)胞來源缺乏的問題。2016年，Hayashi團(tuán)隊[30-31]創(chuàng)建多外胚層自主分化體系，將iPSC誘導(dǎo)出具有分化為角膜緣干細(xì)胞、角膜上皮及結(jié)膜上皮的眼表面外胚層原基，經(jīng)分離培養(yǎng)后可成功誘導(dǎo)為復(fù)層的角膜上皮組織，并具有修復(fù)兔角膜上皮缺損的能力。

角膜類器官的研究旨在探究體外建立與角膜類似的多層角膜類器官。早在1993年，Minami等[32]制作牛角膜緣活組織切片，在體外擴增出具有典型3層結(jié)構(gòu)的類角膜組織。而后，研究者們改進(jìn)了基質(zhì)成分或支持細(xì)胞，將角膜上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮等成體細(xì)胞結(jié)合，在體外重現(xiàn)具有與角膜相似形態(tài)、透明度和組織學(xué)特性的類角膜組織[33-34]。多能干細(xì)胞來源的角膜類組織誘導(dǎo)體系見報道于2017年，F(xiàn)oster等[35]基于人iPSC-擬胚體誘導(dǎo)體系，分離其中的角膜原基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，獲得了表達(dá)角膜上皮、基質(zhì)及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的角膜類組織，電鏡還可見基質(zhì)板層的形成。同年，Susaimanickam 等[36]則改進(jìn)了Hayashi 等[30]創(chuàng)建的角膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)體系，將人iPSC來源的眼表面外胚層原基進(jìn)行分離懸浮，誘導(dǎo)產(chǎn)物不僅可角膜各層細(xì)胞的分子標(biāo)志物，還具有復(fù)層角膜上皮-形成板層的角膜基質(zhì)-角膜內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，此外，經(jīng)15 周的培養(yǎng)，還可見角膜緣、結(jié)膜等類似結(jié)構(gòu)，一定程度上模擬了體內(nèi)眼前段的發(fā)育過程。

2.1.2 角膜類器官的應(yīng)用

角膜緣干細(xì)胞-復(fù)層角膜上皮組織的研究可為治療LSCD提供潛在的種子細(xì)胞，有巨大的臨床應(yīng)用前景。R ama等[37]通過體外擴增自體角膜干細(xì)胞，制備了角膜上皮薄片并移植治療LSCD患者，經(jīng)長期隨診發(fā)現(xiàn)，如果移植物中攜帶了足夠數(shù)量的角膜緣干細(xì)胞，超過70%的病例可實現(xiàn)角膜再生。隨后，研究者們開始關(guān)注角膜緣上皮細(xì)胞移植的安全性和有效性。Kolli團(tuán)隊[38]建立了符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的自體角膜干細(xì)胞體外擴增技術(shù)，臨床實驗中顯著改善了LSCD患者的主觀及客觀檢查結(jié)果。Zakaria等[39]進(jìn)行的臨床II期試驗結(jié)果顯示，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化、同種培養(yǎng)系統(tǒng)、減少操作培養(yǎng)和手術(shù)入路的角膜緣上皮細(xì)胞移植術(shù)可安全有效減少角膜新生血管。Tsai團(tuán)隊[40]發(fā)現(xiàn)經(jīng)自體角膜干細(xì)胞移植術(shù)后，患者角膜可完成再上皮化，并有83%患者的視力得到了改善。Lopez-Garcia等[41]則對自體角膜緣移植聯(lián)合羊膜移植進(jìn)行前瞻性研究，進(jìn)一步改善了再上皮化和間質(zhì)再生。如今，角膜緣干細(xì)胞治療眼燒傷已被歐盟監(jiān)管部門批準(zhǔn)，在干細(xì)胞應(yīng)用于眼科治療方向走在了前列[42]。

角膜類器官的研究則可作為研究角膜發(fā)育和疾病病理研究的有力工具。有研究團(tuán)隊將微流體芯片(microfluidic chip)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合，對眼表組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行了體外模擬，為體外研究功能性干眼提供了良好的疾病模型。Bennet等[43]最先利用微流體芯片構(gòu)建了具有角膜上皮細(xì)胞層、基底層和Bowmen’s膜的角膜復(fù)層結(jié)構(gòu)，并利用微流體模擬了眼淚動力學(xué)體系。Seo等[44]進(jìn)一步構(gòu)建了包括角膜上皮層和基質(zhì)層、結(jié)膜上皮和杯狀細(xì)胞的復(fù)合體系，并設(shè)計了穹頂樣細(xì)胞灌注系統(tǒng)，通過減少細(xì)胞灌注頻率以模擬功能性干眼，并發(fā)現(xiàn)該模型中角膜上皮細(xì)胞過表達(dá)了IL-1β、TNF-α和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9，與臨床表型一致性。此外，角膜類器官還為基質(zhì)、內(nèi)皮相關(guān)的角膜受損/角膜穿孔提供替代治療的可能，或許在不久的將來，人造角膜將成為事實。

2.2 晶狀體

與角膜相似，晶狀體也是無血管的透明組織，由表面的晶狀體上皮細(xì)胞包裹內(nèi)部洋蔥狀層疊的特化纖維細(xì)胞組成。晶狀體的發(fā)育起源于表面外胚層，在外凸的視網(wǎng)膜原基和眼周間充質(zhì)的作用下，視網(wǎng)膜原基附近的表面外胚層增厚，特化為晶狀體基板。晶狀體基板向內(nèi)膨出，與表面外胚層逐漸分離，形成具有晶狀體原始結(jié)構(gòu)的晶狀體囊。晶狀體囊前端細(xì)胞成為晶狀體上皮細(xì)胞；后端細(xì)胞分化為纖維細(xì)胞，形成胚胎核，被稱為初級纖維；晶狀體上皮細(xì)胞保持增殖能力，在赤道部活躍增殖，所產(chǎn)生的子代細(xì)胞向晶狀體內(nèi)部遷移并分化為纖維細(xì)胞包裹胚胎核，被稱為次級纖維[45-46]。

人們對于體外構(gòu)建晶狀體組織的嘗試也是從原發(fā)組織細(xì)胞開始的。1980年，有學(xué)者[47]利用小鼠晶狀體上皮細(xì)胞，首次誘導(dǎo)出表達(dá)晶狀體特異蛋白、具有類似透鏡樣形態(tài)的細(xì)胞團(tuán)，稱之為晶狀體小體，這是人們首次在體外培養(yǎng)出晶狀體類器官樣結(jié)構(gòu)。30年之后，人們參考體內(nèi)晶狀體發(fā)育所經(jīng)歷的信號調(diào)控過程，序貫性利用Noggin早期抑制BMP信號通路，依次通過再激活BMP、FGF和WNT信號，可模擬體內(nèi)晶狀體發(fā)育過程，將人ESC經(jīng)定向誘導(dǎo)形成晶狀體小體樣結(jié)構(gòu)，所得晶狀體小體高度表達(dá)晶狀體特異蛋白α-、β-及γ-晶狀體蛋白，以及晶狀體骨架蛋白BFSP1、BFSP2和MIP、并具有一定的透明性。但其實際上為晶狀體上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞的混合物，且所得晶狀體小體太小，缺乏屈光能力[48]。之后，F(xiàn)u等[49]利用人iPSCs，對該晶狀體小體誘導(dǎo)體系進(jìn)行了改良，通過機械富集E-cadherin+的上皮樣細(xì)胞，使其形成巨大的“煎蛋樣”克隆島，并經(jīng)定向誘導(dǎo)為FOXE3+的類晶狀體前體細(xì)胞，從而獲得了更大的晶狀體小體，該晶狀體小體不僅表達(dá)晶狀體細(xì)胞的分子標(biāo)志物，其晶狀體上皮及纖維細(xì)胞的排列還與體內(nèi)晶狀體類似，并可觀察到晶狀體纖維細(xì)胞細(xì)胞器降解過程。而Murphy等[50]發(fā)現(xiàn)ROR1可作為晶狀體上皮細(xì)胞的表面標(biāo)記受體，通過流式分選富集，并利用微孔板及瓊脂膠對定向誘導(dǎo)所得的晶狀體上皮細(xì)胞進(jìn)行成團(tuán)培養(yǎng)，得到了大量的晶狀體小體，除了表達(dá)晶狀體特異的蛋白，改良后產(chǎn)物形成了雙凸結(jié)構(gòu)并具有屈光能力。

建立晶狀體類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)體系可為研究晶狀體發(fā)育和病理機制提供理想模型。研究者們利用人晶狀體類器官誘導(dǎo)體系，揭示了人晶狀體纖維細(xì)胞分化的新機制和長非編碼RNA在晶狀體細(xì)胞脫細(xì)胞器過程中的作用[51-52]。也有研究者們[53]利用紫外線照射處理晶狀體小體，建立年齡相關(guān)性白內(nèi)障的疾病模型，并闡明了蛋白聚集在年齡相關(guān)性白內(nèi)障致病中的作用。2016年，Lin等[54]明確了晶狀體上皮干細(xì)胞的存在，展示了晶狀體上皮細(xì)胞可在體外形成晶狀體類器官?？傊?，晶狀體類器官培養(yǎng)體系的建立和進(jìn)一步完善將為晶狀體的發(fā)育、病理和轉(zhuǎn)化研究提供寶貴的模型工具。

2.3 視網(wǎng)膜

視網(wǎng)膜是眼球中結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的組織，包含六大類神經(jīng)細(xì)胞(視錐感光細(xì)胞、視桿感光細(xì)胞、雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞、無長突細(xì)胞和視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞)和一類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(Müller細(xì)胞)。這些數(shù)目眾多的視網(wǎng)膜細(xì)胞高度有序地排列為3個細(xì)胞層(外核層，內(nèi)核層和視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層)，并由2個神經(jīng)突觸層相連接(外叢狀層和內(nèi)叢狀層)。在胚胎發(fā)育過程中，視網(wǎng)膜發(fā)育起始于間腦部位的神經(jīng)管原基，其向外膨出形成視泡，外膨視泡在到達(dá)表面外胚層附近后開始內(nèi)凹，形成具有兩層結(jié)構(gòu)的視杯。視杯外層分化為視網(wǎng)膜色素上皮(retina pigment cell，RPE)，內(nèi)層分化為神經(jīng)視網(wǎng)膜(neural retina，NR)。NR中的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞增殖并有序退出細(xì)胞周期，陸續(xù)分化形成各類視網(wǎng)膜細(xì)胞[55-57]。在低等動物如斑馬魚中，成體周邊視網(wǎng)膜的睫狀緣帶細(xì)胞及Müller細(xì)胞仍保留再生潛能，視網(wǎng)膜損傷后可進(jìn)行再生修復(fù)[58-59]。而在哺乳動物中，視網(wǎng)膜無法再生。視網(wǎng)膜退行性疾病，如視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性、Stargardt’s綜合征、青光眼、Leber先天性黑朦等，均以視網(wǎng)膜某一類或多類視網(wǎng)膜神經(jīng)元丟失為特征。目前仍缺乏針對這些視網(wǎng)膜退行性疾病的有效治療手段，是防盲致盲的難點問題，也促使人們利用各種傳統(tǒng)與前沿的生物醫(yī)藥技術(shù)，開發(fā)視網(wǎng)膜疾病防、診、治新策略[25]。

2.3.1 視網(wǎng)膜類器官技術(shù)的發(fā)展

2011年，Eiraku等[60-61]基于他們前期對腦組織類器官構(gòu)建和視網(wǎng)膜細(xì)胞體外分化的研究基礎(chǔ)，成功建立了由小鼠ESC構(gòu)建三維視網(wǎng)膜類器官的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系。該體系構(gòu)建的視網(wǎng)膜類器官高度模擬視杯發(fā)育過程，多能干細(xì)胞經(jīng)由Matrigel的支持，自我組裝為立體的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞球，通過調(diào)控WNT通路和FGF通路，平衡神經(jīng)視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜色素上皮的細(xì)胞分化命運選擇，從而得到視網(wǎng)膜前體細(xì)胞球。令人驚喜的是，視網(wǎng)膜前體細(xì)胞球具有分化為各類視網(wǎng)膜細(xì)胞的能力，并可類似體內(nèi)視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)高度有序排列。這是人類第1次人工合成如此復(fù)雜的類器官，極大提升了人們對類器官研究的熱忱。2012年，Nakano等[62]團(tuán)隊進(jìn)一步建立了人視網(wǎng)膜類器官的誘導(dǎo)體系。在Nakano等[62]開創(chuàng)性的視網(wǎng)膜類器官工作之后，人們通過各種方法進(jìn)一步完善這一系統(tǒng)。Zhong等[63-64]改進(jìn)了擬胚體的形成策略，利用貼附培養(yǎng)的方法提高類視杯的誘導(dǎo)效率。同時，Lowe等[64]還通過利用攪拌式生物反應(yīng)器(spinning bioreactor)，提高類視杯的存活時間，從而收獲了具有成熟外節(jié)和電生理功能感光細(xì)胞的視網(wǎng)膜類器官。

在過去十年里，視網(wǎng)膜類器官的誘導(dǎo)策略在不斷改進(jìn)，目前大致可分為4種：1)基于SFEBq策略、在懸浮體系中完成類視杯誘導(dǎo)[60-62,65-66]；2)懸浮形成擬胚體-貼附誘導(dǎo)類視杯的策略[63,67]；3)在平板中進(jìn)行神經(jīng)外胚層定向誘導(dǎo)，機械富集類視杯后懸浮培養(yǎng)[68-69]；4)利用matrigel包埋ESC形成上皮樣囊腔，對囊腔進(jìn)行類視杯誘導(dǎo)[64,70]。通過不斷改進(jìn)視網(wǎng)膜誘導(dǎo)體系，所得的視網(wǎng)膜類器官結(jié)構(gòu)更加成熟。Kuwahara等[66]使用BMP4替代matrigel，提高了基于SFEBq策略誘導(dǎo)類視杯的效率，并摸索出穩(wěn)定獲得類視網(wǎng)膜睫狀緣區(qū)的誘導(dǎo)體系；Capowski等[69]利用16種不同品系的iPSC，闡明了成熟視網(wǎng)膜類器官分化過程的3個階段。Kim等[70]改良了Lowe體系，發(fā)現(xiàn)所得的視網(wǎng)膜類器官中感光細(xì)胞的視桿、視錐細(xì)胞比例與人黃斑結(jié)構(gòu)相似。Cowan等[71]通過棋盤式刮板分離視網(wǎng)膜前體細(xì)胞，進(jìn)一步獲得了更多的視網(wǎng)膜類器官。Achberger等[72]利用微流體芯片在NR類器官旁加入iPSC分化的RPE，以模擬體內(nèi)NR和RPE的作用，進(jìn)一步促進(jìn)了感光細(xì)胞的外節(jié)分化。

2.3.2 視網(wǎng)膜類器官的應(yīng)用

視網(wǎng)膜類器官技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于視網(wǎng)膜發(fā)育、疾病發(fā)病機制的研究，以及藥物篩選和替代治療的探索。結(jié)合基因組學(xué)、蛋白組學(xué)測序，多個研究團(tuán)隊已揭示了在視網(wǎng)膜類器官的分化過程中，其基因表達(dá)譜、組蛋白修飾和DNA甲基化圖譜與體內(nèi)胚胎視網(wǎng)膜發(fā)育相似，以此闡明視網(wǎng)膜各類細(xì)胞的分化軌跡和調(diào)控機制[71,73]。結(jié)合CRISPR等基因編輯技術(shù)，視網(wǎng)膜類器官技術(shù)已用于研究基因在視網(wǎng)膜發(fā)育中作用：Takata等[74]發(fā)現(xiàn)敲除Rspo2和Six3后的小鼠視網(wǎng)膜類器官形態(tài)發(fā)育異常，揭示了Rspo2和Six3在神經(jīng)視網(wǎng)膜上皮發(fā)育中的作用；Capowski等[75]發(fā)現(xiàn)MITF突變可導(dǎo)致類視泡組織體積減小，揭示了MITF可調(diào)控早期視泡細(xì)胞的增殖能力。研究者們還利用視網(wǎng)膜類器官誘導(dǎo)體系，構(gòu)建了視網(wǎng)膜疾病模型以探究發(fā)病機制：Li等[76]將RPE65突變的iPSC誘導(dǎo)為視網(wǎng)膜類器官，構(gòu)建了Leber先天性黑朦的疾病模型；Quinn等[77]利用CRB1突變的iPSC，通過誘導(dǎo)視網(wǎng)膜類器官構(gòu)建了視網(wǎng)膜色素變性的視網(wǎng)膜類器官模型；Gao等[78]利用PDE6B突變的iPSC，構(gòu)建了遲發(fā)性視網(wǎng)膜色素變性的視網(wǎng)膜類器官模型。

此外，與二維視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)相比，視網(wǎng)膜類器官是更可靠的藥物篩選工具。有研究者[79]構(gòu)建了晚期視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)類器官模型，發(fā)現(xiàn)該模型能重現(xiàn)拓?fù)涮婵怠⒓装钡实然熕幬飳B的臨床效果。此外，視網(wǎng)膜類器官還可模擬羥基他莫昔芬(4-OHT)、乙酚對視網(wǎng)膜的藥物不良反應(yīng)和維生素E、葉黃素對視網(wǎng)膜的保護(hù)作用[80]。

最后，研究者們已嘗試分離視網(wǎng)膜類器官中的各細(xì)胞組分，通過細(xì)胞懸液注射或植片移植，進(jìn)行不可逆性視網(wǎng)膜疾病的替代治療。感光細(xì)胞丟失是多種不可逆性視網(wǎng)膜疾病的共通結(jié)果。Lakowski等[81]利用人視網(wǎng)膜類器官篩選出感光前體細(xì)胞的表面受體組合，從而富集視網(wǎng)膜類器官中的感光前體細(xì)胞并移植入小鼠視網(wǎng)膜下，發(fā)現(xiàn)移植物可在小鼠中成功存活。Garita-Hernandez等[82]通過富集視網(wǎng)膜類器官的視錐前體細(xì)胞，用于治療視網(wǎng)膜變性小鼠，發(fā)現(xiàn)可部分恢復(fù)其對光的感應(yīng)。而在視網(wǎng)膜退行性疾病的終末期，視網(wǎng)膜受累細(xì)胞不局限于單一的細(xì)胞類型，甚至?xí)?dǎo)致外核層消失。針對這種情況，Zou等[83]從視網(wǎng)膜類器官中分離出C-Kit+/SSEA4-的早期視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，并移植入晚期視網(wǎng)膜變性小鼠模型體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)祖細(xì)胞在體內(nèi)可形成成熟的感光細(xì)胞層，與宿主細(xì)胞產(chǎn)生突觸聯(lián)系并改善視功能。雖然在小鼠的替代治療初見效果，我們?nèi)孕枰獙σ暰W(wǎng)膜前體細(xì)胞的篩選、移植策略、視網(wǎng)膜細(xì)胞間整合機制等問題作更深層次的研究，以實現(xiàn)人視網(wǎng)膜退行性疾病的替代性治療。

除了角膜、晶狀體和視網(wǎng)膜已實現(xiàn)了類器官的誘導(dǎo)培養(yǎng)，淚腺類組織誘導(dǎo)技術(shù)也亦見報道。Hirayama等[84]等在2013年分離胚鼠淚腺和Harderian腺原基中的上皮干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，利用膠原將這兩種成體干細(xì)胞混合形成細(xì)胞團(tuán)，并移植入去淚腺的成年小鼠中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)可在小鼠體內(nèi)存活并自我組裝，形成了表達(dá)淚腺上皮標(biāo)志物、結(jié)構(gòu)相似的類淚腺組織。此外，它還具有分泌淚液的功能，并可與受體的淚液排出通道形成連接。隨后，研究者們開發(fā)了淚腺的去細(xì)胞骨架，利用成年鼠、兔和豬中的淚腺上皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞，誘導(dǎo)出具有功能的淚腺類器官，移植體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)可代償?shù)臏I腺功能[85-87]。

3 結(jié)語

類器官技術(shù)為眼發(fā)育提供了新的工具，更為研究遺傳性眼病、實現(xiàn)個體化治療提供可能性。盡管如上所述，眼類器官研究領(lǐng)域已取得長足進(jìn)展，但所得產(chǎn)物與真實的組織/器官仍存在較大的差異，這限制了它們的應(yīng)用。

首先，類器官誘導(dǎo)產(chǎn)物的結(jié)果分化并不理想。得益于先前發(fā)育生物學(xué)的研究積累，研究者們掌握了體內(nèi)各類細(xì)胞的發(fā)育來源及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可使干細(xì)胞經(jīng)調(diào)控通路向單一的祖細(xì)胞定向分化，獲得了從該祖細(xì)胞來源的大部分子細(xì)胞，但實際上，誘導(dǎo)產(chǎn)物的各細(xì)胞組分的數(shù)量、比例及進(jìn)一步細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)分化并不理想。如晶狀體類器官，研究者們實現(xiàn)了晶狀體祖細(xì)胞的定向分化，獲得了同時具有晶狀體上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)產(chǎn)物，但現(xiàn)有的產(chǎn)物中細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞排列、形態(tài)與真實的晶狀體仍相去甚遠(yuǎn)。

其次，目前所得的眼類器官為單一胚層的組織/器官。與眼類器官不同，眼組織是由多胚層組成的：與體內(nèi)相比，目前多數(shù)角膜類器官缺乏神經(jīng)嵴來源的基質(zhì)層及內(nèi)皮層；而現(xiàn)有的視網(wǎng)膜類器官仍缺乏了內(nèi)胚層來源的小膠質(zhì)細(xì)胞和血管組織支持。此外，當(dāng)前缺乏由多個眼組織構(gòu)成的眼前節(jié)/眼后節(jié)模型。眼發(fā)育或疾病的產(chǎn)生通常是多個眼組織間共同作用的結(jié)果，比如晶狀體發(fā)育需視泡的作用、角膜發(fā)育需晶狀體的作用等。建立不同眼組織之間相互作用的模型，可為研究眼系統(tǒng)性疾病的機制提供工具。

此外，雖然利用類器官技術(shù)已在體外獲得具有多能分化潛力的組織特異的前體細(xì)胞，但由于各實驗室所用種子細(xì)胞品系、培養(yǎng)基、培養(yǎng)方案的細(xì)微差異，即使同一誘導(dǎo)體系在不同實驗室間誘導(dǎo)效率也存在較大的差異。比如，研究者們發(fā)現(xiàn)，與其他非視網(wǎng)膜來源的體細(xì)胞相比，由RPE重編程而得的iPSC向RPE誘導(dǎo)的效率更高。相似地，由視網(wǎng)膜感光細(xì)胞重編程而得的iPSC的視網(wǎng)膜類器官誘導(dǎo)效率更高[88-89]。隨著對表觀遺傳修飾的深入研究，目前認(rèn)為這是因為不同品系的ESC、不同體細(xì)胞來源的iPSC的表觀印記不同。由于表觀印記的存在，不同ESC或iPSC在同一分化體系下的誘導(dǎo)效率存在較大的差異[90]。因此，對于類器官再生的技術(shù)細(xì)節(jié)，如細(xì)胞來源、細(xì)胞密度、細(xì)胞外基質(zhì)的選擇等，均需進(jìn)一步細(xì)化。

針對這些問題，有研究者利用攪拌式生物反應(yīng)器(spinning bioreactor)、微流體芯片(microfluidic chip)等生物工程技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用，以及多胚層細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)等策略可更好模擬體內(nèi)器官發(fā)育狀態(tài)，有望突破眼睛類器官結(jié)構(gòu)分化不成熟、單一胚層的技術(shù)頸瓶。同時，通過建立標(biāo)準(zhǔn)化誘導(dǎo)體系，可利于破除實驗室間由于系統(tǒng)誤差帶來的結(jié)果偏倚，擴大利用類器官進(jìn)行藥物測試的可信度。另一方面，雖然通過對分子機制及細(xì)胞微環(huán)境的探索，我們可得到眼組織的前體細(xì)胞，但前體細(xì)胞之間如何更好組裝也亟待探索，因此應(yīng)進(jìn)一步探索眼類器官立體結(jié)構(gòu)形成的分子機制，為改進(jìn)眼類器官提供線索。或許在未來，基于對類器官結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組成和分化機制的更成熟的認(rèn)識，研究者們可創(chuàng)建更復(fù)雜、與體內(nèi)更相似的眼類器官，進(jìn)一步促進(jìn)眼組織發(fā)育和疾病發(fā)病機制的研究，以及藥物篩選和替代治療的探索。

開放獲取聲明

本文適用于知識共享許可協(xié)議(Creative Commons)，允許第三方用戶按照署名(BY)-非商業(yè)性使用(NC)-禁止演繹(ND)(CCBY-NC-ND)的方式共享，即允許第三方對本刊發(fā)表的文章進(jìn)行復(fù)制、發(fā)行、展覽、表演、放映、廣播或通過信息網(wǎng)絡(luò)向公眾傳播，但在這些過程中必須保留作者署名、僅限于非商業(yè)性目的、不得進(jìn)行演繹創(chuàng)作。詳情請訪問：https://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/4.0/。