基于ITS2序列的市售木通藥材及其混偽品的分子鑒定

穆威杉，謝紅波，趙 晴，史萌萌，胡志剛，魏妙潔，劉金欣, ，石林春

? 藥材與資源 ?

基于ITS2序列的市售木通藥材及其混偽品的分子鑒定

穆威杉1，謝紅波1，趙 晴1，史萌萌1，胡志剛2，魏妙潔3，劉金欣1, 3*，石林春3*

1. 承德醫(yī)學院 河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北 承德 067000 2. 湖北中醫(yī)藥大學藥學院，湖北 武漢 430065 3. 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193

建立基于核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（internal transcribed spacer 2，ITS2）序列的木通藥材DNA條形碼鑒定方法，對市售木通藥材進行物種分析。收集河北、安徽、貴州等地的樣品總計45份，其中木通藥材及其混偽品的原植物樣品18份，市售木通藥材樣品27份。通過提取DNA、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增、雙向測序獲得ITS2序列，基于鄰接（neighbor joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）位點進行物種鑒定分析?；谀就ㄋ幉募捌浠靷纹吩参颕TS2序列構建的NJ樹分析結(jié)果表明，木通藥材正品及其混偽品在NJ樹上聚為獨立的分支，木通藥材正品及其混偽品在NJ樹上可明確區(qū)分；基于NJ樹對27份市售木通藥材的物種分析表明，市售樣品中僅有4份為正品木通，2份為小木通，21份為粗齒鐵線蓮，正品率為14.8%?；贗TS2序列的DNA條形碼技術可以準確區(qū)分中藥材木通及其混偽品，市售木通藥材物種較混亂。

木通；市售藥材；ITS2；DNA條形碼；鑒定

木通為臨床常用藥材。據(jù)《中國藥典》2020年版記載[1]，中藥材木通為木通科植物木通(Thunb.) Decne.、三葉木通(Thunb.) Koidz.或白木通(Thunb.) Koidz. var.(Diels) Rehd.的干燥藤莖。近代以來木通藥材的使用情況十分混亂，易將木通與川木通、關木通混淆使用[2]。1954年任仁安[3]調(diào)查發(fā)現(xiàn)木通類商品以馬兜鈴科關木通為主，但由于關木通含有馬兜鈴酸會引發(fā)腎損傷[4-5]，2003年關木通已被國家食品藥品監(jiān)督管理局禁用[6]。在關木通被禁用之后，川木通成為木通類藥材的主流商品[7-8]。川木通為毛茛科鐵線蓮屬植物小木通Franch.或繡球藤Buch. -Ham.的干燥藤莖[1]。木通藥材長期依賴于野生資源，市場供應不足[9]，而川木通資源豐富且具有較高利潤，市場上存在川木通代替木通的現(xiàn)象[7]。木通類藥材雖名稱相近，但木通、川木通、關木通的原植物來源于不同的科屬，其化學成分、藥理作用及臨床應用均存在差異[10-11]。若臨床中將木通與川木通、關木通混淆使用，不僅藥效難以保證，臨床用藥安全也將存在隱患。

《中國藥典》2020年版收載的木通藥材鑒別方法主要為性狀鑒定法、顯微鑒定法及薄層色譜法[1]。性狀鑒定與顯微鑒定依賴于鑒定人員的專業(yè)知識和鑒定經(jīng)驗，同時中藥材的性狀或顯微特征可能因其基原與產(chǎn)地不同而存在一定差異[12]，加上木通類藥材均以藤莖入藥，性狀相似，利用性狀及顯微特征對木通藥材進行鑒別存在一定困難。利用薄層色譜法對木通藥材進行鑒定時，木通藥材的甲醇和乙酸乙酯提取物為多種化學成分的混合物[13]，對木通苯乙醇苷B的檢測易受其他化學性質(zhì)相似成分的影響，同時孫萍等[14]研究發(fā)現(xiàn)木通與川木通同樣含有較多相似的化學成分。DNA條形碼技術利用基因組中一段公認的、相對較短的DNA序列進行物種鑒定[15]，不受時間、氣候、植物發(fā)育階段等的影響，具有準確、快速、易于操作等優(yōu)勢，是對傳統(tǒng)中藥鑒定方法的有效補充[16]。目前DNA條形碼技術已廣泛用于動物、植物、真菌等生物類群的物種鑒定[17-19]。當前，“中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則”、“DNA測序技術指導原則”已收載于《中國藥典》2020年版[20]，基于測序技術的DNA分子鑒定方法將成為中藥鑒定學的重要發(fā)展方向。

本研究以木通藥材為研究對象，通過收集木通及其混偽品的原植物樣品，利用基于ITS2序列的DNA條形碼技術構建中藥材木通及其混偽品的鑒定方法；并應用該技術對市售木通藥材進行物種分析，為保障木通藥材的臨床用藥安全提供技術支持。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器與試劑

SQP型電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司）；MM400型球磨儀（德國Retsch公司）；手動移液槍（德國eppendorf公司）；VORTEX-5型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；1-14型離心機（德國Sigma公司）；Nanodrop One型超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；T100型聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；Gel DocTMXR＋型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；天根植物DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；2×Taq PCR Master Mix試劑（北京艾德萊生物科技有限公司)；AL2000 DNA Maker（北京艾德萊生物科技有限公司）；瓊脂糖（BIOWEST公司）；引物 [生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1.2 材料

本研究共收集45份實驗樣品，包括18份原植物樣品和27份市售藥材樣品。原植物樣品采集自湖北、吉林、重慶等地，并經(jīng)由湖北中醫(yī)藥大學藥學院胡志剛教授和中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所石林春副研究員鑒定；市售藥材樣品收集自河北、安徽、廣西等地的藥材市場、藥房或藥店。詳細信息見表1、2。

2 方法

2.1 DNA提取、PCR擴增和序列測定

原植物樣品的稱樣量為10 mg，藥材樣品的稱樣量為30 mg，使用球磨儀進行研磨，使用天根植物DNA提取試劑盒進行DNA提取，利用超微量分光光度計測定DNA的濃度和吸光度比值（260/280）。PCR擴增的引物、反應程序依據(jù)中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則[15]并略作調(diào)整，使用25 μL的反應體系進行PCR擴增，以1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測。將PCR產(chǎn)物純化后，使用AB1 3730XL測序儀進行雙向測序。

表1 木通及其混偽品原植物樣品采集信息及其ITS2序列的GenBank登錄號

Table 1 Information of original plant samples of Akebiae Caulis and its adulterants, and their ITS2 GenBank accession numbers

樣品編號物種名拉丁名來源登錄號 BZYP001木通Akebia quinata 江西九江MT534353 BZYP002木通A. quinata 江西九江MT534352 BZYP003木通A. quinata 江西九江MT534351 BZYP004三葉木通A.trifoliata江西九江MT534350 BZYP005三葉木通A.trifoliata江西九江MT534349 BZYP006白木通A.trifoliata var. australis湖北武漢MT534348 BZYP007白木通A.trifoliata var. australis湖北武漢MT534347 BZYP008白木通A.trifoliata var. australis湖北武漢MT534346 BZYP009小木通Clematis armandii重慶城口MT534358 BZYP010小木通C. armandii重慶城口MT534359 BZYP011繡球藤C. montana湖北十堰MT534360 BZYP012繡球藤C. montana湖北十堰MT534361 BZYP013關木通Aristolochia manshuriensis吉林通化MT534342 BZYP014關木通A. manshuriensis吉林通化MT534341 BZYP015關木通A. manshuriensis吉林通化MT534340 BZYP016粗齒鐵線蓮Clematis argentilucida江西九江MT534355 BZYP017粗齒鐵線蓮C. argentilucida江西九江MT534356 BZYP018粗齒鐵線蓮C. argentilucida江西九江MT534357

表2 市售木通藥材樣品信息及其ITS2序列的GenBank登錄號

Table 2 Information of commercially available Akebiae Caulis medicinal materials and their ITS2 GenBank accession numbers

樣品編號樣品來源登錄號 MTYC001貴州省畢節(jié)市某藥店MT534379 MTYC002貴州省畢節(jié)市某藥店MT534380 MTYC003貴州省畢節(jié)市某藥店MT534381 MTYC004貴州省畢節(jié)市某藥店MT534382 MTYC005貴州省畢節(jié)市某藥店MT534343 MTYC006北京某藥房MT534383 MTYC007北京某藥房MT534384 MTYC008河北承德某藥店MT534362 MTYC009河北安國藥材市場MT534344 MTYC010河北安國藥材市場MT534370 MTYC011河北安國藥材市場MT534371 MTYC012河北安國藥材市場MT534363 MTYC013四川成都藥材市場MT534365 MTYC014四川成都某藥店MT534366 MTYC015四川成都某藥店MT534367 MTYC016四川成都某藥店MT534368 MTYC017四川成都某藥店MT534369 MTYC018安徽亳州某藥店MT534374 MTYC019安徽亳州藥材市場MT534375 MTYC020安徽亳州藥材市場MT534376 MTYC021安徽亳州藥材市場MT534345 MTYC022山東菏澤藥材市場MT534372 MTYC023山東菏澤藥材市場MT534373 MTYC024重慶某藥店MT534364 MTYC025江蘇宿遷某藥店MT534377 MTYC026陜西寶雞某藥店MT534378 MTYC027廣西玉林藥材市場MT534354

2.2 數(shù)據(jù)分析

利用CodonCode Aligner v.8.0.2軟件去除測序峰圖兩端的低質(zhì)量區(qū)，并完成校對和拼接，基于隱馬爾可夫模型（hidden markov model，HMM）注釋獲得ITS2條形碼序列區(qū)間[21]；利用MEGA X軟件[22]完成多序列比對及NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，并設置Bootstrap為2000檢驗各分支的支持率；采用建樹法和SNP分析完成物種鑒定。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA提取、PCR擴增及測序

根據(jù)“2.1”項中的DNA提取方法完成45份樣品的DNA提取。DNA檢測結(jié)果顯示，45份樣品DNA質(zhì)量濃度的平均值為178.9 ng/μL，260/280在1.8～2.05，表明所有樣品均成功提取質(zhì)量較高的DNA，DNA提取成功率為100%。將提取的DNA模板加入25 μL的PCR體系中，按照設置好的擴增程序進行PCR擴增，所得到的PCR產(chǎn)物在電泳膠圖上的條帶單一且明亮，長度在500 bp左右。18份原植物樣品及27份市售木通藥材樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)過雙向測序，所有樣品的ITS2序列均獲得較高質(zhì)量雙向測序峰圖，部分樣品的ITS2序列在個別堿基位點存在不同程度的測序套峰，如在第87位存在AC套峰、103位和170位存在AG套峰、201位存在TC套峰（圖1）。經(jīng)CodonCode Aligner軟件校對拼接，切除5.8 S rRNA和28 S rRNA區(qū)域后得到45條ITS2條形碼序列，質(zhì)量分析表明符合《中國藥典》2020年版的“DNA測序技術指導原則”，可滿足后續(xù)分析需要。

圖1 部分樣品的局部測序峰圖

3.2 木通及其混偽品原植物的DNA條形碼分析

18份原植物樣品均可成功獲得ITS2序列。木通、三葉木通、白木通的ITS2序列共8條，比對后長度均為216 bp，平均GC含量為67.28%，共有2種序列類型A1和A2，A1為木通，A2為三葉木通或白木通，其中第190位可以作為木通與三葉木通、白木通的特異性SNP鑒定位點，木通在該位點的堿基為G，而三葉木通或白木通在該位點均為T，木通可以與三葉木通、白木通相互區(qū)分。白木通作為三葉木通的亞種，無法與三葉木通清晰區(qū)分。小木通、繡球藤的ITS2序列各2條，比對后序列長度均為222 bp，GC含量為66.50%～68.30%，平均GC含量為67.40%；獲得粗齒鐵線蓮的序列3條，比對后序列長度為222 bp，GC含量為68.90%；關木通的ITS2序列共3條，比對后長度為274 bp，GC含量為71.2%。木通及其混偽品原植物ITS2序列的變異位點見圖2。

圖2 木通及其混偽品種內(nèi)種間ITS2序列比對

經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹分析，木通藥材的基原植物木通、三葉木通、白木通及其混偽品在鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹上分別聚為獨立的分支，同為毛茛科的小木通、繡球藤、粗齒鐵線蓮序列聚為一大支，各物種間可明顯區(qū)分，關木通單獨聚為一支，木通藥材正品及其混偽品在NJ系統(tǒng)發(fā)育樹上可明確區(qū)分（圖3），表明基于ITS2序列構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹可有效鑒別木通藥材基原植物及川木通、粗齒鐵線蓮、關木通等易混品。

圖3 基于ITS2序列構建的木通藥材及其混偽品的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

3.3 基于DNA條形碼技術的市售藥材物種鑒定

本研究從藥材市場、藥店和藥房共收集27份市售木通藥材樣品，均可成功獲得ITS2序列，將市售藥材與木通及其混偽品原植物獲得的ITS2序列共同構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），以對市售木通藥材進行物種分析，結(jié)果表明：在27份市售木通藥材樣品中，21份與粗齒鐵線蓮的原植物樣品聚為一支，占比77.8%，2份與小木通的原植物樣品聚為一支，占比7.4%，4份與木通藥材的基原植物聚為一支，正品率為14.8%；木通藥材混偽品存在于市場流通的各個環(huán)節(jié)，在藥材市場、藥店和藥房均發(fā)現(xiàn)木通藥材的混偽品存在。

4 討論

4.1 木通藥材品種混亂，DNA條形碼技術可用于市場上木通藥材的物種分析

本草文獻對木通的記載不明確?！侗静菥V目》[23]中記載“有細細孔，兩頭皆通，故名通草，即今所謂木通也”。謝宗萬認為木通科木通屬、野木瓜屬、八月瓜屬，毛茛科鐵線蓮屬、馬兜鈴科馬兜鈴屬等多種科屬植物的藤莖均符合上述特征[24]。清代《植物名實圖考》[25]中“小木通”項下提到“藤本能利水者，多以木通名之”，而木通與川木通均具有“利尿通淋”的功效。由于木通類藥材性狀功效相似，不同地區(qū)的用藥習慣差異，市場上的木通藥材存在一物多名、同名異物等現(xiàn)象。1996年出版的《全國中草藥匯編》記載，在江蘇及四川等地存在將正品木通當作“海風藤”使用的情況[26]。木通產(chǎn)于安徽大別山、湖南武陵山、河南伏牛山及桐柏山脈、湖南、湖北、江浙等地[9]，多為自產(chǎn)自銷，野生資源蘊藏量有限，栽培木通的主要目的是獲取其果實，俗稱“八月炸”“八月瓜”“中華腎果”等，味道甘甜清潤，營養(yǎng)價值高[27-28]，種植戶砍藤獲取木通藥材的動力不足。此外，《中國藥典》中收錄的“預知子”為木通的干燥近成熟果實，市場價格一般為木通藥材的1～3倍，木通果實入藥也在一定程度上使得木通藤莖獲取受限。木通藥材北方藥源不足，而關木通在東北地區(qū)產(chǎn)量大，價格較低，逐漸推廣銷售至全國[2]，在2003年關木通被禁用之后，市場上存在較廣泛川木通代替木通的現(xiàn)象。另外，根據(jù)國錦琳等對川木通商品的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，市場上存在大量粗齒鐵線蓮作為川木通商品流通的情況[29]。川木通的混偽品也出現(xiàn)在木通藥材中。

圖4 基于ITS2序列構建的市售木通藥材NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

本研究基于ITS2序列對收集的27份市售木通藥材鑒定表明，僅有4份為正品木通，混偽品包括川木通與粗齒鐵線蓮，與其他學者相關的市場調(diào)查結(jié)果一致[7,29]，表明基于ITS2序列的DNA條形碼技術可以區(qū)分中藥材木通、川木通、關木通和粗齒鐵線蓮，可用于市場上木通藥材的物種分析。但由于ITS2序列通常作為物種水平的鑒定條形碼，在本研究中無法實現(xiàn)亞種或變種水平的鑒定，需要篩選新的輔助條形碼或者采用葉綠體全基因組[30]來實現(xiàn)木通的種內(nèi)物種鑒定。

4.2 DNA條形碼技術與高通量測序技術相結(jié)合可用于中成藥中木通成分的物種分析

木通是小兒金丹片、龍膽瀉肝丸、排石顆粒等28種中成藥的處方成分。但歷版《中國藥典》對“木通類”藥材的收載情況存在變化?！吨袊幍洹?963年版[31]同時收錄了木通、川木通及關木通3種木通類藥材，隨后在《中國藥典》1977年版[32]、1985版[33]、1990年版[34]、1995年版[35]、2000年版[36]中只收錄了關木通和川木通，由于木通藥源短缺，未被收錄其中[37]，木通逐漸淡出市場[2]。2002年，木通再次被《中國藥典》2000年版增補版收載。1977版和《中國藥典》1985年版一部的藥材及飲片部分雖未收載木通，但成方制劑和單方制劑部分收載的導赤丸、龍膽瀉肝丸的處方成分一直規(guī)定為木通。在《中國藥典》1990年版所收載的赤導丸、龍膽瀉肝丸的處方中，直接以關木通取代木通。1993年，比利時出現(xiàn)因使用含中草藥的減肥藥而導致腎衰竭的事件[38]，1996年，研究者從受害者的腎組織中分離出馬兜鈴酸-DNA加合物[39]。隨著研究的深入，人們逐漸明確了導致此類腎病的罪魁禍首為馬兜鈴酸，由于關木通含有馬兜鈴酸成分，在2003年國家藥品監(jiān)督管理局通知取消關木通藥用標準（國藥監(jiān)注［2003］121號）后，《中國藥典》2005年版[40]及此后各版藥典只收錄川木通和木通。導赤丸、龍膽瀉肝丸等成方制劑的處方成分也將關木通修改為木通?？梢娪捎谀就ㄋ幉牡幕靵y，導致含木通的成方制劑也存在處方成分混亂的情況。但藥典中含木通中成藥的處方成分僅存在木通與關木通更替的情況，并未將川木通與兩者混淆。

本研究所收集的樣品中發(fā)現(xiàn)，各地藥材市場和藥店銷售的木通藥材中，將川木通及其混偽品當作木通來使用的情況較嚴重，木通的流通商品以粗齒鐵線蓮和小木通為主，而正品木通卻較少。Xin等[41]通過對3份市售龍膽瀉肝丸樣品研究發(fā)現(xiàn)，一份樣品同時檢測到正品三葉木通和混偽品小木通，其余兩份僅檢測出小木通，說明中成藥中存在將川木通代替木通使用的現(xiàn)象。本研究以木通及其混偽品原植物參考樣品為基礎，表明基于ITS2序列的DNA條形碼技術可準確鑒定木通及其混偽品。但由于中成藥成分復雜，針對單一物種鑒定的DNA條形碼技術無法滿足多組分中成藥的鑒定。隨著測序技術的發(fā)展，可將高通量測序與DNA條形碼技術相結(jié)合，即DNA metabarcoding技術[42-43]和shotgun metagenomics技術[41]，用于含木通中成藥的成分鑒定，從而保證中成藥的投料準確與臨床療效，為木通藥材及其中成藥監(jiān)管提供技術支持。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Molecular identification of commercially availableand its adulterants based on ITS2 sequence

MU Wei-shan1, XIE Hong-bo1, ZHAO Qing1, SHI Meng-meng1, HU Zhi-gang2, WEI Miao-jie3, LIU Jin-xin1, 3, SHI Lin-chun3

1. Hebei Key Laboratory of Research and Development of Chinese Medicine, Chengde Medical University, Chengde 067000, China 2. College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China 3. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China

A DNA barcoding identification method based on internal transcribed spacer 2 (ITS2) sequences was established to analyze the species of commercially available Mutong ().A total of 45 samples from Hebei, Anhui, Guizhou provinces and other places were collected, including 18 samples of original plants samples and 27 samples of commercially available medicinal materials. Their ITS2 sequences have been obtained after DNA extraction, polymerase chain reaction (PCR) amplification and bi-directional sequencing. Species identification analysis were based on neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree and single nucleotide polymorphisms (SNPs).The results of NJ phylogenetic tree constructed by the original plants ofand its adulterants showed that the authenticand its main adulterants gathered into independent branches. The authenticand its adulterants could be clearly distinguished by the NJ phylogenetic tree. Based on the NJ tree, the analysis of the species of 27 commercial samples showed that only four samples were, two samples were, and 21 samples were. The authenticity rate of commercially available medicinal materials was 14.8%.The DNA barcoding based on the ITS2 sequence can accurately distinguishand its adulterants. The varieties of commercially availableare more chaotic.

; commercial medicinal materials; ITS2; DNA barcoding; identification

R282.12

A

0253 - 2670(2022)07 - 2108 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.021

2021-09-06

國家自然科學基金項目（81703659）；河北省教育廳青年拔尖人才項目（BJ2016002）；河北省高校重點學科建設項目（冀教高[2013] 4號）；承德醫(yī)學院重大項目科研專項（KY2020003）

穆威杉（1997—），女，碩士研究生，從事中藥資源與鑒定相關研究。Tel: (0314)2290474 E-mail: muweishan1997@126.com

劉金欣，副教授，從事中藥資源與鑒定相關研究。Tel: (0314)2290474 E-mail: liujx_23@163.com

石林春，副研究員，從事中藥資源與鑒定相關研究。Tel: (010)57833194 E-mail: linchun_shi@163.com

[責任編輯 時圣明]