滅多威對(duì)斑馬魚胚胎抗氧化防御系統(tǒng)的影響

陸妍，陳曦，，裘麗萍，胡庚東，，宋超，，范立民，，鄭堯，，孟順龍，*，陳家長(zhǎng)，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫 214081；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（無錫），中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院內(nèi)陸漁業(yè)生態(tài)環(huán)境和資源重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214081）

滅多威（Methomyl，MET），分子式為CHNOS，又稱乙肪威、萬(wàn)靈、滅蟲快等，屬于氨基甲酸酯類農(nóng)藥。滅多威是一種強(qiáng)效的殺蟲劑，因其選擇性強(qiáng)、高效等特點(diǎn)而被廣泛使用。1997年，滅多威被世界野生動(dòng)物基金會(huì)列為雌激素類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（Endocrine disrupting chemicals，EDCs）。EDCs對(duì)魚類的危害主要表現(xiàn)為生殖毒性、遺傳毒性、免疫毒性等。野外試驗(yàn)證實(shí)魚類生長(zhǎng)發(fā)育和生殖障礙與EDCs的暴露有關(guān)，處于生命發(fā)育早期的胚胎和幼魚對(duì)EDCs尤為敏感，短暫暴露可造成生物體組織器官的不可逆損傷。浙江省16個(gè)市級(jí)水源地的滅多威濃度達(dá)到0.172 0μg·L；多地檢測(cè)發(fā)現(xiàn)滅多威在自然水體中的殘留量為0～97μg·L；對(duì)吉林省6種食用菌農(nóng)藥殘留污染情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)滅多威均有檢出并且超出歐盟標(biāo)準(zhǔn)（0.1μg·L）。目前我國(guó)有關(guān)滅多威在水環(huán)境中殘留限量標(biāo)準(zhǔn)尚未制定，相關(guān)工作亟待開展。

滅多威能影響組織器官抗氧化酶活性，并對(duì)生物機(jī)體造成損傷效應(yīng)。以倉(cāng)鼠為研究對(duì)象發(fā)現(xiàn)，氧化損傷可能是環(huán)境雌激素生殖毒性的作用機(jī)理之一；滅多威使雄性大鼠血清、睪丸中丙二醛（MDA）含量顯著上升，超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）含量有所下降，并且染毒后，大鼠睪丸組織抗氧化能力減弱，抗氧化系統(tǒng)處于失代償狀態(tài)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)、氧自由基增多，影響睪丸的生精功能；在魚體受到外源污染物的脅迫時(shí)，體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)會(huì)作為一種代償機(jī)制來抵消生物體產(chǎn)生的活性氧。魚類等生物機(jī)體中存在一套完備的抗氧化防御體系，其中一類重要的抗氧化防御因子包括：SOD、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）、GSH、氧化型谷胱甘肽（GSSG）等，它們的活性會(huì)因污染物的存在而被誘導(dǎo)或抑制，是指示生物體是否處于污染脅迫狀態(tài)的重要參數(shù)。同時(shí)，MDA含量可用于判定胞膜脂質(zhì)過氧化損傷程度。因此，根據(jù)上述抗氧化防御因子活性及含量的變化可以一定程度上反映生物體所受外源環(huán)境脅迫的程度。

本文旨在探究滅多威對(duì)斑馬魚體內(nèi)抗氧化防御因子活性水平的影響，進(jìn)一步了解滅多威對(duì)斑馬魚胚胎抗氧化防御系統(tǒng)的損傷效應(yīng)，以期為斑馬魚作為污染檢測(cè)指示生物提供理論依據(jù)，為了解滅多威對(duì)魚類健康的潛在危害及相關(guān)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供可參考的資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用魚購(gòu)自上海費(fèi)曦生物科技有限公司，為AB系野生型斑馬魚。斑馬魚飼養(yǎng)于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心養(yǎng)殖室，采用更新式半靜態(tài)水養(yǎng)殖，飼養(yǎng)于28 cm×38 cm×30 cm規(guī)格的缸中。光暗比為14 h∶10 h，水溫控制在（28±1）℃，pH為7.2～7.6，溶解氧含量為（7.0±0.2）mg·L，每日喂食3次豐年蝦卵，每天更換一半的養(yǎng)魚用水，養(yǎng)魚用水為曝氣一周的去氯自來水。動(dòng)物福利按中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心規(guī)定（2011AA1004020012）執(zhí)行。

1.1.2 主要試劑與儀器

試驗(yàn)所用滅多威原藥（純度97%）購(gòu)自上海焦點(diǎn)生物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)中所示濃度為藥物的有效成分含量。氯化鈉（NaCl，分析純）購(gòu)自上海聯(lián)試化工試劑有限公司。總蛋白（TP）、SOD、CAT、GR、GSH、GSSG、MDA試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

試驗(yàn)主要儀器為DW-86L超低溫保存箱（海爾，青島）、PWC 124型分析天平[艾德姆衡器（武漢）有限公司]、BioTek酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）、紫外可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）、GKC 21-4控溫水浴鍋（南通滬南科學(xué)儀器有限公司）、PGX-150B智能光照培養(yǎng)箱（無錫沃信儀器有限公司）、80 i光學(xué)顯微鏡（Nikon，日本）、小型臺(tái)式離心機(jī)（Sigma，德國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1胚胎收集

繁殖前夜停止喂食，將斑馬魚按照雌雄比例3∶2放入孵化網(wǎng)箱內(nèi)，用隔板將雌魚和雄魚分開過夜。次日待光照刺激后，將隔板抽開，雄魚和雌魚開始追逐時(shí)，記錄產(chǎn)卵時(shí)間。收集6 h內(nèi)的受精卵，放入培養(yǎng)皿中，用養(yǎng)魚用水清洗兩遍，將殘餌以及未受精的、發(fā)白的死卵挑出，在顯微鏡下挑選發(fā)育健康的胚胎，放在培養(yǎng)皿中備用。

1.2.2 暴露試驗(yàn)

前期試驗(yàn)表明，96 h時(shí)滅多威對(duì)體長(zhǎng)（3.12±0.22）cm、體質(zhì)量（0.31±0.03）g的斑馬魚的LC為2.119 mg·L，因此，本研究將滅多威濃度分別設(shè)置為0（對(duì)照）、2、20、200μg·L，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行。將健康的胚胎隨機(jī)放入裝有滅多威溶液的6孔板中，每孔加入5 mL滅多威溶液和30枚胚胎。將6孔板放入28℃的光照培養(yǎng)箱中，光暗比為14 h∶10 h，連續(xù)暴露96 h。暴露期間每隔24 h更換一半的滅多威溶液，期間吸去死卵。分別在24、48 h時(shí)隨機(jī)取出25枚胚胎，在72、96 h時(shí)隨機(jī)取出25條仔魚放入1.5 mL的離心管中，液氮速凍后放入-80℃冰箱備用。

1.2.3 MDA及抗氧化參數(shù)測(cè)定

按照質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶19的比例向樣品中加入0.75%的生理鹽水，用電動(dòng)研磨器充分研磨后，放入冷凍離心機(jī)（2 500 r·min、4℃）離心10 min，離心后取上清液（5%組織勻漿液），放入1.5 mL離心管中待測(cè)。

TP采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定，MDA含量采用TBA法進(jìn)行測(cè)定。SOD、CAT、GR、GSH、GSSG活性按照試劑盒步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與整理，使用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，多個(gè)樣本平均數(shù)采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以Duncan法進(jìn)行組間兩兩比較，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用GraphPad Prism 8.0.1做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚胚胎發(fā)育及形態(tài)變化

在試驗(yàn)暴露期間，滅多威濃度組斑馬魚胚胎均出現(xiàn)發(fā)育畸形，且畸形率呈現(xiàn)隨滅多威濃度升高而增大的趨勢(shì)，主要表現(xiàn)為心包水腫、體軸彎曲、尾部發(fā)育畸形等（圖1）。96 h時(shí)，測(cè)得0、2、20、200μg·L濃度組斑馬魚體長(zhǎng)分別為（4.04±0.24）、（3.89±0.17）、（3.85±0.19）、（3.83±0.15）cm，2、20、200μg·L濃度組斑馬魚體長(zhǎng)小于對(duì)照組斑馬魚體長(zhǎng)，且斑馬魚個(gè)體體長(zhǎng)呈現(xiàn)隨滅多威濃度升高而縮短的趨勢(shì)。斑馬魚胚胎在24 h時(shí)死亡數(shù)最多，斑馬魚累計(jì)死亡率呈現(xiàn)隨滅多威濃度升高而升高的趨勢(shì)（表1）。

圖1 滅多威暴露下引起的斑馬魚畸形（×100倍）Figure 1 Zebrafish deformities caused by methomyl exposure（×100 times）

表1 不同濃度滅多威對(duì)斑馬魚胚胎累計(jì)死亡率的影響Table 1 Effects of different concentrations of methomyl on cumulative mortality of zebrafish embryo

2.2 滅多威對(duì)抗氧化參數(shù)變化的影響

滅多威對(duì)SOD活性的影響如圖2所示。整個(gè)試驗(yàn)暴露期間，3個(gè)濃度組SOD活性呈現(xiàn)先降低后升高再降低的變化趨勢(shì)。具體分析，SOD活性在24、72 h時(shí)被誘導(dǎo)，2、20、200μg·L濃度組與對(duì)照組相比具顯著差異（＜0.05）。在72 h時(shí)，暴露于2μg·L滅多威濃度中的SOD活性達(dá)到最大，顯著高于對(duì)照組（＜0.05），為對(duì)照組的132.06%。在96 h時(shí)，處理組SOD活性呈下降趨勢(shì)，其中200μg·L濃度暴露下SOD活性值最低，為對(duì)照組的63.10%。

圖2 滅多威對(duì)SOD活性的影響Figure 2 The effect of methomyl on SODactivity

滅多威對(duì)CAT活性的影響如圖3所示。整個(gè)試驗(yàn)暴露期間，與對(duì)照組相比，3個(gè)濃度組CAT活性均高于對(duì)照組，2μg·L濃度組CAT活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，20、200μg·L濃度組CAT活性與對(duì)照組相比具顯著性差異（＜0.05），且呈現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制減弱效應(yīng)。具體分析，整個(gè)試驗(yàn)期間，20、200μg·L滅多威濃度暴露下CAT活性顯著高于對(duì)照組（＜0.05）；20μg·L滅多威暴露下CAT活性值在72 h時(shí)達(dá)到最大，為對(duì)照組的180.84%；200μg·L滅多威暴露下其CAT活性值在48 h時(shí)達(dá)到最大，為對(duì)照組的296.48%。

圖3 滅多威對(duì)CAT活性的影響Figure 3 The effect of methomyl on CATactivity

滅多威對(duì)GR活性的影響如圖4所示。在整個(gè)試驗(yàn)暴露期，除20μg·L濃度組外，GR活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，20μg·L濃度組GR活性呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢(shì)。具體分析，2μg·L濃度條件下，滅多威對(duì)GR活性產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，且在48 h時(shí)，GR活性顯著升高（＜0.05）達(dá)到最大值，為對(duì)照組的139.44%。在24、72 h時(shí)，20μg·L滅多威濃度暴露下，GR活性顯著升高（＜0.05），而在48、96 h時(shí)低于對(duì)照組。在24、48、72 h時(shí)，200μg·L滅多威濃度暴露下GR活性顯著高于對(duì)照組（＜0.05），且在48 h時(shí)活性達(dá)到最高值，為對(duì)照組的147.74%。

圖4 滅多威對(duì)GR活性的影響Figure 4 The effect of methomyl on GRactivity

滅多威對(duì)GSH活性的影響如圖5所示。整個(gè)試驗(yàn)暴露期間，2、20、200μg·L濃度組GSH活性呈先升高后降低的趨勢(shì)；20、200μg·L濃度組GSH活性低于對(duì)照組，且在48～96 h時(shí)呈現(xiàn)隨滅多威濃度升高而降低的趨勢(shì)。具體分析，在48 h和72 h時(shí)，2μg·L暴露組的GSH活性高于對(duì)照組，但與對(duì)照組相比無顯著性差異（＞0.05）。試驗(yàn)期間，20、200μg·L滅多威濃度暴露下，GSH活性顯著低于對(duì)照組（＜0.05）。200μg·L滅多威濃度暴露下，GSH活性在96 h時(shí)達(dá)到最低值，為對(duì)照組的57.86%。

圖5 滅多威對(duì)GSH活性的影響Figure 5 The effect of methomyl on GSH activity

滅多威對(duì)GSSG活性的影響如圖6所示。整個(gè)試驗(yàn)暴露期間，2、20μg·L濃度下，GSSG活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，200μg·L濃度組GSSG活性呈上升趨勢(shì)。具體分析，在72 h時(shí)，2μg·L暴露條件下滅多威對(duì)GSSG活性具顯著影響（＜0.05）。在48 h時(shí)，20μg·L濃度條件下GSSG活性顯著高于對(duì)照組（＜0.05），并且此時(shí)GSSG活性達(dá)到最大值，為對(duì)照組的207.12%。整個(gè)試驗(yàn)期間，200μg·L滅多威暴露條件下，GSSG活性高于對(duì)照組，并且在24、72、96 h時(shí)達(dá)到顯著水平（＜0.05）。

圖6 滅多威對(duì)GSSG活性的影響Figure 6 The effect of methomyl on GSSGactivity

2.3 滅多威對(duì)MDA含量影響

滅多威對(duì)MDA含量的影響如圖7所示。整個(gè)試驗(yàn)暴露期間，2、20、200μg·L濃度組MDA含量高于對(duì)照組，呈先增加后減少再增加的趨勢(shì)。具體分析，在24 h時(shí)，20、200μg·L與對(duì)照組相比差異顯著（＜0.05）。48、72、96 h時(shí)，2、20、200μg·L濃度組與對(duì)照組相比存在顯著性差異（＜0.05）。其中在96 h時(shí)，2μg·L與20μg·L濃度下的MDA含量在整個(gè)暴露期間達(dá)到最大值，分別為對(duì)照組的297.78%和378.43%。

圖7 滅多威對(duì)MDA含量的影響Figure 7 The effect of methomyl on MDA content

3 討論

生物體內(nèi)存在氧化與抗氧化調(diào)節(jié)機(jī)制，受到農(nóng)藥等外源污染物刺激時(shí)，抗氧化防御因子水平會(huì)發(fā)生變化，使生物體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。生物體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)在一定程度上能夠減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)受損的生物大分子具一定的修復(fù)作用。有研究表明，抗氧化防御因子的重要特性之一是在氧化應(yīng)激狀態(tài)下其活性或含量能夠發(fā)生變化，能間接反映出外源污染物的存在。因此，可以通過測(cè)定抗氧化防御因子的活性來評(píng)判外源污染物對(duì)生物體的氧化損傷程度。

3.1 滅多威對(duì)抗氧化參數(shù)變化的影響

SOD是一種關(guān)鍵的抗氧化酶，它與CAT共同筑起了清除體內(nèi)活性氧的第一道防線。SOD通過歧化反應(yīng)將超氧化物轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫，過氧化氫可以被CAT分解清除，生成水和氧氣，從而避免氧自由基對(duì)細(xì)胞的氧化損傷。研究報(bào)道，采用0.05、0.50、1.20μL·L的三唑磷農(nóng)藥對(duì)斑馬魚染毒4周后，斑馬魚SOD活性整體呈現(xiàn)先被誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì)，這與本試驗(yàn)的變化趨勢(shì)是一致的。本試驗(yàn)中，SOD活性在24 h時(shí)被誘導(dǎo)，推測(cè)是在受到滅多威刺激后魚體迅速啟動(dòng)防御機(jī)制，產(chǎn)生大量SOD保護(hù)細(xì)胞免受自由基造成的損傷。滅多威經(jīng)過一定時(shí)間的積累會(huì)對(duì)斑馬魚正常生長(zhǎng)發(fā)育造成影響，濃度越高，對(duì)魚體損害越大。同時(shí)斑馬魚體內(nèi)的活性氧自由基隨時(shí)間的延長(zhǎng)在不斷積累，使SOD處于激發(fā)狀態(tài)，故在72 h時(shí)SOD活性升高且2μg·L濃度組SOD活性值最大。RUDNEVA在研究過程中發(fā)現(xiàn)，在卵子發(fā)生與胚胎發(fā)育的過程中，杜父魚（和）和鲇魚（）在胚胎發(fā)育至Ⅴ期時(shí)，其SOD活性會(huì)有所下降。斑馬魚胚胎是一個(gè)“封閉系統(tǒng)”，發(fā)育早期只能通過絨毛膜上的孔洞獲取氧氣才能滿足斑馬魚胚胎的正常生長(zhǎng)發(fā)育，且胚胎所需耗氧量要比在卵子發(fā)生時(shí)期大得多，故在本試驗(yàn)中，48 h時(shí)SOD活性有所降低。研究表明，在20.39μg·L的滅多威作用下，尼羅羅非魚（）幼魚SOD活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低；PETERS等的研究表明，大菱鲆（）從胚胎到孵化后第11 d其SOD活性逐漸下降，攝氧量升高3倍左右，上述研究變化趨勢(shì)與本文結(jié)果相似。在本試驗(yàn)中，暴露96 h后，2、20、200μg·L濃度組SOD活性低于對(duì)照組，且SOD活性與斑馬魚累計(jì)死亡率呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），表明SOD活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)被持續(xù)激活，長(zhǎng)時(shí)間作用會(huì)引起代償失調(diào)損傷機(jī)體，斑馬魚體內(nèi)的酶系統(tǒng)因此遭到破壞，導(dǎo)致SOD活性降低。在96 h時(shí)200μg·L濃度組SOD活性值最低，可能有以下兩種原因：一是高濃度滅多威長(zhǎng)時(shí)間積累，魚體不能及時(shí)代謝，達(dá)到幼魚機(jī)體閾值，導(dǎo)致其抗氧化防御系統(tǒng)受損；二是滅多威與SOD結(jié)合導(dǎo)致SOD失活，最終活性降低，且96 h時(shí)，3個(gè)濃度組中200μg·L濃度組斑馬魚累計(jì)死亡率為最高。

CAT是一種內(nèi)源性氧清除劑，具有強(qiáng)烈的抗氧化特性，對(duì)生物機(jī)體內(nèi)羥自由基與超陰離子有很好的抑制效果，也可以抑制MDA的生成，降低生物機(jī)體內(nèi)MDA含量。研究表明，暴露于0.1、0.5、1 mg·L的氟苯蟲酰胺中，斑馬魚肝臟CAT活性被誘導(dǎo)；劉存歧等指出，大菱鲆體內(nèi)CAT活性在卵子發(fā)生和細(xì)胞發(fā)育時(shí)會(huì)有所升高，這與本試驗(yàn)中在24、48 h時(shí)，CAT活性升高且高于對(duì)照組的趨勢(shì)一致。MENG等的研究表明，暴露時(shí)間為0～30 d、滅多威暴露濃度高于0.2μg·L條件下，羅非魚肝臟CAT活性被誘導(dǎo)，在前12 d時(shí)，表現(xiàn)為濃度越高，CAT活性越高，這與本文研究結(jié)果相似。本試驗(yàn)中，在24、48、96 h時(shí)，CAT活性被誘導(dǎo)，且200μg·L濃度組在48 h時(shí)CAT活性值最高；而72 h時(shí)，200μg·L濃度組CAT活性低于20 μg·L濃度組，可能是高濃度滅多威暴露下斑馬魚體內(nèi)酶系統(tǒng)受到一定損傷，CAT部分失活導(dǎo)致的。暴露至96 h時(shí)，CAT活性與斑馬魚累計(jì)死亡率呈顯著正相關(guān)（＜0.05），2、20、200μg·L濃度組CAT活性被誘導(dǎo)。此時(shí)CAT活性呈現(xiàn)隨滅多威濃度升高而升高的趨勢(shì)，但隨著暴露時(shí)間增加誘導(dǎo)效應(yīng)減弱。王鈺欽等的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)滅多威處理42 d后，吉富羅非魚肝臟CAT活性降低；李方敏等在研究0.05μg·L的三唑磷對(duì)斑馬魚肝臟CAT活性影響時(shí)，也觀察到相似的變化趨勢(shì)，本文與以上研究結(jié)果相似。CAT活性出現(xiàn)下降趨勢(shì)可能是由于隨著滅多威暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，魚體內(nèi)活性氧的調(diào)節(jié)作用使得CAT活性被抑制。

GSSG與GSH可以相互轉(zhuǎn)化，而GR可以在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）支持下將GSSG還原成為GSH。FELIX等的研究表明，0.2、0.4、0.8 mg·mL氯胺酮處理斑馬魚胚胎，在原腸期（受精后5.5 h）暴露至受精后8 h，GSSG活性升高；西維因和甲基對(duì)硫磷的混合物暴露下，鯽魚腦、肝、鰓、肌肉內(nèi)GSSG活性顯著升高，這與本文試驗(yàn)結(jié)果相似。本試驗(yàn)中，24、48 h時(shí)3個(gè)濃度組GSSG活性升高，2、200 μg·L暴露下，GR活性顯著升高（＜0.05）。暴露至72 h時(shí)，2μg·L濃度組GSSG活性顯著升高至最大值，說明低濃度滅多威對(duì)魚體內(nèi)GSSG產(chǎn)生適應(yīng)性誘導(dǎo)反應(yīng)，導(dǎo)致出現(xiàn)上升趨勢(shì)。此時(shí)20、200μg·L濃度組中GSSG活性呈現(xiàn)隨滅多威濃度升高而升高的趨勢(shì)，GR活性呈現(xiàn)隨滅多威濃度升高而降低的趨勢(shì)，說明高濃度滅多威暴露對(duì)斑馬魚產(chǎn)生了強(qiáng)氧化脅迫，從而使GR活性代償性增加，以清除體內(nèi)因氧化脅迫而產(chǎn)生的過量氧自由基。48 h時(shí)，暴露于20μg·L濃度組中的GSSG活性顯著升高，GR活性被抑制，其可能是為了維持谷胱甘肽解毒系統(tǒng)的穩(wěn)定。在暴露至96 h時(shí)，2μg·L濃度組中GSSG活性降低，GR活性升高，可能是由于長(zhǎng)時(shí)間、低濃度滅多威暴露下對(duì)斑馬魚幼魚產(chǎn)生了中毒反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致GSSG活性降低，而GR活性隨著適應(yīng)性誘導(dǎo)反應(yīng)有所升高。WU等研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚胚胎暴露于雙酚A（BPA）中168 h后，斑馬魚胚胎GR活性被抑制，這與本文結(jié)果相似。本試驗(yàn)中20、200μg·L處理組在暴露96 h后，GR活性低于對(duì)照組，呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。20μg·L滅多威暴露下，GSSG活性有所降低但高于對(duì)照組，GR活性下降較明顯。同一時(shí)間下，GSH活性也明顯降低，其原因可能是GR通過催化GSH降低體內(nèi)氧自由基的含量，從而減少氧化應(yīng)激帶來的損傷。研究表明，GR活性降低，谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性增強(qiáng)，可催化GSH反應(yīng)生成GSSG，清除機(jī)體內(nèi)的過氧化物及脂質(zhì)過氧化物，從而達(dá)到保護(hù)機(jī)體的目的，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，即暴露在200μg·L滅多威溶液下，GSSG含量升高，GR含量降低。

GSH與GSSG是一類非常重要的非酶促自由基清除劑，對(duì)增強(qiáng)魚類抗氧化應(yīng)激能力以及解毒能力發(fā)揮著舉足輕重的作用。GSH既可以作為一種獨(dú)立的抗氧化劑，也可以在谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）催化下，與毒物結(jié)合生成可溶性無害物質(zhì)，參與機(jī)體的解毒作用。研究發(fā)現(xiàn)，暴露在BPA中的斑馬魚仔魚體內(nèi)GSH活性受到抑制；暴露于三氯生中的斑馬魚肝臟GSH活性與對(duì)照組相比受到抑制，上述試驗(yàn)結(jié)果與本研究類似。本試驗(yàn)中，20、200μg·L滅多威暴露下，GSH活性被抑制，顯著低于對(duì)照組（＜0.05），推測(cè)高濃度滅多威暴露下，GSH氧化還原狀態(tài)被破壞，抗氧化防御系統(tǒng)受損。在48、72 h時(shí)，暴露于2μg·L滅多威中的GSH活性呈升高趨勢(shì)。王鈺欽等在研究2μg·L滅多威對(duì)吉富羅非魚肝臟14 d GSH活性影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢(shì)，這可能是長(zhǎng)時(shí)間滅多威刺激下，GSH活性被大量激發(fā)所致。發(fā)育至96 h后，2、20、200μg·L濃度組GSH活性低于對(duì)照組，呈現(xiàn)隨滅多威濃度升高而降低的趨勢(shì)，并且與累計(jì)死亡率呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）。王世豪等將斑馬魚暴露于50μg·L的鹽酸四環(huán)素溶液中2周，觀察到了與本研究類似的結(jié)果。這說明隨著濃度的升高、暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，在強(qiáng)氧化脅迫下斑馬魚體內(nèi)GSH合成機(jī)制或適應(yīng)性機(jī)能遭到破壞，且濃度越高破壞越嚴(yán)重，造成發(fā)育毒性作用，表現(xiàn)為低孵化率、高畸形率、高累計(jì)死亡率。

3.2 滅多威對(duì)MDA含量影響

脂質(zhì)過氧化物含量是反映氧化損傷發(fā)生程度的重要指標(biāo)。MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其含量可以反映出生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平的高低。熊道文等的研究表明膜系統(tǒng)遭受損害與MDA有關(guān)。MDA能降低細(xì)胞膜的通透性與流動(dòng)性，與魚體內(nèi)蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合，改變自身結(jié)構(gòu)，從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生影響。研究表明，隨著氧化應(yīng)激水平升高，MDA含量有所上升。段志文等以3、15、30 mg·kg劑量的呋喃丹對(duì)大鼠經(jīng)口染毒7 d后，大鼠睪丸組織勻漿中MDA含量增加；宋玥頤的研究表明，斑馬魚暴露在0.1、0.5、1 mg·L的氟苯蟲酰胺14 d后，斑馬魚肝臟中MDA含量顯著增加，這與本研究結(jié)果相似。本文研究表明，滅多威處理組MDA含量高于對(duì)照組，在48、72、96 h時(shí)，2、20μg·L濃度組MDA含量顯著高于對(duì)照組，MDA含量呈現(xiàn)隨滅多威濃度升高而增加的趨勢(shì)，且在96 h時(shí)2、20、200μg·L濃度組的MDA含量均達(dá)到最大值。這說明隨時(shí)間的延長(zhǎng)滅多威在魚體內(nèi)不斷積累，大量脂質(zhì)過氧化反應(yīng)發(fā)生，機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)被破壞，對(duì)膜系統(tǒng)造成損傷作用。96 h時(shí)，2、20、200μg·L濃度組中，200μg·L濃度組MDA含量最低，推測(cè)高濃度滅多威對(duì)斑馬魚造成了更為嚴(yán)重的毒性作用，部分MDA與斑馬魚體內(nèi)生物大分子結(jié)合并使其功能結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響斑馬魚正常發(fā)育。這與斑馬魚累計(jì)死亡率相印證，即滅多威濃度越高，斑馬魚累計(jì)死亡率越高。

4 結(jié)論

（1）在2、20、200μg·L滅多威濃度暴露下丙二醛含量顯著增加（＜0.05），脂質(zhì)過氧化水平升高，擾亂了斑馬魚胚胎抗氧化防御系統(tǒng)的正常功能。

（2）經(jīng)滅多威暴露后斑馬魚胚胎內(nèi)超氧化物歧化酶、氧化型谷胱甘肽活性變動(dòng)不穩(wěn)定，過氧化氫酶活性先被誘導(dǎo)后抑制減弱，谷胱甘肽還原酶活性總體表現(xiàn)為誘導(dǎo)狀態(tài)，還原型谷胱甘肽活性整體被抑制。

（3）抗氧化防御因子活性的變化破壞了斑馬魚胚胎自身氧化防御系統(tǒng)的平衡，造成氧化應(yīng)激及功能異常，對(duì)斑馬魚胚胎抗氧化防御系統(tǒng)具有氧化損傷效應(yīng)。