納米氧化物對美托洛爾生物富集的影響研究

盧媛，宋琪，許佳瑤，孫紅文*

（1.南開大學環(huán)境科學與工程學院，環(huán)境污染過程與基準教育部重點實驗室，天津 300350；2.大連理工大學外國語學院盤錦分院，遼寧 盤錦 124221；3.沈陽大學環(huán)境學院，沈陽 110044）

納米顆粒（Nanoparticles，NPs）由于其特殊的理化性質(zhì)而被廣泛應用于醫(yī)藥、制造、催化、傳感器等領域，目前NPs全球年產(chǎn)量已接近100萬t。NPs在生產(chǎn)、運輸、使用及廢棄過程中不可避免地進入水環(huán)境，且由于很多納米材料具備良好的吸附性能和穿過細胞膜的運輸能力，從而給水生生物帶來了潛在的風險。因此，NPs對污染物環(huán)境行為，尤其是對污染物生物可利用性及生物富集的影響，非常值得關注。

無機納米氧化物作為廣泛應用的納米材料，由于其表面的親水性質(zhì)，而能與重金屬離子發(fā)生較強的相互作用。此外，納米氧化物自身可能會釋放金屬離子產(chǎn)生直接毒性效應，或與環(huán)境中的金屬離子發(fā)生競爭，因而，與納米氧化物對重金屬離子環(huán)境行為和生物富集影響相關的研究較多。一般認為無機納米氧化物對傳統(tǒng)疏水性有機污染物的吸附能力較弱，但近年來的相關報道表明，納米氧化物與有機污染物，尤其是與帶有極性官能團的離子型有機物共暴露時，其對污染物生物可利用性的影響不容忽視。納米氧化物能被水生生物攝入并在體內(nèi)富集，GAO等研究了6種納米氧化物在斑馬魚體內(nèi)的富集情況，發(fā)現(xiàn)生物濃縮因子的對數(shù)值（lg）在1.5～3.0之間，納米顆粒的攝入和排出速率主要與其粒徑和表面電位相關。有機污染物在生物體內(nèi)的富集主要受自身化學性質(zhì)影響，值與污染物辛醇-水分配系數(shù)（）呈正相關，與傳統(tǒng)疏水性有機污染物相比，離子型有機物在生物體內(nèi)的富集風險相對較低。但納米氧化物與離子型有機物能通過靜電吸附或配體交換發(fā)生更強的相互作用，進而影響污染物的環(huán)境行為。FANG等研究發(fā)現(xiàn)納米二氧化鈦（TiONPs）通過載帶作用增加了雙酚A的生物可利用性。全氟辛烷磺酸類物質(zhì)與納米氧化鋅（ZnONPs）復合暴露時，也表現(xiàn)出更強的毒性。近年來，新污染物逐漸進入科學家研究視野，而藥物是其中一類重要物質(zhì)。-腎上腺素拮抗劑（-阻斷劑）是一類重要的藥物，主要用于治療心律不齊、高血壓和心絞痛。由于人體利用率低，-阻斷劑大部分被排出體外，同時傳統(tǒng)的污水處理系統(tǒng)不能將其完全清除，因此在醫(yī)療廢水、污水處理廠進出水和地表水中-阻斷劑都有檢出。低濃度的-阻斷劑也會對藻類、無脊椎動物和魚類等水生生物產(chǎn)生有害的影響。作為一種可電離的弱堿性化合物，-阻斷劑在中性條件下帶正電荷，因此能與無機納米氧化物發(fā)生強烈的相互作用，其環(huán)境行為與傳統(tǒng)的憎水性有機污染物差別很大。然而，目前對于納米氧化物對-阻斷劑在生物體內(nèi)富集、凈化和分布的影響研究還鮮有報道。

本研究選取目前被廣泛應用的TiONPs和SiONPs作為納米氧化物顆粒的代表，以典型的-阻斷劑美托洛爾作為目標污染物，研究了納米氧化物對錦鯉富集美托洛爾的影響，并考察了美托洛爾在魚體內(nèi)各部位的分布情況，以期為全面評價納米氧化物對β-阻斷劑生物有效性的影響提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

美托洛爾（Metoprolol tartrate salt，純度≥98%）購自美國Sigma公司。甲醇和乙腈為色譜純，購自天津市康科德科技有限公司，其他試劑均為分析純。TiONPs和SiONPs購自浙江弘晟材料科技公司。由于孔狀SiONPs表面由硅烷偶聯(lián)劑KH570修飾，故使用前在600℃下灼燒5 h以去除其表面的硅烷偶聯(lián)劑。

本實驗采用的錦鯉（）購自市場，為當年生魚種，平均體質(zhì)量（4.2±0.5）g，平均體長（5.3±0.9）cm，實驗前在水族箱中馴養(yǎng)2周以上。實驗用水為曝氣24 h以上的自來水，pH為6.5～7.5。

1.2 納米氧化物的結構性質(zhì)表征

納米氧化物比表面積和孔體積使用AutoSorb-1-MP吸附儀測定（Quantachrome，美國）。在77 K下，由N的吸附-脫附法測定，樣品分析前在105℃下真空脫氣15 h以去除可能阻塞孔結構的雜質(zhì)。

透射電鏡圖像（TEM）使用Tecnai G20 S-Twin觀測（飛利浦，荷蘭）。取10 mg·LNPs懸濁液滴加到銅網(wǎng)上，觀察NPs的形貌。為觀察NPs在水中的實際存在狀態(tài)，NPs懸濁液未經(jīng)超聲處理，未添加分散劑。

Zeta電位和NPs粒徑使用ZETAPALS/BI-200SM型Zeta電位與廣角激光散射儀（BROOKHAVEN，美國）測得。

1.3 生物富集與凈化

在兩個盛有45 L曝氣自來水的魚缸中分別加入450 mg SiONPs和TiONPs，然后分別加入美托洛爾儲備液，使魚缸中美托洛爾濃度為500μg·L，平衡1 d后各投入50條鯉魚。為了保證魚呼吸所需要的空氣并保持NPs的懸浮狀態(tài)，魚缸內(nèi)晝夜微弱曝氣，每日換水1次，每次換水重新染毒，每日換水前1 h喂食，實驗期間水溫保持在27℃左右，自然光照。第2、5、10、17、25、30 d時各取3條魚，測定其體內(nèi)美托洛爾的濃度。為分析美托洛爾在魚體內(nèi)的分布情況，于第25 d時另取5條魚，經(jīng)多次沖洗后，擦干表面、解剖，將皮鱗、肌肉、鰓、內(nèi)臟分開，測定各部位美托洛爾的濃度。同時進行對照實驗，對照組不加NPs，其他條件與實驗組相同。

富集實驗之后，利用每個魚缸中剩余的魚進行凈化實驗。實驗組和對照組均每日換干凈的水，其他條件與富集實驗相同。第32、37、45、55、60 d時各取3條魚，測定其體內(nèi)美托洛爾的濃度。

1.4 魚樣的處理

魚樣處理參考VALESKA等報道的方法：鯉魚取樣后冷凍干燥，粉碎，然后稱取100 mg粉碎樣加入到15 mL PP管中，加入1 mL 0.1%的甲酸，30μL 1 mol·LHCl，使樣品的pH＜2；向樣品中加入2 mL乙醚，振蕩混合5 min，4 000 r·min轉速下離心10 min；棄去有機相，向樣品中加入100μL 1 mol·LNaOH，使樣品的pH＞12；為了促進目標物的析出，加入5 mg NaCl，然后加入3 mL乙酸乙酯，振蕩混合10 min，在4 000 r·min轉速下離心10 min，取出有機相，保留；重復萃取步驟，合并萃取液，氮吹至近干，最后用0.1%的甲酸定容至2 mL。回收率實驗結果表明本方法回收率大于81.2%。

1.5 納米氧化物對美托洛爾的吸附與解吸

稱取100 mg TiONPs和100 mg SiONPs分別置于22 mL EPA樣品瓶中，再加入20 mL背景溶液（200 mg·LNaN水溶液），然后分別加入一定量的美托洛爾儲備液，迅速用帶聚四氟乙烯隔墊的蓋子旋緊，使美托洛爾在水中的平衡濃度為20～800μg·L。保持體系中甲醇含量少于0.1%，以避免共溶劑效應。在（20±1）℃下避光恒溫振蕩5 d（前期動力學實驗表明，美托洛爾在4 d內(nèi)即可達到表觀吸附平衡）。平衡后在4 000 r·min轉速下離心20 min，分離上清液，測定上清液中美托洛爾的濃度，每組實驗設2個平行。解吸實驗在500μg·L吸附實驗的基礎上進行，吸附平衡后，離心棄去上清液，然后在樣品瓶中分別加入20 mL的模擬魚體消化液[0.12 mol·LNaCl、0.02 mol·LNaCO、200 mg·LNaN、5 g·L膽鹽（膽酸鈉∶脫氧膽酸鈉=1∶1）、1 mg·LDTAC，pH 7.5]或200 mg·L的NaN溶液，避光恒溫振蕩5 d，在4 000 r·min轉速下離心20 min，分離上清液，測定上清液中美托洛爾的濃度。空白實驗表明，由于瓶壁吸附和揮發(fā)造成美托洛爾的損失量小于0.5%，可忽略不計，因此可根據(jù)質(zhì)量平衡計算吸附劑吸附美托洛爾的量。

1.6 美托洛爾檢測方法

采用高效液相色譜儀（Agilent 1200，美國），C18色譜柱（Symmetry shield C18，5μm，3.9 mm×150 mm，Waters，美國）測定液相中美托洛爾的濃度。流動相為pH 4.5的醋酸緩沖液和乙腈，體積比80∶20，流速0.6 mL·min，進樣量100μL，檢測器為熒光檢測器，激發(fā)和發(fā)射波長分別為230 nm和316 nm。

1.7 模型擬合

富集階段的一級動力學方程：

凈化階段的一級衰減方程：

凈化階段的半衰期：

生物對污染物累積的程度用生物濃縮因子（，L·kg）表示：

式中：C為時刻魚體內(nèi)目標物的濃度，μg·g；為平衡時魚體內(nèi)目標物的濃度，μg·g；為富集速率常數(shù)，d；為暴露時間，d；為凈化初始時魚體內(nèi)目標物的濃度，μg·g；為凈化速率常數(shù)，d；C為污染物在水中的濃度，μg·L。

本研究使用Origin 2016軟件進行曲線擬合，SPSS17.0進行統(tǒng)計分析。

2 結果與討論

2.1 納米氧化物對美托洛爾在魚體內(nèi)富集及凈化的影響

鯉魚對美托洛爾的富集曲線如圖1所示，使用式（1）對富集過程的數(shù)據(jù)進行擬合，相關擬合參數(shù)列于表1，相關系數(shù)均在0.96以上，擬合度較好。從圖1（a）可以看出，在美托洛爾單獨暴露的情況下，最初的10 d內(nèi)，魚體內(nèi)的美托洛爾濃度迅速增加，然后增速趨于平緩，富集進入穩(wěn)態(tài)。30 d時，魚體內(nèi)的美托洛爾達到1.52μg·g，為2.95 L·kg，使用脂肪含量（測得魚體脂肪含量為1.16%）標化后的為254 L·kg。

圖1 鯉魚對美托洛爾富集攝取階段的一級動力學方程擬合（a）和凈化階段的一級衰減方程擬合（b）Figure 1 First-order uptake phase of accumulation（a）and First-order depuration phase of metoprolol（b）

表1 鯉魚對美托洛爾富集攝取階段的一級動力學方程擬合參數(shù)Table 1 First-order uptake phase of accumulation parametersof metoprolol

當高于5 000 L·kg時，認為該污染物具有生物富集效應，在2 000～5 000 L·kg時，則污染物具有潛在的生物富集效應。美托洛爾（相對分子質(zhì)量為267.4 g·mol，lg為1.88）的遠小于分子量相近的傳統(tǒng)疏水性有機污染物苯并（a）芘（相對分子質(zhì)量為252.3 g·mol，lg為6.50，約為10L·kg），這主要是因為美托洛爾的lg較低，其具有更加親水的分子結構。此外，美托洛爾在生物體內(nèi)的半衰期約為1～5 h，能夠較快地通過肝臟代謝為O-去甲基美托洛爾和美托洛爾酸等物質(zhì)。

NPs增強了魚體對美托洛爾的富集程度，SiONPs和TiONPs使魚體內(nèi)富集的一級動力學方程擬合值從1.48μg·g分別增加到5.17μg·g和3.52 μg·g。值與富集實驗平衡后測得的魚體內(nèi)美托洛爾的實測值*非常吻合，相對偏差分別為4.14%和4.55%。魚體內(nèi)的美托洛爾濃度分別在第25 d和第17 d達到平衡，從0.247 d分別縮短到0.103 d和0.086 d，說明NPs的存在促進了美托洛爾在魚體內(nèi)的富集，增加了美托洛爾的生物可利用性，但是降低了魚體對美托洛爾的富集速率。本實驗室前期在TiONPs對Cd在魚體內(nèi)富集影響的相關研究中也得到了類似的結果，TiONPs雖然促進Cd在魚體內(nèi)的富集，但卻降低了Cd富集的速率常數(shù)。

圖1（b）為一級衰減方程對凈化階段的擬合結果（＞0.774），和值、基于平衡濃度的以及見表2。由30 d后的凈化曲線可以看出，在凈化的初始階段（凈化的前7 d），美托洛爾從魚體中去除較快，而后下降幅度減慢，在凈化階段的第30 d時，魚體內(nèi)的美托洛爾濃度降低到0.54μg·g，為1.08 L·kg。在攝取階段存在TiONPs和SiONPs的條件下，同樣在凈化的前7 d，美托洛爾從魚體中去除得較快，而后下降幅度減慢，在凈化的第30 d時，魚體內(nèi)的美托洛爾濃度分別降低到0.69μg·g和0.90μg·g，分別為1.38 L·kg和1.80 L·kg，比未添加NPs時顯著升高（＜0.05）。攝取階段TiONPs和SiONPs的存在，使美托洛爾在凈化階段的值從0.035 d分別提高到0.078 d和0.113 d，對美托洛爾富集濃度高的處理在凈化階段的去除速率也相對較高，最后穩(wěn)定階段殘留在魚體內(nèi)的濃度也較高（＜0.05）。美托洛爾在魚體內(nèi)凈化的為20.09 d，攝取階段存在TiONPs和SiONPs的條件下，分別縮短到8.39 d和6.13 d。

表2 鯉魚對美托洛爾凈化階段的一級衰減方程擬合參數(shù)Table 2 First-order decay curve parameters of metoprolol

2.2 魚體內(nèi)美托洛爾的分布

為了研究美托洛爾在魚體內(nèi)富集的途徑，在第25 d時取5條魚，將皮鱗、肉、鰓、內(nèi)臟分開，測定美托洛爾在各個部位的濃度，結果見圖2。無論是否有NPs存在，美托洛爾在魚體內(nèi)的富集順序均為內(nèi)臟＞鰓＞肌肉、皮和鱗，其中肌肉中的美托洛爾的濃度與皮和鱗中的濃度沒有顯著差異（＞0.05）。

圖2 美托洛爾在魚體各部位的濃度Figure 2 Concentration of metoprolol in various tissues of carp

PEDLAR等的研究表明，魚體對污染物的吸收主要包括進食攝取、皮膚體表吸收和呼吸器官鰓的吸收3種途徑。魚通過攝食作用使美托洛爾進入到內(nèi)臟中，再通過血液循環(huán)進入到魚體其他組織，內(nèi)臟中美托洛爾濃度最高，表明進食攝取是魚體吸收美托洛爾最重要的途徑。魚鰓直接與污染物接觸，是吸收污染物的重要器官之一，魚在呼吸過程中將污染物帶到魚鰓中，然后分配到肌肉中，因此魚鰓中美托洛爾的濃度高于肌肉。魚的皮和鱗直接與水相中的污染物接觸，主要是污染物在皮和鱗與水相之間的分配作用，該作用的強弱通常與污染物的lg相關，美托洛爾的lg相對較低，難以通過分配作用進入魚體，因此皮和鱗中美托洛爾的濃度較低。PEDERSEN等的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律，暴露10 d后，苯酚在鱒魚體內(nèi)各部位的濃度排序為肝和膽汁＞鰓＞肌肉。

攝食階段存在NPs時，美托洛爾在魚體各部位的濃度順序未發(fā)生變化，表明NPs并未改變鯉魚吸收污染物的途徑。與SiONPs共暴露時，鯉魚肌肉及皮和鱗中美托洛爾的濃度（＜0.05）增加，TiONPs存在時，鯉魚肌肉及皮和鱗中的美托洛爾濃度與僅暴露美托洛爾的情況相比，也略有增加，但是沒有顯著差異（＞0.05），而TiONPs和SiONPs的存在都顯著促進了美托洛爾在鰓和肝臟中的富集（＜0.05）。

2.3 納米氧化物對美托洛爾的吸附和解吸

為了進一步闡明NPs對美托洛爾在魚體內(nèi)富集的影響機制，通過批平衡實驗考察了兩種NPs對美托洛爾的吸附能力，以及在水和魚消化道模擬液中的解吸情況。

SiONPs和TiONPs對美托洛爾的吸附等溫線見圖3，使用Freundlich模型對吸附數(shù)據(jù)進行擬合，并計算了不同初始濃度下的值，吸附模型參數(shù)列于表3，相關系數(shù)在0.97以上，擬合度較好。SiONPs和TiONPs吸附美托洛爾的lg分別為4.47和2.11。

表3 納米氧化物對美托洛爾的吸附等溫線擬合參數(shù)Table 3 Freundlich parameters of metoprolol sorption on NPs

圖3 SiO2 NPs和TiO2 NPs對美托洛爾的吸附等溫線Figure 3 Sorption isotherms of metoprolol on SiO2 and TiO2

-阻斷劑美托洛爾是一種有機堿，p為9.7，在本研究實驗條件下（pH 7.5），99.4%的美托洛爾以陽離子形態(tài)存在，此時，測得SiONPs和TiONPs的Zeta電位分別為-33 mV和-14.5 mV，顆粒物表面帶有負電，靜電吸引成為影響吸附行為的重要機制，而帶有更多負電荷的SiONPs也表現(xiàn)出與美托洛爾更強的結合能力。兩種NPs的比表面積和孔體積見表4，使用比表面積標化后，SiONPs的吸附能力仍遠大于TiONPs。TiONPs不含微孔，而SiONPs具有豐富的微孔結構，在總孔體積和介孔體積相差較小的情況下，兩種NPs對美托洛爾的吸附能力表現(xiàn)出數(shù)量級的差異，表明微孔結構可能在吸附中發(fā)揮了重要作用。

解吸實驗表明，在水中SiONPs對美托洛爾不解吸，而TiONPs的解吸率為91.6%。消化液中由于膽鹽的分散和增溶效應，以及與污染物的絡合作用，使污染物表現(xiàn)出與水中不同的解吸行為。在消化液模擬液中，SiONPs和TiONPs對美托洛爾的解吸率分別為4.87%和95.35%，即與TiONPs結合的美托洛爾更易釋放到環(huán)境或消化道中，而SiONPs吸附態(tài)美托洛爾雖然可以在消化道中發(fā)生解吸，但大部分仍以吸附態(tài)存在。兩種NPs吸附態(tài)美托洛爾解吸行為的差異可能與吸附機制不同有關。吳艷華等在研究鄰苯二甲酸酯（PAEs）在黏土礦物上吸附解吸行為時發(fā)現(xiàn)，進入黏土中間層的PAEs難以解吸，因此推測進入微孔結構中的美托洛爾分子解吸也更加困難。SiONPs在水中的平均粒徑為844.9 nm，大于TiONPs，TEM圖像也顯示（圖4），SiONPs在水中會形成比TiONPs更大尺寸的團聚體，美托洛爾分子可能被夾裹進入團聚體中而增加了解吸的難度。

圖4 水溶液中TiO2 NPs和SiO2 NPs的TEM圖像（×1 000 000倍/×1 500 000倍）Figure 4 TEMimages of TiO2 NPs and SiO2 NPs in water（×1 000 000 times/×1 500 000 times）

2.4 納米氧化物吸附解吸對魚體富集凈化美托洛爾的影響機制

吸附和解吸是影響環(huán)境中有機污染物生物有效性的關鍵過程，而NPs對美托洛爾的吸附可能帶來兩方面的影響：一方面，NPs的吸附作用使溶解態(tài)的污染物濃度下降，從而導致污染物的生物有效性降低；另一方面，在NPs的載帶作用下，污染物在環(huán)境介質(zhì)中的遷移過程更加便利，能穿透生物膜進入到生物體中，從而增加生物有效性。

納米材料通過吸附作用可提高或降低污染物的生物可利用性。FU等在對斑馬魚幼體的研究中發(fā)現(xiàn)，TiONPs的存在會增強水體中共暴露有機污染物的生物可利用性和毒性；KIM等的研究則發(fā)現(xiàn)檸檬酸包覆的AgONPs減少了As和Cu在大型溞體內(nèi)的生物累積，但卻增加了Cd的生物累積。在本課題組的前期工作中，發(fā)現(xiàn)NPs可以在鯉魚體內(nèi)富集，在最初的10 d內(nèi)，NPs在魚體內(nèi)的濃度迅速增加，然后增速趨于平緩，平衡時的為595.7～675.5 L·kg。本研究中，NPs的存在促進了魚體對美托洛爾的富集，吸附能力更強的SiONPs也表現(xiàn)出比TiONPs更強的促進作用，這可能是由NPs的吸附載帶作用造成的。但是SiONPs對美托洛爾吸附容量遠大于TiONPs，相差約兩個數(shù)量級，而兩種NPs對魚體富集美托洛爾的促進程度分別為3.49倍和2.39倍，并未展現(xiàn)出數(shù)量級的差異。由于SiONPs在水中形成了更大尺寸的團聚體（表4），而較大的NPs團聚體難以被生物腸道上皮組織吸收，導致NPs載帶的美托洛爾不能完全被魚體利用。GAO等使用迭代數(shù)值積分法計算了斑馬魚體內(nèi)6種納米氧化物的毒代動力學參數(shù)，發(fā)現(xiàn)在凈化階段大部分納米氧化物都可在較短時間內(nèi)排出體外。本研究解吸實驗的結果表明，與NPs結合的美托洛爾并不能完全解吸，尤其與SiONPs結合的美托洛爾更難釋放，即使在魚的消化液模擬液中，大部分美托洛爾仍以吸附態(tài)存在，可能并未被魚體吸收而隨顆粒物排出體外。攝食階段有NPs存在時，凈化階段雖然最終殘余在魚體內(nèi)的美托洛爾更多，但凈化速率更快，半衰期更短，也說明了有部分NPs吸附態(tài)美托洛爾被直接排出了魚體外。

表4 納米氧化物的特征參數(shù)Table 4 Structural parameters of the nano-oxides

本課題組前期工作和多個研究都表明，攝食和鰓的呼吸作用是NPs進入魚體的主要途徑，且NPs可以穿透魚腸道上皮屏障，進入其他組織，因此腸道、肝臟和鰓成為魚體富集NPs最多的器官。本研究中攝食階段兩種NPs與美托洛爾共同暴露都顯著增加了魚鰓和內(nèi)臟中美托洛爾的濃度，與NPs在魚體內(nèi)的富集器官一致，進一步證明NPs可以通過吸附載帶增強美托洛爾的生物富集。雖然肌肉及皮和鱗不是NPs在魚體中富集的主要部位，但吸附能力更強的SiONPs也提高了這些部位中的美托洛爾濃度，因此，對于能對污染物產(chǎn)生強烈吸附作用的NPs，我們需要進行更加全面的生態(tài)風險評估。

3 結論

（1）NPs對水體中美托洛爾有明顯的吸附作用，可載帶美托洛爾進入鯉魚體內(nèi)，促進其生物富集，吸附能力更強的SiONPs對美托洛爾在魚體內(nèi)富集的促進作用強于TiONPs。

（2）攝食階段存在NPs時，凈化階段美托洛爾在魚體內(nèi)的半衰期更短，但最后穩(wěn)定階段，美托洛爾在魚體內(nèi)殘留的濃度略高。

（3）SiONPs對美托洛爾存在較強的、不可逆的吸附；而TiONPs對美托洛爾存在相對較弱的、可逆的吸附。

（4）魚體主要通過攝食和鰓的呼吸作用富集美托洛爾，NPs也主要通過這兩條途徑促進魚體對污染物的富集。