TRPV4通道抑制劑對創(chuàng)傷性腦損傷后血腦屏障破壞的保護作用

孔繁皓，張鴻洋，張蔚，趙一諾，丁曉慧，楊智航，蘇秋香，解輝*

（1.沈陽醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院2018級臨床醫(yī)學專業(yè)14班，遼寧 沈陽 110034；2.2019級臨床醫(yī)學專業(yè)5班；3.組織胚胎學教研室；4.生理學教研室；5.形態(tài)學中心）

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI） 是指由各種外傷導致腦組織嚴重損害的一類疾病，具有高發(fā)生率、高致殘率等特點［1］。研究發(fā)現(xiàn)人腦外傷后血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的完整性遭到破壞［2］，它不再是血管內(nèi)皮和大腦之間完美的保護屏障，其功能障礙導致液體、蛋白質(zhì)和免疫細胞的滲出，從而形成血管源性腦水腫，繼發(fā)一系列的神經(jīng)損傷，甚至留下嚴重的神經(jīng)功能障礙［3］。因此改善BBB 的完整性對于改善TBI 的預(yù)后至關(guān)重要。研究表明緊密連接是維持體內(nèi)BBB 完整性的重要結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)，并且在調(diào)節(jié)細胞旁通透性方面起重要作用。目前，ZO-1、Occludin 和Claudin-5 是研究緊密連接的標志蛋白，他們的變化直接影響緊密連接的狀態(tài)，進而影響B(tài)BB 的細胞旁通透性。瞬時性受體電位通道香草酸受體4（transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4）是位于細胞膜上的一類重要陽離子通道家族成員之一，其在不同大小的動脈毛細血管內(nèi)皮細胞均有表達，TRPV4 激活可引起Ca2+內(nèi)流和NO 的釋放，最終使細胞骨架重塑［4］。研究已經(jīng)證明細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加以及NO表達水平的增高均是BBB開放的重要因素［5-6］。我們推測TBI 后BBB 完整性的破壞可能與腦微血管內(nèi)皮上TRPV4 通道的異常激活相關(guān)，其作用機制可能通過緊密連接開放的細胞旁途徑實現(xiàn)。本文擬建立大鼠TBI 動物模型，探討TRPV4 通道抑制劑對TBI后BBB完整性破壞的作用和可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性SD 大鼠66 只，體重250～300 g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，飼養(yǎng)于沈陽醫(yī)學院實驗動物研究中心，實驗動物許可證號：SCXK（遼）2020-0001。動物房12 h/12 h 晝夜交替，動物自由飲水、進食，23～25 ℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進入實驗。術(shù)前所有動物禁食12 h，但自由飲水。本研究遵循單位和國家有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定。

1.2 材料 TRPV4 通道抑制劑HC067047（美國MedChemExpress 公司）、Claudin-5 和Occludin 抗體（美國Santa Cruz 公司），伊文思藍（美國Sigma 公司），Western blot 試劑盒（博士德生物工程有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠TBI模型制備 參照Feeney等［7］自由落體致傷法制作大鼠大腦頂葉局灶皮質(zhì)挫裂傷模型。10%水合氯醛（3.5 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，并固定于腦立體定位儀上。剪開顱頂部皮膚，確定前囟點。以前囟后1.5 mm、右2.5 mm處為中心，鉆一直徑5 mm骨窗，暴露硬腦膜。將撞擊頭移至硬腦膜上方，導管最下端平面與撞擊頭上的環(huán)形標記齊平，用20 g打擊錘于20 cm處沿外周導管墜落致大鼠右側(cè)大腦頂葉挫裂傷。打擊后用骨蠟封閉骨窗，縫合頭部皮膚。動物模型制備后，根據(jù)神經(jīng)功能缺損評分（mNSS）判斷，篩選模型成功動物進行后續(xù)實驗。

1.3.2 給藥方法和實驗分組 為了明確TBI 后BBB通透性的變化，SD大鼠按時間點隨機分為假手術(shù)組（Sham）組和TBI 3 h 組、1 d 組、3 d 組、7 d組。Sham組僅去除骨瓣，不致腦損傷。在確定BBB通透性峰值時間點之后，選取3 d作為代表性時間點組， 并給予TRPV4 通道抑制劑HC067047，之后的實驗隨機分為：Sham 組，TBI 3 d 組、TBI 3 d+HC067047 組。HC067047 于TBI 后立即給藥，之后每8 h 給藥一次，直至實驗結(jié)束，每組6只大鼠。

1.3.3 BBB 通透性的測定 大鼠BBB 的通透性采用伊文思藍的滲出量定量評估。用生理鹽水配制2%伊文思藍（2 mg/kg）。麻醉大鼠后，在每個時間點的前2 h，由大鼠股靜脈給予2%伊文思藍溶液作用2 h，之后暴露大鼠胸腔經(jīng)左心室灌注肝素化生理鹽水，直至右心耳處流出無色液體為止。大鼠斷頭后沿矢狀縫分離兩側(cè)大腦半球并稱重，再放入甲酰胺（1 ml/100mg）中60 ℃孵育24 h。在分光光度計上測定620 nm 處的吸光度值，計算伊文思藍含量。

1.3.4 干濕重法檢測腦組織含水量 各組大鼠經(jīng)過處理后，斷頭取腦，去除腦干，稱濕重；106 ℃烘干至恒重，得干重，計算腦組織含水量。

1.3.5 Western bolt 法檢測大鼠腦損傷組織中Occludin和Caudin-5蛋白的表達 各組大鼠經(jīng)過處理后，斷頭取腦，提取腦損傷組織，分離血管段，將血管段成分勻漿離心、測定蛋白濃度；蛋白分離采用12%SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，分別孵育一抗Occludin 和Caudin-5（1∶500）4 ℃過夜；再孵育相對應(yīng)二抗室溫作用2 h；以β-actin 作為內(nèi)對照，經(jīng)增強化學發(fā)光法發(fā)光，采用Chemi Imager 5500V 2.03 軟件掃描膠片，F(xiàn)luor Chem 2.0 圖像分析儀對條帶積分光密度進行定量分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HC067047 對大鼠TBI 后BBB 通透性的影響 大鼠發(fā)生TBI 后，BBB 通透性明顯增加，于3 d 達峰值，之后逐漸降低，7 d 基本恢復(fù)到正常水平；應(yīng)用TRPV4 通道抑制劑HC067047 后，TBI 3 h組、TBI 1 d組和TBI 3 d組的BBB通透性較同時間點的TBI組明顯降低，見圖1。

圖1 TRPV4抑制劑HC067047對TBI后BBB通透性變化的影響

2.2 HC067047 對大鼠TBI 后腦組織含水量的影響 TBI 3 d 組大鼠腦組織含水量較Sham 組明顯增加，然而TBI 3 d+HC067047 組的腦組織含水量明顯減少，見圖2。

圖2 TRPV4抑制劑HC067047對TBI后腦組織含水量變化的影響

2.3 HC067047 對大鼠TBI 后腦損傷區(qū)域微血管上緊密連接蛋白Occludin 和Caudin-5 表達的影響 TBI 3 d組大鼠腦損傷區(qū)域微血管上緊密連接蛋白Occludin 和Caudin-5 的表達較Sham 組均明顯減少，然而TBI 3 d+HC067047 組的緊密連接蛋白Occludin 和Caudin-5 的表達均有所恢復(fù)，見圖3。

圖3 TRPV4抑制劑HC067047對TBI誘導的BBB破壞Claudin-5和Occludin蛋白表達的影響

3 討論

在本研究中，伊文思藍滲透評估結(jié)果表明大鼠發(fā)生TBI后，BBB通透性明顯增加，于3 d達峰值，7 d 基本恢復(fù)到正常水平；TBI 后立即給予TRPV4 通道抑制劑HC067047，各時間點BBB 通透性的增加受到明顯的抑制；同時應(yīng)用干濕重法檢測腦組織含水量，發(fā)生TBI后3 d的大鼠腦組織含水量較對照組明顯增多，應(yīng)用HC067047 后，TBI 3 d+HC067047 組大鼠腦組織含水量較TBI 3 d組明顯減少；進一步應(yīng)用Western bolt 法檢測大鼠腦損傷組織微血管中緊密連接蛋白Occludin和Caudin-5的表達，發(fā)生TBI后3 d的大鼠腦損傷區(qū)域緊密連接蛋白Occludin 和Caudin-5 的表達較對照組明顯減少，應(yīng)用HC067047 后，TBI 3 d+HC067047組大鼠緊密連接蛋白Occludin和Caudin-5的表達較TBI 3 d 組明顯增多。上述結(jié)果提示，TBI 發(fā)生后BBB 完整性受到損壞，其通透性明顯增加，并且誘發(fā)了腦水腫，抑制TRPV4 功能對TBI 后BBB 破壞具有保護作用；TBI 后BBB 完 整性的破壞可能是通過下調(diào)緊密連接蛋白Occludin和Claudin-5 的表達水平，開放緊密連接實現(xiàn)；抑制TRPV4 功能可能通過部分抑制緊密連接蛋白Occludin和Claudin-5的表達減少，進而實現(xiàn)對TBI后BBB破壞的保護作用。

目前，關(guān)于TRPV4 通道介導的TBI 后BBB 開放相關(guān)信號通路并不清楚。Liao 等［8］的研究表明TRPV4 通過Ca2+/PKC-δ 信號途徑促進聲波介導的BBB 開放。TRPV4 通道異常激活，引起Ca2+內(nèi)流，使細胞骨架重塑［4］。鈣介導的信號途徑，如PKC 途徑，能夠調(diào)節(jié)上皮細胞間緊密連接的完整性［9-12］。緊密連接蛋白介導的細胞旁途徑在調(diào)節(jié)BBB通透性方面起重要作用，我們推測Ca2+/PKC-δ信號途徑可能在TRPV4 通道介導的大鼠TBI 后BBB 破壞中發(fā)揮重要作用，需要進一步的實驗證實。

綜上所述，抑制TRPV4 通道激活可以減少TBI 后BBB 破壞程度，其機制可能是通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白Occludin 和Caudin-5 的表達實現(xiàn)，這可能是TRPV4通道抑制劑減輕TBI后BBB破壞作用的機制之一。