海洋弧菌HN897 β-瓊脂糖酶基因vas1-1339 異源表達及活性分析

喻飛, 金興坤, 雷天影, 曹海航, 陳鏘輝, 陽耀帆, 李佳航, 趙哲

河海大學(xué)海洋學(xué)院, 海洋生物技術(shù)與資源利用研究所, 江蘇 南京 210098

瓊脂是由海洋藻類中提取的一類膠狀多糖, 瓊脂糖(Agarose)是其主要組成成分之一(Park et al,2020)。瓊脂糖是由α-L-半乳糖和β-D-半乳糖重復(fù)單元構(gòu)成的瓊脂多糖; 部分微生物可通過瓊脂糖酶(Agarase)生化酶解作用將瓊脂糖水解為更小分子量的瓊脂寡糖, 從而可被生物體進一步分解利用, 這也是海洋微生物碳源利用的方式之一(Wang et al,2020; Park et al, 2020)。依據(jù)水解糖苷鍵的不同, 瓊脂糖酶分為α-瓊脂糖酶和β-瓊脂糖酶, 其中β-瓊脂糖酶可水解多糖的β(1,4)糖苷鍵從而產(chǎn)生具有β-D-半乳糖還原性殘基末端的新瓊寡糖(Neoagaro oligosaccharides)等(Hsu et al, 2015)。新瓊寡糖具有多重生物活性, 在食品醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的開發(fā)利用價值(Fu et al, 2010)。

目前已在不同種屬的海洋細菌基因組中發(fā)現(xiàn)β-瓊脂糖酶編碼基因, 例如Agarivorans(瓊膠菌屬)、Microbultifer、Pseudomonas(假單胞菌屬)、Zobellia、Vibrio(弧菌屬)等菌屬?；谛蛄型葱?β-瓊脂糖酶分子被分為4 個不同糖苷水解酶家族(Glycoside hydrolase, GH family), 即GH-118 家族、GH-86 家族、GH-50 家族和GH-16 家族; 尤以GH-16 家族酶類較多, 且具有不同的底物特異性(Lu et al, 2009;Liang et al, 2014; Teh et al, 2020)。上述4 類GH 家族蛋白具有底物催化功能的糖苷水解酶結(jié)構(gòu)域(GH),大部分具有糖類結(jié)合結(jié)構(gòu)(Carbohydrate binding modules, CBM)。CBM 結(jié)構(gòu)域普遍存在于多肽鏈的羧基端(Alkotaini et al, 2016), 如弧菌來源的瓊脂糖酶AgaA、AgaV 等(Boraston et al, 2004; Zhang et al,2007; Dong et al, 2007)。近年來, 國內(nèi)外針對產(chǎn)β-瓊脂糖酶菌株分離及基因鑒定已較為完善, 研究重點已逐步向闡述其降解瓊脂糖機制及應(yīng)用工具開發(fā)方向轉(zhuǎn)變。

2018 年本課題組分離獲得一株高產(chǎn)瓊脂糖酶弧菌HN897 株(張靜雅 等, 2018), 2020 年對該菌基因組編碼的8 個瓊脂糖酶基因進行了分子鑒定和功能研究(Liu et al, 2020); 其中β-瓊脂糖酶基因vas1-1339是弧菌HN897 基因組中一個GH-16 家族基因, 功能結(jié)構(gòu)域比對分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白含3 個保守的結(jié)構(gòu)域: N 端疏水信號肽、β-瓊脂糖酶同源結(jié)構(gòu)域(Beta_agarase, InterPro 數(shù)據(jù)庫登錄號:IPR016287)和Ricin_B_lectin 結(jié)構(gòu)域(InterPro 數(shù)據(jù)庫登錄號: PF00652)。該基因編碼蛋白與弧菌V134 株的瓊脂糖酶AgaV (GeneBank 登錄號: ABL06969.1)高度同源, 暗示兩者具有相似功能(Zhang et al, 2007;Liu et al, 2020)。在弧菌HN897 中, 基因敲除試驗表明β-瓊脂糖酶基因vas1-1339的缺失顯著降低弧菌HN897 對瓊脂的水解作用, 說明Vas1-1339 瓊脂糖酶是弧菌HN897 高效降解瓊脂糖的必要基因。為進一步探查弧菌HN897 株Vas1-1339 瓊脂糖酶是否可以獨立發(fā)揮降解功能, 本研究在大腸桿菌(非產(chǎn)瓊脂糖酶菌)中重組表達了Vas1-1339 瓊脂糖酶, 分析其表達特性及功能活性。

1 材料方法

1.1 材料

海洋弧菌HN897 菌株由本課題組篩選分離自海水水樣, 保存于河海大學(xué)海洋科學(xué)實驗中心; 大腸桿菌DH5α和BL21 菌株購自天根生化科技有限公司?；【鶷CBS 培養(yǎng)基、大腸桿菌LB 培養(yǎng)基、盧戈氏碘液、蛋白酶抑制劑PMSF 等試劑購自上海生工生物科技有限公司。PrimeStar HS PreMix 和In-fusion cloning kit 購自Takara 公司; 細菌DNA 提取試劑盒、Gel & PCR Clean Up Kit 及Plasmid Mini Kit 購自O(shè)mega 公司; Protein loading buffer、考馬斯亮藍染色液、Chemiluminescence Kit 等蛋白電泳試劑購自上海天能生物科技有限公司; 鼠源His6 標(biāo)簽抗體和偶聯(lián)HRP 的兔源抗鼠IgG 抗體購自ABclonal Technology 公司。

1.2 pET28a-1339 載體克隆構(gòu)建

將弧菌HN897 菌株復(fù)蘇涂布于TCBS 培養(yǎng)平板,30℃培養(yǎng)24～28h, 挑取單菌落擴大培養(yǎng), 利用提取試劑盒提取細菌DNA。依據(jù)HN897 菌株基因組信息(Vas1, GeneBank 登錄號: CP047475)設(shè)計β-瓊脂糖酶基因vas1-1339(GeneBank 登錄號:WP_164648163.1)的閱讀框擴增引物, 引物為1339-F1: 5′-ATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGA AATCCATAATTAAAACTCTGACATT-3′; 1339-R1:5′-TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTATTGTATAA ATTTCAATCGCTGGTT-3′。以200ng 弧菌HN897 DNA 作為模板, 進行PCR 擴增, 擴增條件: 98℃10s, 58℃ 30s, 72℃ 1min, 35 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物純化回收, 利用In-fusion cloning kit 插入pET28a (+)空質(zhì)粒(EcoRⅠ酶切位點); 熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α, 37℃培養(yǎng)12～16h, 挑取單克隆測序驗證, 獲得pET28a-1339 載體質(zhì)粒。

1.3 誘導(dǎo)表達

將100ng pET28a-1339 質(zhì)粒, 熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 菌株, 37℃培養(yǎng)12～16h; 挑取單克隆于5mL LB液體培養(yǎng)基(含有100μg·mL-1氨芐青霉素)中過夜活化?；罨哼M一步1∶100 稀釋擴大培養(yǎng)至OD600達到0.4 左右, 加入不同濃度的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)誘導(dǎo)His6-1339 表達, 4000g 離心5min, 收集菌體備用, 加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)用于抑制蛋白降解。重組His6 標(biāo)簽蛋白純化方法參照產(chǎn)品說明書。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡

聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-page): 菌體蛋白加入2×Protein loading buffer, 混勻, 95℃處理10min 后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%～12% SDS-page膠)。電泳條件: 80V 電壓電泳30min, 120V 電壓電泳60min, 然后進行考馬斯亮藍染色或轉(zhuǎn)膜。

免疫印跡: 將蛋白膠轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。轉(zhuǎn)膜條件: 100V 電壓轉(zhuǎn)印60min; 膜用5%脫脂牛奶封閉2h; His6 一抗1∶3000 稀釋孵育4h; 用磷酸緩沖液(Phosphate buffered saline and 1% Tween-20, PBST)清洗4 次每次5min; 辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)偶聯(lián)二抗 1∶4000 稀釋孵育 2h;PBST 清洗4 次每次5min; 利用化學(xué)發(fā)光法顯色試劑盒Chemiluminescence Kit 顯色。

1.5 盧戈氏碘液染色分析

重組His6-1339 菌株活體水解瓊脂活性分析:活化培養(yǎng)菌株(His6-1339)至OD600 達到0.4, 1∶100稀釋后取1μL 點加至LB 培養(yǎng)平板(含有100μg·mL-1氨芐青霉素及不同濃度的IPTG), 37℃培養(yǎng)12h; 利用1.5%盧戈氏碘液進行平板染色0.5～1min; 根據(jù)平板上菌落周圍透明圈的大小對菌株降解瓊脂糖的能力進行定性分析; 轉(zhuǎn)化pET28a 空載體的大腸桿菌BL21 菌株作為對照組。

重組表達的瓊脂糖酶水解瓊脂活性分析: 500ng純化的融合蛋白His6-1339 溶液點加至1.5%瓊脂平板, 37℃孵育2h, 進行盧戈氏碘液染色; 500ng 牛血清蛋白(Bovine serum albumin, BSA)溶液作為陰性對照。蛋白濃度利用二辛可寧酸法(bicinchoninic acid method, BCA)試劑盒進行測定。

1.6 基因及氨基酸序列數(shù)據(jù)及分析

HN897 菌株基因組數(shù)據(jù)信息已由本課題組上傳至 NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫, 登錄號為 CP047475(Vas1)和CP047476 (Vas2); 重組His6-1339 蛋白理論分子量計算利用 Compute pI/Mw tool (https://web.expasy. org/ compute_pi/); 利用Peptide cutter 進行 蛋 白 多 肽 切 割 位 點 預(yù) 測 (https://web.expasy.org/peptide_ cutter/)。

2 結(jié)果

2.1 β-瓊脂糖酶基因vas1-1339 克隆及分析

為研究海洋弧菌 HN897 株β-瓊脂糖酶基因vas1-1339在大腸桿菌中的表達, 從海洋弧菌HN897 株中提取細菌基因組 DNA, 以此為模板PCR 擴增獲得Vas1-1339 的基因編碼閱讀框(open reading frame, ORF), 全長1359bp (圖1a); 利用同源重組方法插入 pET28a 空質(zhì)粒中, 構(gòu)建新表達ORF: His6-1339, 全長1467bp; 從而獲得pET28a-1339 載體用于表達N 端帶有His6 標(biāo)簽的融合蛋白His6-1339, 且C 端未引入外源多肽。融合蛋白肽鏈全長488 個氨基酸, 其中His6 標(biāo)簽和1339 蛋白理論分子量分別為3.8kDa 和51.7kDa (圖1b)。

圖 β-瓊脂糖酶Vas1-1339 基因PCR 擴增電泳圖(a)及其pET28a-1339 載體的重組表達模式圖(b)Fig. 1 Agarose electrophoresis of Vas1-1339 product (a), and schematic diagram of the gene expression (b)

2.2 β-瓊脂糖酶重組表達

在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達N 端帶有His6 標(biāo)簽的融合蛋白His6-1339。首先利用100μmol·L-1誘導(dǎo)物IPTG 初步誘導(dǎo)3h, 收集菌液。聚丙烯膠變性電泳(SDS-Page)分析發(fā)現(xiàn)約55kDa 蛋白大小附近有明顯條帶(圖2a), 初步表明融合蛋白His6-1339 成功表達;利用免疫印跡試驗驗證這一結(jié)果(圖2b)。為進一步優(yōu)化融合蛋白His6-1339 重組表達條件, 利用不同IPTG 濃度(0、0.1、1、10、100 μmol·L-1)誘導(dǎo)表達融合蛋白His6-1339; 100μmol·L-1IPTG 能夠顯著抑制His6-1339 菌株的生長, 說明表達的融合蛋白的His6-1339 菌株對高濃度IPTG 敏感; 同時盧戈氏碘液染色分析發(fā)現(xiàn)10μmol·L-1IPTG 為誘導(dǎo)表達的最優(yōu)濃度(圖3)。免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)在10μmol·L-1IPTG誘導(dǎo)1～4h 條件下, His6-1339 蛋白均有效表達; 2～4h表達量高于1h 的表達量(圖4)。

圖2 重組β-瓊脂糖酶His6-1339 誘導(dǎo)表達a. β-瓊脂糖酶His6-1339 誘導(dǎo)表達樣品的SDS-PAGE 分析, U 未誘導(dǎo), I 誘導(dǎo); b. 圖a 中樣品進行免疫印跡分析, 鼠抗His-tag 單克隆抗體用于識別His6 標(biāo)簽蛋白Fig. 2 β-Agarase His6-1339 induced to express in Escherichia coli. (a) His6-tagged protein was induced from E. coli.Representative images from an SDS-PAGE analysis of His6-1339 is shown. Lanes: (U) non-induced; and (I) induced. (b) A western blot analysis of the His6-tag protein (in a) probed with a monoclonal antibody against His6-tag

圖3 盧戈氏碘液染色分析His6-1339 菌株水解瓊脂能力不同菌株(His6-1339 和His6)培養(yǎng)12h 后進行盧戈氏碘液染色分析, 誘導(dǎo)表達中IPTG 使用濃度分別為0.1、1、10 和100 μmol·L-1, 未加IPTG 作為對照組(0μmol·L-1)Fig. 3 Lugol’s iodine staining analysis indicating activity of β-Agarase in Escherichia coli. Agar plate with E. coli strains(His6-1339 and His6) was stained by Lugol’s iodine. IPTG (0.1, 1, 10 and 100 μmol·L-1) were used to induce protein expression, and 0 μmol·L-1 IPTG served as a negative control

2.3 β-瓊脂糖酶羧基端存在胞內(nèi)切割的現(xiàn)象

作為GH16 家族蛋白之一, 基因vas1-1339編碼的β-瓊脂糖酶具有兩個主要保守結(jié)構(gòu)域, 分別是氨基 端 Beta_agarase (IPR016287) 和 羧 基 端Ricin_B_lectin (PF00652)結(jié)構(gòu)域。免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)His6-1339 菌株中檢測到兩條帶有His6 標(biāo)簽的蛋白條帶(圖2b、圖4); 一條為His6-1339 融合蛋白全長,大小約為55kDa; 另一條為His6-1339 融合蛋白的氨基端蛋白, 大小約為30kDa, 該小蛋白的存在暗示His6-1339 融合蛋白在成熟過程中羧基端的多肽序列可能被切除。

圖4 重組β-瓊脂糖酶His6-1339 誘導(dǎo)表達時間優(yōu)化不同時間點(0、1、2、3、4 h)收集誘導(dǎo)菌株(His6-1339)樣品進行免疫印跡分析, 鼠抗His-tag 單克隆抗體用于識別His6 標(biāo)簽蛋白,樣品IPTG 使用濃度為10μmol·L-1Fig. 4 Optimization of β-Agarase His6-1339 expression induced by IPTG. A western blot analysis of the His6-1339 protein probed with a monoclonal antibody against His-tag.The samples were collected at the indicated times, and the 10 μmol·L-1 IPTG was used to induce protein expression

2.4 異源細菌中表達弧菌β-瓊脂糖酶的活性初步分析

為分析Vas1-1339基因在大腸桿菌中的表達產(chǎn)物是否具有降解瓊脂糖酶活性, 利用盧戈氏碘液染色分析法初步評估His6-1339 融合蛋白水解瓊脂能力。結(jié)果表明, 活體His6-1339 菌株在LB 平板上能夠有效水解培養(yǎng)基中的瓊脂, 形成明顯的透明水解圈(圖3), 其中10μmol·L-1IPTG 誘導(dǎo)條件下形成的透明水解圈更明顯。該結(jié)果初步說明弧菌來源的瓊脂糖酶Vas1-1339 在大腸桿菌中能夠發(fā)揮降解瓊脂糖的功能。利用親和結(jié)合純化獲得His6-1339 融合蛋白(圖 5), 盧戈氏碘液染色分析表明純化的His6-1339 融合蛋白2h 內(nèi)即能夠有效水解培養(yǎng)基中的瓊脂糖, 形成透明水解圈(圖5c), 說明純化的瓊脂糖酶在體外能夠有效降解瓊脂糖。

圖5 純化β-瓊脂糖酶His6-1339 降解瓊脂糖分析a. 純化His6-1339 蛋白進行SDS-PAGE 分析, 兩泳道代表不同批次純化的蛋白樣品; b. 純化的His6-1339 蛋白樣品進行免疫印跡分析,鼠抗His-tag 單克隆抗體用于識別His6 標(biāo)簽蛋白, 兩泳道表示不同批次純化的蛋白樣品; c. 盧戈氏碘液染色分析純化的His6-1339 蛋白水解瓊脂能力, His6-1339 蛋白使用量為500ng, 等量牛血清蛋白(BSA)作為對照Fig. 5 Agarose hydrolysis of purified His6-1339 protein. (a) Purified His6-1339 protein analyzed by SDS-PAGE assay; (b) A western blot analysis of purified His6-1339 protein probed with a monoclonal antibody against His6-tag; (c) Agar plates with purified His6-1339 protein (500 ng) were stained by Lugol’s iodine. The 500 ng BSA protein serves as a control

3 討論

通過全基因組篩查發(fā)現(xiàn)弧菌HN897 株編碼了8個瓊脂糖酶編碼基因, 分別屬于GH50 和GH16 家族,其中Vas1-1339是弧菌降解瓊脂糖的關(guān)鍵基因(Liu et al, 2020), 本研究在異源細菌(大腸菌桿菌)中成功表達了該瓊脂糖酶基因, 證明該基因表達產(chǎn)物能夠獨立發(fā)揮瓊脂糖酶水解活性, 說明單一的瓊脂糖酶Vas1-1339 即能夠降解瓊脂糖生成還原性低聚糖產(chǎn)物, 并不完全依賴于其他GH 家族基因(例如GH50)的初步降解。在弧菌HN897 中其他的7 個GH 家族蛋白可能與瓊脂糖酶Vas1-1339 具有不同的底物特異性, 即降解的多糖類型不同; 也有可能部分GH家族蛋白參與了Vas1-1339 酶解產(chǎn)物(低聚糖)的進一步水解(Yu et al, 2020)。瓊脂糖酶Vas1-1339 降解瓊脂糖的產(chǎn)物類型本文并未涉及, 有待進一步深入研究。

除了GH-118 家族以外, 大多數(shù)β-瓊脂糖酶結(jié)構(gòu)中包含CBM 域, 其能夠識別多糖中的二糖重復(fù)單元, 從而使糖苷水解酶結(jié)構(gòu)域能夠靶向多糖, 發(fā)生酶促反應(yīng)并水解底物(Chi et al, 2012; Han et al,2013)。在Vas1-1339 瓊脂糖酶中并未發(fā)現(xiàn)保守CBM結(jié)構(gòu)域, 其C 端是一個未知功能的Ricin_B_lectin結(jié)構(gòu)域(Liu et al, 2020)。在Zobellia galactanivorans菌GH-16 家族β-瓊脂糖酶AgaA 羧基端有兩個未知功能結(jié)構(gòu)域; AgaA 全長理論大小為60kDa, 在降解瓊脂糖過程中發(fā)現(xiàn)其未知功能的結(jié)構(gòu)域被切除(C 端245 個氨基酸), 成熟的AgaA 僅有31kDa (Jam et al,2005); 同樣在κ型卡拉膠酶(κ-carrageenase)中也發(fā)現(xiàn)類似切割現(xiàn)象(Potin et al, 1995; Barbeyron et al,1998)。在異源細菌中重組表達Vas1-1339 瓊脂糖酶,免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)表達的His6-1339 融合蛋白C 端的Ricin_B_lectin 結(jié)構(gòu)域可能被切除, 產(chǎn)生一個僅有30kDa 左右的N 端蛋白; 可能原因是瓊脂糖酶在多肽合成后經(jīng)過多步反應(yīng)最終產(chǎn)生成熟蛋白; 該結(jié)論仍需要利用質(zhì)譜試驗進一步確認變性或非變性條件下蛋白的準確分子量以及蛋白切割的效率(Jam et al,2005)。目前免疫印跡分析結(jié)果僅能初步說明Vas1-1339 瓊脂糖酶在表達中可能經(jīng)過復(fù)雜的切割成熟過程, 這為進一步研究弧菌Vas1-1339 瓊脂糖酶的瓊脂降解機制指明初步方向。

瓊脂經(jīng)水解作用可獲得二糖、四糖、六糖、八糖等(新)瓊脂寡糖。瓊脂寡糖具有抗氧化、抗炎抗輻射、降血糖等多種生物學(xué)活性(Hsu et al, 2015;Jiang et al, 2020)。目前可基于化學(xué)方法和酶解方法水解瓊脂獲得該類低聚糖產(chǎn)物, 廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域(Martin et al, 2014)。化學(xué)方法主要通過強酸或氧化還原法破壞瓊脂糖苷鍵獲得新低聚產(chǎn)物, 該類方法具有專一性(穩(wěn)定性)差, 反應(yīng)條件苛刻等劣勢, 同時還可能帶來嚴重的環(huán)境污染問題(林福娣, 2020)。與此類方法相比, 酶解法利用瓊脂糖酶特異性識別底物水解瓊脂糖, 有利于特定寡糖的大量制備, 酶促反應(yīng)具有一定的穩(wěn)定性及環(huán)保性(Jiang et al, 2020; 林福娣, 2020)。然而,目前酶解法大規(guī)模應(yīng)用還處于概念和研發(fā)階段。本文初步利用生物工程技術(shù)在大腸桿菌中表達弧菌瓊脂糖酶基因, 優(yōu)化其表達條件; 為進一步針對海洋弧菌來源的瓊脂糖酶應(yīng)用技術(shù)開發(fā)奠定了初步的基礎(chǔ)。