三份南海島礁珊瑚砂樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性

李存, 崔林青, 楊紅強(qiáng), 龍麗娟, 田新朋

1. 中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所), 廣東 廣州 510301;

2. 中國(guó)科學(xué)院邊緣海與大洋地質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所), 廣東 廣州 510301;

3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(廣州), 廣東 廣州 511458;

4. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

珊瑚礁是典型的生物礁, 珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)是全球物種多樣性最高、資源最豐富的生態(tài)系統(tǒng)之一, 被譽(yù)為“海洋中的熱帶雨林”(龍麗娟 等,2019)。島礁生態(tài)系統(tǒng)中的微生物至關(guān)重要, 它不僅參與珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的化學(xué)循環(huán)和物質(zhì)轉(zhuǎn)化,還與珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中各種生物的健康息息相關(guān)(周進(jìn) 等, 2014), 但目前對(duì)島礁環(huán)境微生物的研究相對(duì)較少, 因此島礁環(huán)境中微生物資源有待深入的研究。

微生物在地球能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)中扮演了重要角色, 也是珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中重要成員, 開(kāi)展微生物多樣性研究將有助于了解微生物在珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中的功能, 對(duì)珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)微生物資源的開(kāi)發(fā)和利用有促進(jìn)作用。近年來(lái)為了對(duì)純培養(yǎng)微生物多樣性進(jìn)行研究, 許多學(xué)者通過(guò)改進(jìn)培養(yǎng)基配方以及優(yōu)化培養(yǎng)條件, 顯著提高了分離得到的可培養(yǎng)微生物的多樣性, 并獲得了更多新的微生物類(lèi)群。孫創(chuàng)等(2021)采用改良的 2216E固體培養(yǎng)基、R2A 固體培養(yǎng)基、MBM 固體培養(yǎng)基、TCBS 固體培養(yǎng)基和改良的2216E 液體培養(yǎng)基對(duì)西太平洋海水中的微生物進(jìn)行分離純化, 而且獲得了多株新分類(lèi)單元。Xian 等(2020)通過(guò)微生物網(wǎng)絡(luò)分析, 發(fā)現(xiàn)溫單胞菌在群落中可以將復(fù)雜底物轉(zhuǎn)化為綠彎菌等難培養(yǎng)微生物生長(zhǎng)必需的小分子底物, 于是利用菌株TepidimonasSYSU G00190W 的上清液改良培養(yǎng)基, 實(shí)現(xiàn)了熱泉生境中未培養(yǎng)綠彎菌的定向分離培養(yǎng), 進(jìn)一步代謝組學(xué)研究表明, 培養(yǎng)基上清液中含有很多小分子有機(jī)基質(zhì), 可作為未培養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)的潛在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。何媛秋等(2020)通過(guò)采用不同培養(yǎng)溫度、鹽度、pH、樣品稀釋倍數(shù)和營(yíng)養(yǎng)濃度條件對(duì)南海沉積物樣品進(jìn)行可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性研究, 發(fā)現(xiàn)寡營(yíng)養(yǎng)、20 倍的樣品稀釋倍數(shù)、pH 6 和0.05%以下的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物濃度更有利于稀有細(xì)菌類(lèi)群的分離培養(yǎng)。熊盈盈等(2021)總結(jié)前人對(duì)微生物分離培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn), 提出針對(duì)未培養(yǎng)的環(huán)境微生物培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件改良方法, 比如添加抑制劑、樣品抽提液或菌液、信號(hào)分子、電子供受體以及維生素、生物酶或蛋白因子等物質(zhì), 或用其他凝固劑代替瓊脂,延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間以及極限稀釋培養(yǎng)法等。

珊瑚礁樣品采集難度較大, 非常珍貴, 為獲得更多種類(lèi)的可培養(yǎng)微生物, 本研究采用5 種不同營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基, 并添加不同的微量元素, 對(duì)3 個(gè)島礁陸域珊瑚砂樣品進(jìn)行可培養(yǎng)微生物的分離; 同時(shí)分析了不同培養(yǎng)基條件下島礁可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性, 島礁可培養(yǎng)細(xì)菌的群落組成, 以及使用PICRUSt2 軟件對(duì)不同島礁微生物群落功能進(jìn)行了合理預(yù)測(cè), 以展示其生態(tài)功能狀況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 珊瑚砂樣品

本次試驗(yàn)的南海島礁珊瑚砂樣品從有人島礁永暑礁(Y11-S)以及無(wú)人島礁扁參礁(BS2-S)和貝殼礁(BK-S)采集獲得, 使用無(wú)菌采樣勺取珊瑚砂表層0～3cm 的新鮮沉積砂樣, 裝入無(wú)菌塑料保藏袋, 放于-20℃保藏備用。

1.1.2 分離培養(yǎng)基

試驗(yàn)采用5 種寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基, 即5% 2216E固體培養(yǎng)基、 5% AIA (DifocMactinomycete isolation agar)固體培養(yǎng)基、5% R2A 固體培養(yǎng)基、SN 固體培養(yǎng)基和10% 菌液瓊脂培養(yǎng)基(表1)。同時(shí)單獨(dú)添加不同的微量元素(終濃度為0.05%),分別為醋酸鈉、二甲基巰基丙酸(DMSP)、半胱氨酸、甲硫氨酸、?；撬帷Ｃ糠N培養(yǎng)基中瓊脂終濃度為15. 0g·L–1。

表1 不同培養(yǎng)基的類(lèi)型及其成分Tab 1 Components of selective isolation media used in this study

1.1.3 試驗(yàn)試劑與儀器

細(xì)菌 16S rRNA 基因擴(kuò)增的通用引物 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。5% Chelex 100 試劑(5g Chelex 100 Resin (Bio-rad, USA)溶解于100mL 滅菌超純水); Taq DNA 聚合酶(北京全式金); PCR 儀(Eppendorf, German); 凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad, USA);小型臺(tái)式高速離心機(jī)和恒溫箱(ESCO, Singapore)。

1.2 菌株的分離、純化與保藏

稱取0.5g 珊瑚砂樣品, 使用滅菌的無(wú)菌海水稀釋20 倍, 手動(dòng)用力震蕩搖動(dòng)3min 后取150μL 稀釋后的樣品懸濁液涂布于固體培養(yǎng)基表面, 每份樣品每種培養(yǎng)基涂布兩個(gè)平板。將涂布好的分離培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)于28℃恒溫培養(yǎng)箱中, 連續(xù)培養(yǎng)一個(gè)月后挑取培養(yǎng)基中所有細(xì)菌形態(tài)的單菌落, 利用平板劃線法在2216E 固體培養(yǎng)基(MA)上進(jìn)行分離純化, 將純化后的菌種轉(zhuǎn)入體積質(zhì)量30%甘油管中, 放置于-80℃冰箱中保藏。

1.3 16S rRNA 基因擴(kuò)增測(cè)序分析

細(xì)菌總 DNA 通過(guò) 5% Chelex-100 試劑提取(Walsh et al, 1991), 采用細(xì)菌通用引物27F 和1492R進(jìn)行16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增。獲得的PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后, 送廣州天一輝遠(yuǎn)測(cè)序公司進(jìn)行基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用 SeqMan 5.0(Swindell et al, 1997)軟件進(jìn)行拼接, 去除質(zhì)量不佳的測(cè)序堿基后, 將獲得的有效序列(近1500bp)提交至EzBioCloud (Yoon et al, 2017)和NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行在線BLAST 比對(duì), 比對(duì)結(jié)果按照 98%作為區(qū)分物種的標(biāo)準(zhǔn)(Yarza et al,2014), 若與已知菌種相似度小于等于98%, 則認(rèn)為該菌株為潛在新種。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果, 選取同源性較高的模式菌株的 16S rRNA 基因序列作為參比序列, 使用CLUSTAL_W 軟件進(jìn)行多序列比對(duì), 使用MEGA-X(Kumar et al, 2018)軟件, 結(jié)合Kimura2-parameter 模型估算系統(tǒng)進(jìn)化矩陣, 采用鄰近法(neighbor-joining,N-J)(Saitou et al, 1987)進(jìn)行聚類(lèi)分析, 設(shè)置1000 次重采樣構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 使用iTOL (Letunic et al,2019)在線網(wǎng)站對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行可視化。

1.5 多樣性分析與群落功能預(yù)測(cè)

統(tǒng)計(jì)3 份樣品中獲得的細(xì)菌種類(lèi)和豐度, 制作樣品-細(xì)菌物種豐度矩陣表, 使用R 語(yǔ)言vegan 包計(jì)算樣品的α多樣性, 包括Shannon 多樣性指數(shù)、Simpson 指數(shù)、invsimpson 多樣性指數(shù)和Chao1 指數(shù)。使用PICRUSt2 軟件(Douglas et al, 2020)基于16S rRNA 基因數(shù)據(jù)對(duì)群落功能進(jìn)行預(yù)測(cè), 參考京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù), 得到直系同源(KEGG orthology)功能的豐度預(yù)測(cè)表及KEGG 代謝途徑豐度表。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌多樣性

通過(guò)菌株分離純化, 本研究共從126 個(gè)未污染的分離平板獲得349 株細(xì)菌, 經(jīng)16S rRNA 基因序列相似性比對(duì)分析, 顯示這些新分離的菌株分別與目前134 個(gè)已知種親緣關(guān)系相近, 這些菌株分別屬于4 門(mén)、6 綱、26 目、43 科、73 屬。4 個(gè)分離到的細(xì)菌門(mén)中放線菌門(mén)(Actinobacteria)的菌株占所有分離菌株的60%, 為優(yōu)勢(shì)菌門(mén), 其他依次為變形菌門(mén)(Proteobacteria, 28%)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes, 11%)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes, 2%)。分離到較多的屬級(jí)類(lèi)群為鏈霉菌屬(Streptomyces, 46 株)、糖多孢菌屬(Saccharopolyspora, 40 株) 和產(chǎn)微球莖菌屬(Microbulbifer, 37 株)。圖1 展示了純培養(yǎng)菌株在不同分類(lèi)等級(jí)中細(xì)菌類(lèi)群所占的比例。圖2 展示了134 個(gè)物種(選取同種菌株中相似度最高的作為代表菌株)與其最相似已知物種菌株的16S rRNA 基因組列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。對(duì)獲得的4 個(gè)門(mén)級(jí)類(lèi)群純培養(yǎng)菌株的多樣性分別進(jìn)行描述。

圖1 分離獲得的純培養(yǎng)細(xì)菌在各分類(lèi)等級(jí)中的分布情況a. 在不同門(mén)級(jí)、綱級(jí)、目級(jí)水平下細(xì)菌類(lèi)群比例; b. 在不同屬水平下細(xì)菌類(lèi)群比例(標(biāo)注了菌株中豐度前25 的屬)Fig. 1 Distribution of isolated pure culture strains in each classification grade. (a) Proportion of pure culture strains at different phylum, class and order levels, and (b) proportion of pure culture strains in the top 25 genera

圖2 采用鄰接法基于16S rRNA 基因序列構(gòu)建的134 個(gè)代表菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Neighbor-joining phylogenetic tree of 134 representative strains reconstructed based on the 16S rRNA gene sequences

2.1.1 放線菌門(mén)

分離得到的放線菌門(mén)細(xì)菌共計(jì)210 株, 屬于放線菌綱(Actinomycetia)的15 目22 科37 屬74 個(gè)菌種, 分離菌株數(shù)量最多的為鏈霉菌和糖多孢菌屬, 其中包含鏈霉菌屬下的11 個(gè)菌種、糖多孢菌屬下的3 個(gè)菌種, 其中Saccharopolyspora spongiae(27 株)、Streptomycesdiacarni(20 株)、Saccharopolyspora tripterygii(12 株)、Streptomyces albiaxialis(11 株) 、Nocardioides iriomotensis(11 株)為分離到的主要優(yōu)勢(shì)菌株, 其他優(yōu)勢(shì)屬還包括微桿菌屬(Microbacterium)、類(lèi)諾卡氏屬(Nocardioides) 、Barrientosiimonas、 布勞氏菌屬(Prauserella)、短桿菌屬(Brevibacterium)、迪茨氏菌屬(Dietzia)、兩面神菌屬(Janibacter)、羅斯氏菌屬(Rothia)、紅球菌屬(Rhodococcus)、戈登氏菌屬(Gordonia)等。

2.1.2 變形菌門(mén)

本研究分離得到的變形菌門(mén)菌株共計(jì) 96 株,涵蓋了3 綱(α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱)、8 目(Burkholderiales、Caulobacterales、Cellvibrionales、Lysobacterales 、 Rhizobiales 、 Rhodobacterales 、Rhodospirillales、Sphingomonadales)、15 科、23 屬、33 種。在綱水平上優(yōu)勢(shì)類(lèi)群為α-變形菌綱(53 株)和γ- 變形菌綱(42 株) 。 前者中以紅細(xì)菌目(Caulobacterales)、根瘤菌目(Rhizobiales)和柄桿菌目(Caulobacterales)為主, 后者則以Cellvibrionales 為主。獲得菌株中最多的物種為Microbulbifer variabilis(34 株)、Ruegeria arenilitoris(11 株)、Pararhizobium haloflavum(9 株)。

2.1.3 厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)

本研究中獲取的37 株厚壁菌門(mén)菌株分別屬于芽孢桿菌目的4 科11 屬, 以芽孢桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus) 、 短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)為主, 優(yōu)勢(shì)菌株為Bacillus altitudinis(5 株)。另外, 擬桿菌門(mén)僅分離得到6 株, 分別屬于土壤中華微桿菌(Sinomicrobium soli, 3 株)和黃色簡(jiǎn)浩然菌(Haoranjiania flava, 3 株)。

2.2 3 份珊瑚砂樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性的比較

本研究所采集的3 份樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的主要優(yōu)勢(shì)類(lèi)群不同, 選擇Shannon、Simpson、Invsimpson、Chao1 和ACE 指數(shù)對(duì)3 份樣品的細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行評(píng)估。由表2 和圖3 可知, 樣品BK-S 和BS2-S的多樣性較高, 而Y11-S 樣品的多樣性較為單一。BK-S 樣品中獲得的80 個(gè)菌種分別屬于4 門(mén)、5 綱、21 目、32 科、48 屬, 優(yōu)勢(shì)類(lèi)群為放線菌綱、α-變形菌綱和γ-變形菌綱。BS2-S 樣品中獲得的64 個(gè)物種分別屬于4 門(mén)、7 綱、20 目、32 科、43 屬, 優(yōu)勢(shì)類(lèi)群為放線菌綱、α-變形菌綱和芽孢桿菌綱。Y11-S樣品中獲得的20 個(gè)物種分別屬于2 門(mén)、2 綱、6 目、7 科、10 屬, 其優(yōu)勢(shì)類(lèi)群為放線菌綱的鏈霉菌屬。雖然采集3 個(gè)樣品的水深均為10m 左右, 采集樣品的水溫、透光性等環(huán)境參數(shù)也相似, 但樣品可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性存在明顯差異, 樣品間細(xì)菌多樣性差異是否與人類(lèi)活動(dòng)有關(guān), 仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

表2 3 份珊瑚砂樣品中細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Tab. 2 Diversity index of pure cultured strains isolated from three coral reef samples

圖3 3 份樣品(Y11、BK-S、BS2-S)中共有菌種數(shù)量Fig. 3 Numbers of same species discovered in three samples of Y11-S, BK-S and BS2-S

2.3 不同培養(yǎng)基分離到的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性比較

本研究使用5 種培養(yǎng)基獲得的最優(yōu)勢(shì)門(mén)級(jí)類(lèi)群都為放線菌門(mén), 最優(yōu)勢(shì)綱為放線菌綱。在5 種培養(yǎng)基中, 5% 2216、SN、10%菌液瓊脂培養(yǎng)基分離得到的細(xì)菌多樣性較高, 除放線菌綱外, 3 種培養(yǎng)基中都分離到了芽孢桿菌綱、α-變形菌綱和γ-變形菌綱。在SN 培養(yǎng)基中還獲得了3 株黃桿菌綱菌種, 在10%菌液瓊脂培養(yǎng)基中還獲得了3 株Chitinophagia 綱和1 株β-變形菌綱菌種。在這種水平上, 5 種培養(yǎng)基分離得到細(xì)菌的多樣性由高到低依次為5% 2216 培養(yǎng)基(61 種)、10%菌液瓊脂培養(yǎng)基(59 種)、SN 培養(yǎng)基(53 種)、5% AIA 培養(yǎng)基(9 種)、5% R2A 培養(yǎng)基(8種)(圖4)。5% 2216 培養(yǎng)基和10%菌液瓊脂培養(yǎng)基中含有豐富多樣的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 其營(yíng)養(yǎng)成分配比更接近于海洋環(huán)境, 如碳氮硫濃度、鹽度, 可以為多種類(lèi)型的菌株提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。分析添加的微量元素的分離效果, 含有醋酸鈉的培養(yǎng)基獲得了更多的菌株數(shù)量; 同時(shí)發(fā)現(xiàn)與已知物種Pseudactinotalea terrae、Actinoplanes sediminis、Tessaracoccus flavescens、Achromobacter piechaudii等相近的潛在新分類(lèi)單元僅在含有醋酸鈉的分離培養(yǎng)基中獲得, 與Micromonospora aurantiaca相近的潛在新分類(lèi)單元僅在含有甲硫氨酸的分離培養(yǎng)基中獲得, 與Actinomadura meyerae相近的潛在新分類(lèi)單元僅在含有DMSP 的培養(yǎng)基中獲得。

圖4 不同培養(yǎng)基獲得的可培養(yǎng)細(xì)菌在不同分類(lèi)水平上的多樣性Fig. 4 Bacterial diversity in different classification grades isolated from different selective isolation media

2.4 潛在新物種信息

以16S rRNA 基因相似度大于98% 時(shí)作為同一物種, 本試驗(yàn)中共分離得到56 株潛在新種, 與目前有效發(fā)表的最相近菌種的16S rRNA 基因相似度范圍在89.9%～98.0%, 其中89.9%～95.0% 的有7 株,95.0%～97.0%的有21 株, 97.0%～98.0%的有28 株;去重復(fù)后為18 個(gè)潛在新種, 見(jiàn)表3。圖5 為56 株潛在新種與已知物種的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù), 其中31 株潛在新分類(lèi)單元屬于放線菌綱, 19 株屬于α-變形菌綱, 3 株屬于芽孢桿菌綱, 3 株屬于Chitinophagia 綱。獲得的31 株潛在放線菌綱新種分別屬于短桿菌屬(Brevibacterium)、短狀桿菌屬(Brachybacterium)、Barrientosiimonas屬 、 賴 氨 酸 單 胞 菌 屬(Lysinimonas)、微桿菌屬(Microbacterium)、花金龜菌屬(Protaetiibacter)、迪茨氏菌屬(Dietzia)、戈登氏菌屬(Gordonia)、類(lèi)諾卡氏菌屬(Nocardioides)、普勞氏菌屬(Prauserella)、阮氏菌屬(Ruania)和鏈霉菌屬(Streptomyces)。對(duì)潛在新種的來(lái)源培養(yǎng)基進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在5% 2216 培養(yǎng)基(19 株)和SN 培養(yǎng)基(19 株)中獲得了最多的潛在新種。圖6 展示了部分潛在新物種的平板菌落形態(tài)情況。

圖5 不同培養(yǎng)基分離得到的潛在新種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 5 Phylogenetic tree of potential new taxa obtained from different media

圖6 不同潛在新種在2216E 培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 天后的菌落平板a. SCSIO 63409 (Inquilinus limosus); b. SCSIO 63263 (Brevibacterium casei); c. SCSIO 63671 (Mesorhizobium oceanicum); d. SCSIO 63659 (Nocardioides iriomotensis); e. SCSIO 63385 (Gordonia terrae); f. SCSIO 63505 (Cohnella cellulosilytica); g. SCSIO 63658(Prauserella rugose); h. SCSIO 68054 (Oceanobacillus iheyensis)Fig. 6 Pure culture morphology of potential new taxa on 2216E medium after incubation for 14 days. (a) SCSIO 63409(Inquilinus limosus); (b) SCSIO 63263 (Brevibacterium casei); (c) SCSIO 63671 (Mesorhizobium oceanicum); (d) SCSIO 63659 (Nocardioides iriomotensis); (e) SCSIO 63385 (Gordonia terrae); (f) SCSIO 63505 (Cohnella cellulosilytica); (g)SCSIO 63658 (Prauserella rugose); (h) SCSIO 68054 (Oceanobacillus iheyensis)

表3 潛在新菌種去重復(fù)信息表Tab. 3 Potential new taxa information after removing the duplication

2.5 PICRUSt2 功能預(yù)測(cè)分析

基于PICRUSt2 軟件, 進(jìn)行菌群功能分析, 得到不同樣品細(xì)菌的功能預(yù)測(cè)信息。利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì), 所有樣品分析的功能涉及8 類(lèi)生物代謝通路: 代謝(metabolism)、功能蛋白(protein families)、遺傳信息處理(genetic information processing)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化(cellular processes)、生物體系統(tǒng)(organismal systems)、人類(lèi)疾病(human diseases)和未分類(lèi)(Unclassified)(圖7), 這8 個(gè)代謝通路主要體現(xiàn)了細(xì)菌菌群的生長(zhǎng)繁殖、物質(zhì)代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)、能量代謝與傳遞、環(huán)境互作等方面的功能信息。分析結(jié)果顯示, 代謝和編碼功能蛋白是主要通路, 豐度分別為40.64%～43.0%和23.18%～23.83%。進(jìn)一步對(duì)預(yù)測(cè)基因二級(jí)功能層級(jí)進(jìn)行分析, 共發(fā)現(xiàn)碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)、轉(zhuǎn)錄(transcription)、膜轉(zhuǎn)運(yùn) (membrane transport) 、 信 號(hào) 傳 導(dǎo) (signal transduction)、細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡(cell growth and death)和能量代謝(energy metabolism)等38 個(gè)子功能。分析發(fā)現(xiàn)3 個(gè)樣品的群落功能組成大體一致, 在碳水化合物代謝、氨基酸代謝、編碼遺傳信息處理蛋白、編碼信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞過(guò)程蛋白等通路具有更高的豐度。PICRUSt2 功能預(yù)測(cè)分析顯示出有人島礁和無(wú)人島礁細(xì)菌群體在其生態(tài)功能方面并無(wú)差異, 這說(shuō)明島礁周邊水下環(huán)境細(xì)菌生態(tài)功能并未因?yàn)閸u礁陸域上人為活動(dòng)而受到影響。

圖7 不同來(lái)源樣品的PICRUSt2 功能預(yù)測(cè)熱圖Fig. 7 Function prediction heatmap of PICRUSt2 for three different samples

3 討論

珊瑚砂是以珊瑚碎屑為主并有石灰藻、有孔蟲(chóng)、棘皮動(dòng)物碎片、貝殼碎片等組成的砂質(zhì)沉積物, 顆粒大小不等, 規(guī)格多種多樣, 其最大的特點(diǎn)是表面微孔豐富, 適宜細(xì)菌生存。本研究采用純培養(yǎng)方式對(duì)南海島礁珊瑚砂環(huán)境可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究,共獲得349 株純培養(yǎng)菌株。鑒定結(jié)果顯示這些菌株分別屬于4 門(mén)、6 綱、26 目、43 科、73 屬、134 種,包括18 個(gè)潛在新種, 其中放線菌門(mén)是最優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌類(lèi)群, 占所有分離菌株的60%, 原因可能與3 個(gè)樣品營(yíng)養(yǎng)貧瘠有關(guān); 其他優(yōu)勢(shì)類(lèi)群依次為變形菌門(mén)(28%)、厚壁菌門(mén)(11%)和擬桿菌門(mén)(2%)。分離得到較多的屬級(jí)類(lèi)群為鏈霉菌屬(46 株)、糖多孢菌屬(40株)和產(chǎn)微球莖菌屬(37 株)。分析發(fā)現(xiàn)樣品BK-S 和BS2-S 中的細(xì)菌多樣性較高, 而Y11 樣品的細(xì)菌多樣性較為單一。樣品BK-S 和BS2-S 來(lái)源于無(wú)人島礁, Y11 樣品來(lái)源的島礁上有人類(lèi)活動(dòng), 對(duì)細(xì)菌群落功能的預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示有人島礁和無(wú)人島礁細(xì)菌群體在其生態(tài)功能方面并無(wú)差異, 這說(shuō)明島礁周邊水下環(huán)境細(xì)菌生態(tài)功能并未因?yàn)閸u礁陸域上人為活動(dòng)而受到影響, 因此Y11 樣品來(lái)源島礁周?chē)h(huán)境中的細(xì)菌多樣性低的原因仍然未知。Sch?ttner 等(2011)對(duì)紅海亞喀巴灣東北部淺岸礁的碳酸鹽砂和硅酸鹽砂樣品進(jìn)行免培養(yǎng)細(xì)菌多樣性的研究, 發(fā)現(xiàn)珊瑚砂樣品中細(xì)菌的群落組成主要為γ-變形菌綱、放線菌綱、α-變形菌綱、δ-變形菌綱、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)等。韓敏敏等(2020)使用6 種普適性培養(yǎng)基對(duì)Khai島和Pathiu 島采集的2 份珊瑚礁沉積物樣品進(jìn)行分離培養(yǎng), 獲得的可培養(yǎng)細(xì)菌類(lèi)群為變形菌門(mén)(54.55%)、厚壁菌門(mén)(31.82%)、放線菌門(mén)(9.09%)和擬桿菌門(mén)(4.54%)。對(duì)比已有的對(duì)珊瑚砂細(xì)菌多樣性的研究, 本研究獲得的可培養(yǎng)類(lèi)群與珊瑚砂中主要細(xì)菌類(lèi)群一致, 并且通過(guò)優(yōu)化改良培養(yǎng)基, 從樣品中獲取了更多種類(lèi)的菌株, 有助于更好的反映珊瑚砂樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性。

本研究將常用的2216E、R2A、AIA 等基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋到5%, 以及使用SN、10%菌液瓊脂等寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)樣品進(jìn)行分離, 從得到的純培養(yǎng)菌株多樣性來(lái)看, 寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基珊瑚砂樣品具有更好的分離效果。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道, 在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中獲得的微生物的數(shù)量并非最多, 相反培養(yǎng)基中高濃度的營(yíng)養(yǎng)物會(huì)影響寡營(yíng)養(yǎng)微生物細(xì)胞生長(zhǎng), 而用于培養(yǎng)寡營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中微生物的培養(yǎng)基中有機(jī)碳水平不應(yīng)高于50mg·L-1(Jannasch et al, 1959; Kadota, 1981;Kjelleberg et al, 1985)。Cho 等(2004)在分析太平洋及遠(yuǎn)洋樣品時(shí), 發(fā)現(xiàn)有44 株γ-變形菌無(wú)法在經(jīng)典培養(yǎng)基上形成菌落, 而其中7 株菌卻可以在10% R2A 瓊脂培養(yǎng)基上形成菌落。K o c h(2 0 0 1)認(rèn)為當(dāng)寡營(yíng)養(yǎng)微生物從營(yíng)養(yǎng)貧乏的生態(tài)環(huán)境中突然轉(zhuǎn)移到富營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中時(shí), 微生物無(wú)法快速適應(yīng)環(huán)境變化, 可能會(huì)在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生有毒物質(zhì), 例如有氧代謝形成的有毒產(chǎn)物累積或細(xì)胞內(nèi)自由基過(guò)快積累, 導(dǎo)致細(xì)胞損傷, 影響生長(zhǎng)。同時(shí), 大量非代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)攝取會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)生長(zhǎng)不均衡, 膜蛋白比例過(guò)高阻礙細(xì)胞質(zhì)膜生長(zhǎng), 細(xì)胞內(nèi)代謝失調(diào), 影響細(xì)胞增殖機(jī)制。

環(huán)境中有些微生物具有乙酰輔酶 A 連接酶(Acetate-CoA ligase, EC 6.2.1.1), 能利用乙酸鹽作為唯一碳源, 使乙酸鹽生成乙酰輔酶A, 而乙酰輔酶A 是細(xì)胞生化代謝過(guò)程中重要的中間產(chǎn)物, 可以轉(zhuǎn)化成多種細(xì)胞所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。硫元素是生物體必需的營(yíng)養(yǎng)元素, 在海洋生態(tài)系統(tǒng)中硫酸鹽、硫化物儲(chǔ)存量巨大, 不同價(jià)態(tài)硫化合物之間的轉(zhuǎn)化主要由代謝功能多樣的微生物等來(lái)完成, 環(huán)境中的硫元素對(duì)某些微生物的生長(zhǎng)至關(guān)重要。因此, 本研究在寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上, 添加乙酸鈉、含硫氨基酸、DMSP 等小分子物質(zhì)來(lái)增加從環(huán)境中獲取微生物的幾率, 從結(jié)果來(lái)看, 與以往使用經(jīng)典培養(yǎng)基進(jìn)行環(huán)境樣品分離相比, 本研究獲得的菌株在多樣性和潛在新種數(shù)量等方面都有顯著的提高。