肺癌表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變分型特征及臨床意義研究

朱麗蒙，韓雪瑩，馬 楠，任曉妮，王小樂(lè)，張 暋

(鄭州金域臨床檢驗(yàn)中心/鄭州市分子醫(yī)學(xué)診斷工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450016)

根據(jù)2020年腫瘤年報(bào)，肺癌是河南省發(fā)病率和死亡率排第一的惡性腫瘤，中晚期肺癌的5年生存率僅為15%，給肺癌患者造成嚴(yán)重的生命威脅和巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。酪氨酸激酶抑制劑(TKI)可特異性結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因敏感突變位點(diǎn)，抑制腫瘤生長(zhǎng)，改善晚期肺癌患者的生存和預(yù)后。美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)(NCCN)2021年V1版《非小細(xì)胞肺癌診治指南》中提出，所有局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者均應(yīng)檢測(cè)EGFR，EGFR基因敏感突變位點(diǎn)陽(yáng)性患者才有可能從EGFR-TKI的靶向治療中獲益[2]。

EGFR基因突變主要分布在酪氨酸激酶區(qū)域的18～21號(hào)外顯子上，已有報(bào)道的常見(jiàn)突變和罕見(jiàn)突變包括30余種，不同突變分型的靶向治療效果和突變率不同[3]。例如，EGFR基因19號(hào)外顯子缺失(19DEL)，約占肺癌EGFR突變的45%，預(yù)示患者對(duì)EGFR-TKI用藥敏感；21號(hào)外顯子L858R 突變也是主要的敏感突變類型，約占EGFR突變的40%；20號(hào)外顯子T790M突變，是第790位密碼子的蘇氨酸(T) 被蛋氨酸(M) 替代，導(dǎo)致 EGFR TK區(qū)域與靶向TKI藥物的親和力降低，從而產(chǎn)生耐藥，在獲得性耐藥患者中，突變率約占50%。因此，分析肺癌患者EGFR突變譜具有重要的臨床意義。研究表明，肺癌患者中，EGFR突變率與臨床特征和病理分型有關(guān)，女性、肺腺癌、多發(fā)轉(zhuǎn)移患者，EGFR基因突變率更高；而年齡、腫瘤病理分級(jí)和臨床分期則與EGFR基因總突變率有顯著相關(guān)性[4]。另外，不同地區(qū)由于遺傳、環(huán)境和生活習(xí)慣不同，患者的EGFR突變率可能會(huì)受到影響[5-6]。但不同地區(qū)和人群的EGFR基因突變譜的臨床特征目前研究尚不完善，傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)對(duì)復(fù)合突變的檢出率低，需要高通量的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)積累、研究和補(bǔ)充。臨床靶向治療中，攜帶不同EGFR分子分型的肺癌患者，對(duì)臨床靶向治療的影響不同，因此，急需EGFR基因分子分型的相關(guān)臨床研究，為肺癌分子診斷和靶向治療方案制定提供參考依據(jù)。

本文擬采用二代測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)來(lái)自河南地區(qū)肺癌樣本中的EGFR基因突變，分析EGFR基因突變分型在肺癌中的典型特征，從而闡述EGFR基因突變譜和分子分型的臨床特征和意義，探討EGFR基因突變分型在肺癌輔助診斷和病理分型中的可能性，為肺癌的臨床診斷和靶向治療提供精準(zhǔn)的基因參考信息。

1 資料與方法

1.1臨床資料 對(duì)2019年7月至2021年2月采集的895例肺癌患者樣本進(jìn)行回顧性分析。患者均確診為肺癌，登記患者性別、年齡、病理分型、臨床癥狀、是否轉(zhuǎn)移等基本資料。樣本和患者資料來(lái)自河南省41個(gè)縣市的134家醫(yī)院，通過(guò)第三方醫(yī)檢公司鄭州金域臨床檢驗(yàn)中心匯總檢測(cè)。本研究通過(guò)金域醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核，研究程序符合倫理要求。

1.2試劑與方法 福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)樣本，經(jīng)病理蘇木精-伊紅(HE)染色，鏡下觀察視野內(nèi)腫瘤細(xì)胞數(shù)占20%以上，并劃分刮取腫瘤細(xì)胞范圍，提取腫瘤DNA樣本。使用凱杰試劑盒(貨號(hào)：56404)采集血漿，血漿樣本體積要求2～4 mL。使用凱杰試劑盒(貨號(hào)：55184)提取血漿循環(huán)游離DNA(cfDNA)樣本。采用二代測(cè)序方法檢測(cè)已提取DNA中的EGFR全外顯子和部分內(nèi)含子區(qū)域的點(diǎn)突變和小片段插入/缺失、剪切子變異、拷貝數(shù)變異突變。其中使用到KAPPA構(gòu)庫(kù)試劑、IDT定制靶向探針、Illumina上機(jī)試劑(貨號(hào)：FC-404-2004)。結(jié)果經(jīng)生物信息分析，采用bwa(0.7.10-r789)+Picard(v 1.128)+Genome Analysis Toolkit(GATK v3.5)等工具將測(cè)序原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變成易存儲(chǔ)、易理解的變體調(diào)用格式(vcf)，得出突變結(jié)果注釋表。依據(jù)美國(guó)《醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)解讀標(biāo)準(zhǔn)和分子病理報(bào)告指南》，參考腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)和人群數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)結(jié)果注釋表進(jìn)行人工分析和突變結(jié)果分類篩選。數(shù)據(jù)質(zhì)控指標(biāo)：Q30>0.85，捕獲特異性大于65%，靶向區(qū)域覆蓋度大于99%，去重后深度大于500X的靶向區(qū)域大于90%。要求檢測(cè)突變靈敏度達(dá)到0.5%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)、連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法分析檢出率之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1樣本特征 895例肺癌患者中年齡23～91歲，年齡中位數(shù)67歲，不同年齡段數(shù)量分布見(jiàn)圖1。肺癌患者中肺腺癌315例，肺鱗癌40例；多發(fā)轉(zhuǎn)移性28例，肺占位42例，胸腔積液10例。按樣本類型分，共收集FFPE組織樣本779例，血漿樣本116例。

圖1 895例肺癌患者年齡特征

2.2.1不同臨床診斷組EGFR分型突變率比較 不同臨床診斷組的EGFR基因分子分型突變率與肺癌總突變率進(jìn)行縱向結(jié)果對(duì)比統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。組1中EGFR總突變率和各突變分型突變率與肺癌總體比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。組2中EGFR基因總突變率，T790M、20INS 2個(gè)分型的突變率與肺癌總體比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但L858R、19DEL、EGFR擴(kuò)增3個(gè)分型的突變率與肺癌總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組3中EGFR總突變率和L858R、T790M 2個(gè)分型的突變率與肺癌總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，19DEL、20INS、EGFR擴(kuò)增3個(gè)分型的突變率與肺癌總體比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。組4中EGFR基因總突變率和各基因突變型的陽(yáng)性率與肺癌總體比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同臨床診斷組EGFR分型突變率比較[ n(%)]

2.2.2不同病理分型組EGFR分型突變率比較 肺腺癌組EGFR總突變率和L858R、19DEL 2種分型的突變率與肺鱗癌組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且肺腺癌突變率高于肺鱗癌組；T790M突變?cè)诜西[癌組中無(wú)陽(yáng)性樣本。肺腺癌組20INS、EGFR擴(kuò)增分型突變率與肺鱗癌組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的2種突變分型均為EGFR-TKI耐藥機(jī)制。見(jiàn)表2。

表2 不同病理分型組EGFR分型突變率比較[ n(%)]

2.2.3不同性別組EGFR分型突變率比較 不同性別組間EGFR基因總突變率，L858R、19DEL、20INS、T790M 4種分型突變率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，女性突變率均高于男性。不同性別組間EGFR擴(kuò)增突變率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同性別組EGFR分型突變率比較[ n(%)]

2.2.4不同標(biāo)本類型組EGFR分型突變率比較 血漿cfDNA組EGFR基因總突變率和各分子分型突變率與組織FFPE組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 組織FFPE組的總陽(yáng)性、L858R、19DEL、擴(kuò)增4種分型突變率略高于血漿cfDNA組，而20INS、T790M 2種分型突變率略低于血漿cfDNA組。見(jiàn)表4。20INS、T790M均為EGFR-TKI耐藥突變。拷貝數(shù)擴(kuò)增的檢測(cè)，需要樣本中具有較為完整的DNA片段。分析突變頻率不同的原因可能跟標(biāo)本臨床治療階段和標(biāo)本DNA的完整度有關(guān)。

表4 不同標(biāo)本類型的EGFR分型突變率比較[ n(%)]

2.3肺癌不同臨床組的EGFR基因突變數(shù)目分類特征 (1)按單突變和復(fù)合突變，肺腺癌和肺鱗癌的突變分型計(jì)數(shù)見(jiàn)表5。(2)按單突變和復(fù)合突變，有明確臨床診斷特征的EGFR突變陽(yáng)性肺癌患者的突變類型統(tǒng)計(jì)數(shù)目見(jiàn)表6。

表5 肺腺癌和肺鱗癌突變分型計(jì)數(shù)表

續(xù)表5 肺腺癌和肺鱗癌突變分型計(jì)數(shù)表

表6 肺癌臨床組EGFR基因突變數(shù)目分類計(jì)數(shù)表

3 討 論

EGFR是肺癌中首個(gè)具有臨床意義的驅(qū)動(dòng)基因，攜帶EGFR特定突變的肺癌患者，可能從靶向治療中獲益，從而延長(zhǎng)該類患者的無(wú)進(jìn)展生存期。本研究結(jié)果，河南地區(qū)895例肺癌患者EGFR突變率為53.97%，國(guó)內(nèi)已有報(bào)道的各地區(qū)肺癌患者EGFR基因突變率為20%～60%，主要影響因素可能有檢測(cè)技術(shù)、研究人群、地區(qū)和遺傳等[5-8]。本研究結(jié)果表明，在EGFR的總突變率方面，女性肺癌患者高于男性，肺腺癌高于肺鱗癌，中高分化肺癌高于低分化肺癌，與已有研究結(jié)果一致[7-9]。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，EGFR擴(kuò)增在性別之間及肺腺癌和肺鱗癌之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示EGFR基因突變率較低的男性或肺鱗癌患者，可關(guān)注EGFR擴(kuò)增，尋找新的診斷治療方案。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)EGFR分子分型在不同的患者和標(biāo)本類型中有不同的分布特征。

3.1不同臨床診斷組EGFR分子分型特征 EGFR分子分型在不同的臨床診斷組中有不同的分布特征。HAYASHI等[10]研究表明，轉(zhuǎn)移性、侵襲性腫瘤中EGFR突變率較高，并可能常與EGFR基因復(fù)合突變同時(shí)出現(xiàn)，本研究肺癌多發(fā)轉(zhuǎn)移組中，EGFR基因突變率比肺癌總體和其他臨床組更高，同時(shí)，單突變和復(fù)合突變發(fā)生數(shù)目最多的均為轉(zhuǎn)移性腫瘤組，與HAYASHI等[10]研究一致。本研究肺癌轉(zhuǎn)移患者的EGFR基因突變分型特征，表現(xiàn)在L858R、19DEL、EGFR擴(kuò)增3個(gè)分型的突變頻率比肺癌總體突變頻率高，L858R、19DEL為EGFR-TKI敏感突變，EGFR擴(kuò)增可能導(dǎo)致EGFR蛋白過(guò)表達(dá)，文獻(xiàn)報(bào)道其可能是EGFR-TKI治療的不利因素，需要在治療中增加EGFR單抗類藥物[11-12]。提示檢測(cè)EGFR基因突變的同時(shí)，檢測(cè)EGFR擴(kuò)增，可幫助肺癌轉(zhuǎn)移患者靶向治療制定全面的治療方案。

肺癌胸腔積液在晚期NSCLC患者的初診發(fā)生率為10%～15%，晚期NSCLC患者的胸腔積液與EGFR基因突變率有相關(guān)性[13]。本研究胸腔積液組EGFR基因突變率較高，與肺癌總體相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的突變?yōu)長(zhǎng)858R和T790M。T790M突變?yōu)橐淮投鶨GFR-TKI耐藥突變，三代EGFR-TKI敏感突變多為繼發(fā)突變，是常見(jiàn)的肺癌耐藥因素，也是更改靶向治療方案的主導(dǎo)因素。

3.2不同病理類型組EGFR分子分型特征 肺鱗癌和肺腺癌之間，EGFR基因突變分型特征主要體現(xiàn)在EGFR基因L858R和19DEL在肺腺癌中突變率較高，而EGFR基因擴(kuò)增突變率在肺鱗癌中與肺腺癌中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PI等[14]研究了晚期肺腺癌中EGFR基因突變，所有突變類型中EGFR 19DEL基因突變率占50.7%，21號(hào)外顯子L858R基因突變率占43.4%，本研究結(jié)果與之接近。肺鱗癌中EGFR拷貝數(shù)擴(kuò)增的突變率較高，其機(jī)制尚不明確。臨床數(shù)據(jù)表明，EGFR擴(kuò)增的NSCLC患者生存時(shí)間較無(wú)EGFR擴(kuò)增的患者短，但其與患者預(yù)后的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究[7]。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道，在早期肺癌、腺癌及非吸煙的女性患者中，EGFR 基因外顯子突變常同時(shí)伴有EGFR基因的擴(kuò)增[15]，本研究中，EGFR突變伴隨擴(kuò)增，主要發(fā)生在肺腺癌中，占復(fù)合突變總數(shù)的40.62%(13/32)，可能與肺癌進(jìn)展有關(guān)，而肺鱗癌中EGFR擴(kuò)增以單突變?yōu)橹鳌?/p>

3.3不同性別組EGFR分子分型特征 對(duì)比不同性別組間突變分型陽(yáng)性率，L858R/19DEL/20INS均有顯著差異，且女性較高，而T790M/擴(kuò)增無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，EGFR基因擴(kuò)增在男性中的數(shù)量高于女性?？芍行院团杂胁煌腅GFR基因突變分型特征，EGFR突變陰性的男性肺癌患者可關(guān)注EGFR基因擴(kuò)增的檢測(cè)，擴(kuò)大靶向治療指導(dǎo)用藥范圍。

3.4不同標(biāo)本類型組EGFR分子分型特征 液體活檢主要針對(duì)cfDNA和循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)。其中cfDNA是肺癌中研究最多、被廣泛采用的腫瘤基因分型來(lái)源，已經(jīng)進(jìn)入了檢測(cè)敏感和耐藥EGFR突變的臨床實(shí)踐。近幾年，通過(guò)下一代測(cè)序進(jìn)行更全面的血漿基因分型已被應(yīng)用于臨床，并從晚期/轉(zhuǎn)移性疾病轉(zhuǎn)移到新的前沿，如早期檢測(cè)和微小殘留病灶評(píng)估[16]。一項(xiàng)AURA試驗(yàn)的回顧性分析結(jié)果表明，液體活檢的EGFR基因突變與組織活檢的陽(yáng)性一致性為61%[17]，但本研究血漿標(biāo)本和組織標(biāo)本總突變率和各突變分型之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分析原因可能是臨床有選擇性送檢，血漿樣本主要來(lái)源為轉(zhuǎn)移性肺癌和耐藥后基因監(jiān)測(cè)，因而EGFR突變率升高，另外，高通量測(cè)序技術(shù)(NGS)的使用提高了檢測(cè)的靈敏度，可能檢出cfDNA中的低頻突變，使EGFR突變率升高。從EGFR分子分型來(lái)看，本研究cfDNA樣本比FFPE樣本中的T790M突變率高，但拷貝數(shù)擴(kuò)增和19DEL突變率較低，提示游離血漿中DNA碎片化，可能影響小片段擴(kuò)增或缺失突變的檢測(cè)。

EGFR基因檢測(cè)在肺癌臨床中主要用于指導(dǎo)靶向治療，但其突變分型特征和臨床應(yīng)用價(jià)值尚缺少?gòu)?qiáng)有力的臨床研究。本文闡述了河南地區(qū)EGFR基因突變分型的突變率特征，結(jié)果表明，不同患者有不同的EGFR突變分型特征，同時(shí)，NGS檢測(cè)EGFR突變分型具有檢測(cè)面廣、靈敏度高、可同時(shí)檢測(cè)多種突變類型等優(yōu)勢(shì)，游離血漿也可作為組織樣本的有效補(bǔ)充。但本研究缺少臨床治療相關(guān)資料，未來(lái)還需臨床治療數(shù)據(jù)對(duì)EGFR分子分型的臨床意義進(jìn)行驗(yàn)證。