加減薯蕷丸治療阿爾茨海默病藥理作用及分子機制研究*

馬崢玲，譚子虎,2△，尹茜茜，莊詩瑤，徐樂樂

(1.湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢 430065；2.湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430061)

阿爾茨海默病(AD)是最常見的癡呆類型，據估計2050年全球癡呆患者人數將達1.15億，其中約2/3為AD患者[1]。其患病群體龐大、醫(yī)療護理繁雜，給家庭和社會帶來沉重負擔。如何實現(xiàn)有效的神經再生，改善認知，提高患者及其家屬生活質量，是AD治療面臨的主要挑戰(zhàn)[2]。中醫(yī)論治癡呆歷史久遠且臨床行之有效，以整體調節(jié)、不良反應少等優(yōu)勢被廣泛關注[3]。

AD在中醫(yī)學中屬“癡呆”范疇，病機總歸脾腎虧虛，無以充養(yǎng)髓海，加之痰瘀阻竅，漸至髓減腦消，發(fā)為本病。薯蕷丸源于《金匱要略》，乃仲景“虛勞風氣百疾”之代表方，具有氣血同調、散收相因、功專理脾的特點[4]。本方由湖北省中醫(yī)院名老中醫(yī)呂繼端教授結合臨證經驗，去其祛風之性，酌加滋腎化瘀之品，加減用于臨床，取得較好療效。前期研究發(fā)現(xiàn)，加減薯蕷丸能有效改善AD患者認知功能和日常生活能力[5]，說明加減薯蕷丸對AD的潛在療效，具有廣泛的研究空間。為挖掘加減薯蕷丸對AD的潛在作用機制，本研究基于網絡藥理學對加減薯蕷丸干預AD可能的分子生物學機制進行探討，并通過分子對接技術對關鍵藥物成分及靶點進行驗證，旨在為后期進一步研究加減薯蕷丸干預AD作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料來源 使用中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/ tcmsp.php)檢索各中藥的化學成分，依據口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18進行篩選。TCMSP數據庫查詢所有活性成分靶標蛋白，經Uniprot蛋白數據庫(https://www.uniprot.org/)校正確定已驗證人源基因名稱。對TCMSP數據庫中未查詢到靶標蛋白的活性成分，利用PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)收集其結構信息，經 SwissTargetPrediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)行靶標預測，取可信度高的靶點。最后將通過上述方法收集到的加減薯蕷丸藥物活性化學成分與靶點進行匯總。

1.2檢索AD疾病靶點 基于GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數據庫(https://www.omim.org/)、Drugbank數據庫(https://go.drugbank.com/)、TTD數據庫(http://db.idrblab.net/ttd/)，以“Alzheimer disease”為搜索詞，檢索與疾病相關的作用靶點，將檢索得到的疾病靶點匯總去重。

1.3獲取加減薯蕷丸治療AD潛在靶點 將AD疾病基因與加減薯蕷丸作用靶點取交集，獲取共同靶點，即為加減薯蕷丸作用于AD的潛在作用靶點。然后通過Cytoscape 3.6.1軟件構建加減薯蕷丸治療AD的“中藥-活性成分-靶點”網絡，并進行分析。

1.4構建蛋白質相互作用網絡 將潛在靶點導入STRING數據庫(https://string-db.org/)，構建蛋白相互作用(PPI)網絡。使用Cytoscape 3.6.1軟件分析PPI結果，依據度值、介度值、中心度值等拓撲學分析結果篩選出核心網絡。

1.5基因本體(GO)功能富集分析和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 運用Metascape數據庫(http://metascape.org/gp/index.html)對交集基因行GO功能、KEGG通路富集分析。所得結果中活性成分靶點基因更集中的通路，被認為是加減薯蕷丸治療AD的重要調節(jié)通路。

1.6分子對接 運用AutoDockVina 1.5.6將加減薯蕷丸方中的關鍵化學成分和潛在作用靶點中度值排名前5的靶點進行分子對接試驗。使用PubChem數據庫下載核心化合物sdf結構文件，導入Chem 3D軟件調整化合物空間構想，保存為“mol 2”格式，經AutoDockVina 1.5.6分配電荷、設置可旋轉鍵后保存為“pdbqt”格式。

從PDB數據庫(http：//www.rcsb.org/)下載核心靶點的3D晶體結構，使用PyMol軟件去除靶蛋白水分子，分離原始配體和受體后導入AutoDockVina 1.5.6，加氫、分配電荷、添加原子類型后保存為“pdbqt”格式。使用AutoDockVina 1.5.6進行分子對接，計算結合能大小。

2 結 果

2.1加減薯蕷丸活性化學成分篩選 使用TCMSP數據庫篩選出加減薯蕷丸各味中藥符合條件的活性化學成分，其中白芍14個，白術7個，川芎7個，當歸2個，黨參21個，茯苓15個，枸杞子45個，山藥16個，石菖蒲4個，熟地2個，五味子8個，匯總去重后共獲得103個活性成分。經UniProt數據庫均一化獲得藥物靶點，去重后共獲得536個候選靶點。

2.2藥物-疾病交集靶點篩選 以“Alzheimer disease”為搜索詞，檢索GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD數據庫，篩選與疾病相關且可信度高的作用靶點，匯總去重后共獲得1 966個疾病靶點。

2.3中藥活性成分-作用靶點網絡構建及核心化合物分析 將2.1中篩選得到的536個候選作用靶點與AD疾病基因取交集，得到243個交集靶點，即加減薯蕷丸作用于AD的潛在作用靶點。通過對潛在靶點反向推導，得出藥物作用于AD的化合物共82個，使用Cytoscape 3.6.1軟件將82個化合物及243個交集靶點進行關聯(lián)，構建中藥活性成分-作用靶點網絡圖。發(fā)現(xiàn)作用靶點最多的前10個關鍵成分，依次為槲皮素、豬苓酸C、齒孔酸等，度值為19～100，具體見表1。故推測這些成分為加減薯蕷丸治療AD關鍵活性成分。

2.4PPI網絡構建及核心靶點篩選 將243個潛在作用靶點上傳至STRING數據庫即可得到PPI網絡圖，文件以“tsv”格式保存。保存的“tsv”文件上傳至Cytoscape 3.6.1軟件，先以度值大于2倍中位數初次篩選網絡，再以網絡中節(jié)點介度值(中位數為4.837)、中心度值(中位數為0.902)、度值(中位數為97)等參數大于中位數篩選得到核心靶點22個(圖1)。其中MAPK3、AKT1、腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素-6(IL-6)、VEGFA為度值排名前五的靶點基因。

2.5GO功能和KEGG通路富集分析 使用Metascape數據庫將取得的交集基因進行GO功能及KEGG通路富集分析。GO功能分析包括生物過程、細胞成分和分子功能3個水平，分別選取富集程度最高的前10個。在生物過程中，靶點主要涉及對氮化物的反應(cellular response to nitrogen compound)、炎癥應答(inflammatory response)及創(chuàng)傷反應(response to wounding)。在細胞組成中，靶點主要涉及膜閥(membrane raft)、樹突(dendrite)、突觸后膜(postsynapse)等。分子功能主要涉及G蛋白耦連胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、蛋白激酶連接(kinase binding)等。見圖2。

圖2 GO功能富集分析結果圖

KEGG通路富集分析選取富集程度最高的前20條通路，交集靶點主要富集于癌癥通路、晚期糖基化終產物(AGE)-RAGE信號通路、PI3K-AKT信號通路、神經活性配體-受體相互作用信號通路、麻疹通路、cAMP信號通路、NF-κB信號通路等，提示上述通路與加減薯蕷丸干預AD的發(fā)生、發(fā)展密切相關。見圖3。

圖3 KEGG通路富集分析結果圖

2.6分子對接驗證 依據2.3中篩選出的藥物干預AD的關鍵活性成分與2.4中度值排名前五的靶蛋白進行分子對接。當結合能小于0時，認為關鍵活性成分與靶蛋白可自由結合，且結合自由能越低，二者結合能力越強。結果顯示，主要成分與靶蛋白結合活性均較高。表明10種化合物均與靶蛋白受體間具有較佳的結合效能。見圖4。

圖4 加減薯蕷丸核心化合物與核心靶點對接結合能熱圖

3 討 論

加減薯蕷丸始于《金匱要略》，由呂繼端教授根據癡呆“脾腎虧虛、痰瘀互結”之病機加減而成。方中山藥、熟地、枸杞子、五味子健脾補腎、填精益髓，以資先天；黨參、白術、茯苓益氣健脾、化痰祛濕，以實中土；當歸、川芎養(yǎng)血活血，以祛瘀開竅；白芍斂陰柔肝以滋陰液不足。諸藥為伍，水土合補，痰瘀得除，從而延緩疾病進展。

從加減薯蕷丸活性成分-作用靶點網絡及分子對接結果中分析可知，2.3中篩選出的化合物可能為加減薯蕷丸干預AD的關鍵活性成分。槲皮素為一種黃酮醇，其神經保護作用在許多體內外試驗中得到證實。其可通過抗氧化應激、抗炎[6]、消除谷氨酸介導的興奮毒性[7]、抑制膽堿酯酶活性[8]、誘導自噬拮抗Aβ1-42介導的神經毒性[9]等途徑減輕AD癥狀。β-谷甾醇為白芍、當歸、枸杞子共有成分，可通過血-腦屏障在腦中積累，發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡和神經保護等生物學活性[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇可顯著降低APP/PS1小鼠Aβ40和Aβ42沉積、抑制BACE1的表達，增加樹突棘密度，改善APP/PS1小鼠行為學表現(xiàn)[11]。豆甾醇作為一種類固醇衍生物，易通過血-腦屏障，因其雙鍵結構易被氧化，可作為有效的抗過氧化劑，且豆甾醇可激活Erk-Creb信號，誘導突觸發(fā)生和增強突觸可塑性，改善記憶損傷，起到神經保護的作用[12]。

KEGG通路富集分析結果顯示，與AD相關的前三名通路分別為AGE-RAGE信號通路、PI3K-AKT信號通路、cAMP信號通路。AGE-RAGE信號通路在AD、糖尿病及其他年齡相關性疾病中破壞性影響十分突出[13]。研究發(fā)現(xiàn)，AGEs可直接或通過作用其受體RAGE激活小膠質細胞，誘導小膠質細胞釋放IL-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α，且RAGE受體活化后可進一步激活ROS相關的轉錄因子NF-κB等，從而導致炎性反應和氧化應激[14]，影響學習記憶功能。近年來，糖尿病腦病與 AD相關的說法逐漸被關注，而胰島素受體底物的主要下游途徑之一便是PI3K/AKT級聯(lián)反應[15]。PI3K/AKT信號通路是控制細胞存活、代謝、生長、分化的重要調控通路，在信號通路間的通信過程中起承轉作用。其對AD的作用不是單向的，一方面過度激活的PI3K/AKT通路在AD發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，致神經元過度活躍，傳遞錯誤信號，產生損傷，且抑制自噬對Aβ的清除作用，減少斑塊清除[16]；另一方面，有研究者在AD動物模型中觀察到PI3K/AKT信號通路被明顯抑制[17]，激活該信號通路可調節(jié)神經發(fā)生、提高AD模型鼠認知能力[17]。cAMP信號通路作為廣為人知的可調節(jié)學習及記憶功能的第二信使[18],其不僅能調節(jié)興奮性谷氨酰胺能和膽堿能突觸的可塑性，還可作用于突觸后膜的γ-氨基丁酸受體，抑制GABA能神經元的調節(jié)作用，從而提高學習和記憶能力[19]。

PPI網絡篩選出的核心靶點中，TNF與加減薯蕷丸各主要作用成分結合較其他靶點更緊密。TNF已被證明在中樞神經系統(tǒng)中具有重要功能，包括損傷介導的小膠質細胞和星形膠質細胞激活、血-腦屏障滲透性調節(jié)、谷氨酰胺的傳遞、突觸可塑性及突觸縮放的調節(jié)等[20]。有研究者在死亡AD患者大腦中發(fā)現(xiàn)淀粉樣斑塊周圍區(qū)域TNF水平升高[21],且外周血清TNF水平升高與AD疾病進展有關[22]。已有實驗驗證加減薯蕷丸可提高AD模型鼠學習記憶能力，其機制可能與海馬TNF-α表達被抑制相關[23]，進一步說明篩選結果的可靠性。

綜上所述，加減薯蕷丸可能通過槲皮素、豬苓酸C、齒孔酸、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇等活性成分，作用于MAPK3、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA等關鍵靶點，調控AGE-RAGE信號通路、PI3K-AKT信號通路、cAMP信號通路、NF-κB等信號通路，發(fā)揮抗感染、抗氧化應激、調節(jié)突觸可塑性、調控細胞凋亡等作用，體現(xiàn)了中醫(yī)藥干預疾病多成分、多靶點、多通路的作用特點。

AD是一種復雜的神經系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病與突觸可塑性改變、特定神經遞質減少、鈣超載、氧化應激、炎癥、細胞凋亡和神經元死亡等相關。使用單體成分對其治療作用有限，并伴有明顯賴藥性及顯著不良反應。而整體調節(jié)、多藥兼容為中醫(yī)治療的特色與精髓。加減薯蕷丸干預AD的臨床效果已得到有效驗證。但由于配方化學成分的復雜性，其作用機制尚未得到明確解釋。本研究結合網絡藥理學及分子對接等技術手段，通過全面系統(tǒng)地闡明加減薯蕷丸干預AD的神經保護作用潛在分子機制，為探索加減薯蕷丸藥理作用提供了參考。