蝦醬中風(fēng)味菌株的篩選及其發(fā)酵性能分析

羅美燕，劉喚明，香 江，蔣嘉慧，洪鵬志，鄧楚津，高 平

蝦醬中風(fēng)味菌株的篩選及其發(fā)酵性能分析

羅美燕1，劉喚明1，香 江1，蔣嘉慧1，洪鵬志1，鄧楚津1，高 平2

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 // 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 // 廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心，廣東 湛江 524088；2.湛江市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 湛江 524018）

【目的】分離鑒定廣東省湛江市水域養(yǎng)殖蝦為原料制作的傳統(tǒng)蝦醬發(fā)酵過程中的風(fēng)味菌株，分析其發(fā)酵能力，開發(fā)蝦醬風(fēng)味微生物資源?！痉椒ā坷脗鹘y(tǒng)純培養(yǎng)方法從凡納濱對蝦（）蝦頭醬中分離風(fēng)味微生物，分析菌株的生長性能以及產(chǎn)酶能力；利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析菌株發(fā)酵蝦頭酶解液中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)?！窘Y(jié)果】分離出的菌株FELA1、FELA2和FELA3經(jīng)鑒定，分別為深海微小桿菌（）、松鼠葡萄球菌（）和雞葡萄球菌（）。菌株FELA1、菌株FELA2和菌株FELA3最大耐受鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12%、21%和15%，最佳生長溫度分別為25、30和35 ℃。水解圈法分析可得，菌株FELA1能產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，菌株FELA2僅能產(chǎn)蛋白酶，菌株FELA3僅能產(chǎn)脂肪酶。GC-MS分析表明，添加菌株發(fā)酵酶解液的酮類、醇類和酯類物質(zhì)含量均顯著增加，F(xiàn)ELA1發(fā)酵液中烴類、胺類和吡嗪吡啶類物質(zhì)減少，F(xiàn)ELA2發(fā)酵液中烴類物質(zhì)和胺類物質(zhì)均增加，F(xiàn)ELA3發(fā)酵液醛類含量增加最多，但胺類物質(zhì)明顯減少?！窘Y(jié)論】添加分離菌株發(fā)酵能有效增強(qiáng)酶解液的風(fēng)味。

蝦醬，風(fēng)味菌株，發(fā)酵性能，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

傳統(tǒng)發(fā)酵水產(chǎn)品營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，是原料和環(huán)境中多種微生物共同作用的結(jié)果，其中一些風(fēng)味微生物對發(fā)酵水產(chǎn)品風(fēng)味的形成發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。為增強(qiáng)其風(fēng)味和口感，提高質(zhì)量，人工接種風(fēng)味微生物被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵水產(chǎn)品中，邊昊等[1]在沙蟹汁中加入植物乳桿菌和魯氏酵母復(fù)合發(fā)酵，明顯加強(qiáng)了沙蟹汁的風(fēng)味并改善了腥異味；Natteewan等[2]在魚露中加入發(fā)酵魚露來源的嗜鹽四鏈球菌和枝芽孢桿菌以提高其風(fēng)味和谷氨酸含量；Anh等[3]在魚露的發(fā)酵環(huán)境中分離出耐鹽海球菌，并加入魚露中發(fā)酵，以提高高鹽魚露的風(fēng)味和質(zhì)量。

蝦醬是一種常見的發(fā)酵水產(chǎn)品，由小型低值蝦或蝦下腳料經(jīng)過加鹽混合、搗碎、發(fā)酵數(shù)日而得，在環(huán)境及自身的微生物和酶的作用下，原料中的蛋白質(zhì)被分解產(chǎn)生肽和氨基酸，同時(shí)產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味[4]。蝦醬在制作過程中，質(zhì)量和風(fēng)味受氣溫、季節(jié)、地域等環(huán)境因素影響較大，目前國內(nèi)外針對蝦醬的研究主要集中在對發(fā)酵過程中發(fā)揮重要作用的微生物的研究。戴玲瑛[5]利用高通量測序技術(shù)分析連云港市蝦醬發(fā)酵中間產(chǎn)物的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，徐文歡等[6]從大連市蝦醬中分離出4種酵母菌并分析其碳源利用特性，Lyu等[7]分析錦州蝦醬在不同發(fā)酵時(shí)期的細(xì)菌群落變化與揮發(fā)性物質(zhì)的相關(guān)性。然而，以廣東省湛江市水域養(yǎng)殖的蝦為原料制作的傳統(tǒng)蝦醬發(fā)酵過程中風(fēng)味菌株的分離鑒定和應(yīng)用的研究鮮有報(bào)道。

本研究從以蝦頭為原料制作的傳統(tǒng)蝦醬中篩選增加風(fēng)味的菌株，采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行種屬鑒定，同時(shí)分析篩選菌株的發(fā)酵特性，以期提高蝦醬質(zhì)量，改善蝦醬風(fēng)味和口感，為發(fā)酵劑的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

凡納濱對蝦（）蝦頭，由廣東省湛江市國聯(lián)水產(chǎn)有限公司提供；海鹽，市售。

1.2 試劑

營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯：北京路橋技術(shù)股份有限公司；瓊脂粉：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；脫脂乳粉：新疆澳大利亞乳液有限公司；革蘭氏染色試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌通用引物27F和1492R：由上海生工生物工程股份有限公司合成；MightyAmp Buffer，MightyAmp DNA Polymerase：TAKARA生物工程有限公司；木瓜蛋白酶（20×104U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；2-甲基-3-庚酮（內(nèi)標(biāo)物GC）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 儀器

HZQ-F160恒溫振蕩培養(yǎng)箱：金壇市萬華實(shí)驗(yàn)儀器廠；HHS-11-6電熱恒溫水浴鍋，SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BM-400HP拍擊式均質(zhì)器：上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；Varioskan全自動(dòng)酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技有限公司；HH-8CJ數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋：常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；GCMS-TQ8050NX氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司；65 μm PDMS/DVB型萃取纖維：美國Supelco公司。

1.4 方法

1.4.1 傳統(tǒng)蝦醬的發(fā)酵 蝦頭，清洗晾干，加入30% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 海鹽攪碎，裝罐發(fā)酵，每天早晚（8:00、18:00）搗醬2次，發(fā)酵30 d即為傳統(tǒng)蝦醬成品，此外，并于0、2、3、6、9、12、18、24、30 d取樣待用。

1.4.2 蝦醬發(fā)酵過程中菌株的分離 菌株的分離采用稀釋涂布平板法，取10 g蝦醬于無菌袋中，加入90 mL無菌水拍打2 min，所得樣品勻液體積分?jǐn)?shù)即為10-1，繼續(xù)進(jìn)行10倍稀釋至10-4（體積分?jǐn)?shù)），選取3個(gè)適宜的稀釋度涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，于37 ℃培養(yǎng)24 h[8]，待長出菌株后，挑選形態(tài)不同的菌落進(jìn)行平板劃線，純化菌株，并將純化的菌株接種到斜面試管進(jìn)行保藏，編號為FELA1、FELA2和FELA3。

1.4.3 分離菌株的鑒定 形態(tài)觀察：篩選的菌落進(jìn)行平板劃線純化后，觀察平板中的單菌落形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定：采用16s rDNA測序方法，引物為細(xì)菌通用引物27F[9]和1492R[10]，PCR擴(kuò)增體系：2 × MightyAmp Buffer 30 μL，MightyAmp DNA Polymerase 1.5 μL，引物27F和1492R 各1.5 μL，ddH2O 25.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃復(fù)性15 s，68 ℃延伸90 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格的送至生工生物工程股份有限公司測序，測序結(jié)果提交至EZBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/)中進(jìn)行同源性檢索，選擇相似性高的模式菌株的16s rDNA序列進(jìn)行比對分析。

1.4.4 含鹽量對分離菌株生長的影響 取一環(huán)純培養(yǎng)物至100 mL營養(yǎng)肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后，接種10 μL至1 mL不同含鹽量（0%、3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%、24%、27%，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)）新鮮培養(yǎng)基中，混勻后取200 μL至96孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定其（600 nm）值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.5 溫度對分離菌株生長的影響 取一環(huán)純培養(yǎng)物至100 mL營養(yǎng)肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后，接種10 μL至1 mL新鮮培養(yǎng)基中，混勻后取200 μL至96孔板中，分別在20、25、30、35和40 ℃培養(yǎng)14 h，每間隔1 h測定其（600 nm）值，每個(gè)樣品重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)。

1.4.6 分離菌株產(chǎn)酶能力分析 產(chǎn)蛋白酶能力：4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）素瓊脂中按體積比1∶1加入10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）脫脂牛奶，混合后制成平板，挑取單菌落至平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察產(chǎn)水解透明圈情況，水解圈越大，產(chǎn)蛋白酶能力越強(qiáng)[11]。

產(chǎn)脂肪酶能力[7]：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中加入1%（體積分?jǐn)?shù)）甘油三丁酸酯和0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）羅丹明B（121 ℃滅菌30 min），挑取單菌落至平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察產(chǎn)水解透明圈情況[12]。

產(chǎn)淀粉酶能力：0.2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）可溶性淀粉在冷水中調(diào)成糊狀，加入1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）蛋白胨，0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氯化鈉，0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）牛肉膏，2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂粉（121 ℃滅菌20 min），挑取單菌落至平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后滴加盧戈氏碘液，觀察透明圈產(chǎn)生情況[13]。

1.4.7 蝦頭酶解 經(jīng)清洗晾干的蝦頭攪碎，按料液質(zhì)量（g）體積（mL）比1∶0.6，加入燒杯中，攪拌均勻，PH調(diào)至7.5，木瓜蛋白酶添加量為775 U/g，保鮮膜封口于42 ℃水浴鍋中保溫3 h，每間隔一段時(shí)間進(jìn)行攪拌，酶解結(jié)束后，100 ℃滅酶10 min，巴氏滅菌后備用[14]。

1.4.8 蝦頭酶解液發(fā)酵 將FELA1菌株、FELA2菌株和FELA3菌株分別接種到營養(yǎng)肉湯中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，吸取1 mL菌液再次接種新的營養(yǎng)肉湯，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后，得到初始菌液，8 000 r/min下離心10 min收集菌體，并用無菌水清洗2次，蝦頭酶解液溶解。分別按3%的接種量接種至已滅菌蝦頭酶解液中[15-16]，以不接菌的酶解液為空白對照（CK），30 ℃[17]恒溫培養(yǎng)2 d。

1.4.9 頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME-GC-MS）分析發(fā)酵液的揮發(fā)性風(fēng)味成分 準(zhǔn)確吸取5 mL樣品于20 mL頂空瓶中，加入1 μL內(nèi)標(biāo)物2-甲基-3-庚酮（0.816 0 mg/mL），磁力攪拌60 ℃水浴平衡10 min，相同條件下萃取30 min，后將萃取頭插入氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)樣口解析5 min。

氣相色譜條件：色譜柱為InertCap Pure-WAX；載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣；升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持1 min；以3 ℃/min的速率升至100 ℃，保持5 min；以5 ℃/min的速率升至230 ℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件：離子源EI，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍質(zhì)荷比（m/z）30 ～ 480，無溶劑切除時(shí)間。

1.5 數(shù)據(jù)處理

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定性和定量分析：利用NIST17數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，當(dāng)化合物相似大于80予以報(bào)道，根據(jù)化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)物2-甲基-3-庚酮的峰面積之比計(jì)算各化合物的含量（內(nèi)標(biāo)法），每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值表示。計(jì)算公式：

揮發(fā)性風(fēng)味成分質(zhì)量濃度（ng/mL）= 峰面積之比× 0.816÷5×1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選菌株的分離鑒定

利用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法從10個(gè)蝦醬樣品中分離菌株，最后鑒定出3株菌，分別編號為FELA1、FELA2和FELA3，菌落形態(tài)如表1所示。將3株菌的16s rDNA序列結(jié)果在EZBiocloud進(jìn)行比對，相似度均達(dá)98%以上，菌株FELA1、FELA2和FELA3鑒定為深海微小桿菌（）、松鼠葡萄球菌（）和雞葡萄球菌（）。

表1 分離菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)和16s rDNA 序列對比結(jié)果

2.2 FELA1、FELA2和LEFA3菌株特性分析

2.2.1 含鹽量對分離菌株生長的影響 由圖1可知，營養(yǎng)肉湯不添加NaCl時(shí)，三株菌生長量均最好，加鹽后，生長量明顯降低。當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于12%，菌株FELA1幾乎不能生長，當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于15%，菌株FELA3生長微弱，當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于24%時(shí)，菌株FELA2幾乎不生長。三條曲線的趨勢表明，三株菌在一定的鹽濃度下均能生長，菌株FELA2對鹽的耐受性強(qiáng)于菌株FELA1和菌株FELA3。

圖1 含鹽量對分離菌株生長的影響

2.2.2 溫度對分離菌株生長的影響 圖2顯示，溫度范圍為20 ～ 40 ℃，三株菌均能生長，且隨著溫度升高，生長速度呈增加趨勢。當(dāng)溫度為20 ～ 25 ℃時(shí)，菌株FELA1（圖2(A)）生長速度幾乎保持一致，但在25 ℃的環(huán)境下，生長量略升高。當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃，生長速度明顯加快，在40 ℃時(shí)生長最快，僅2 h進(jìn)入對數(shù)期，5 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，但隨著溫度升高其生長量逐漸減少。菌株FELA2（圖2(B)）的生長速度在35 ℃和40 ℃時(shí)差異較小，35 ℃培養(yǎng)時(shí)生長量高于40 ℃，溫度為30 ℃時(shí)，生長量最高。菌株FELA3（圖2(C)）在溫度低于30 ℃時(shí)生長速度較慢，14 h仍未進(jìn)入穩(wěn)定期，在達(dá)到35 ℃后，溫度升高，生長速度變化不明顯，但生長量降低，生長量在35 ℃時(shí)達(dá)到最大。綜上所述，菌株FELA1、菌株FELA2和菌株FELA3的最佳生長溫度分別為25、30和35 ℃。

2.2.3 分離菌株產(chǎn)酶能力分析 從表2可知，菌株FELA1的產(chǎn)酶綜合能力最強(qiáng)，能產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，菌株FELA2僅具有產(chǎn)蛋白酶能力，菌株FELA3僅具有產(chǎn)脂肪酶能力。在開發(fā)發(fā)酵劑時(shí)，業(yè)界通常選擇具有產(chǎn)酶能力的菌株作為發(fā)酵劑基礎(chǔ)，通過微生物菌株產(chǎn)生的蛋白酶分解原料中的蛋白質(zhì)形成小分子氨基酸及其他代謝產(chǎn)物[18]，產(chǎn)生的脂肪酶催化有機(jī)酸和乙醇生成酯類香氣物質(zhì)[12]，從而產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味。白妞妞等[19]認(rèn)為在魚露中加入產(chǎn)風(fēng)味蛋白酶的微生物是魚露發(fā)酵的關(guān)鍵因素，呂欣然等[20]從傳統(tǒng)錦州蝦醬中也分離出產(chǎn)蛋白酶的菌株。微生物中產(chǎn)生的淀粉酶能將原料中的淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖、麥芽糖等低聚糖[21]，王文娟等[22]從南極磷蝦（）中分離出乳酸假單胞菌也具有產(chǎn)淀粉酶能力。

圖2 溫度對分離菌株生長的影響

表2 分離菌株產(chǎn)酶能力分析

注：+表示有產(chǎn)酶能力，-表示無產(chǎn)酶能力。

Note：+ means with enzyme production ability, - means without enzyme production ability.

2.3 GC-MS分析不同菌株發(fā)酵蝦頭酶解液的揮發(fā)性風(fēng)味成分

酶解液發(fā)酵后鑒定出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)果如表3所示。不添加菌發(fā)酵的蝦頭酶解液共鑒定出108種揮發(fā)性物質(zhì)，添加FELA2菌株、FELA3菌株和FELA1菌株發(fā)酵的酶解液分別鑒定出103、94和108種揮發(fā)性物質(zhì)。添加菌株發(fā)酵酶解液，檢測出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類數(shù)量變化不大，但種類存在不同，3種接菌發(fā)酵液和空白酶解液中，酮類、醇類均為主要的揮發(fā)性物質(zhì)，空白酶解液的酯類較少，胺類物質(zhì)比添加菌株發(fā)酵的酶解液多。從揮發(fā)性物質(zhì)的含量分析，空白酶解液的揮發(fā)性物質(zhì)總質(zhì)量濃度為203.197 1 ng/mL，添加FELA2菌株、FELA3菌株和FELA1菌株發(fā)酵酶解液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為1 187.395 3、858.448 79、599.214 4 ng/mL，添加菌株發(fā)酵酶解液能增加揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量。

表3 4種酶解液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量和含量

4種酶解液的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)結(jié)果見表4。添加菌株發(fā)酵后，酮類的質(zhì)量濃度由21.727 5 ng/mL漲至258.842 2 ～ 577.893 6 ng/mL。在微生物和酶的作用下，脂質(zhì)發(fā)生降解、氧化和氨基酸降解使得酮類物質(zhì)的增加[23]，酮類物質(zhì)閾值較低，通常呈現(xiàn)出奶油香味[24]、清香等氣味。其中甲基酮類對水產(chǎn)品的風(fēng)味影響較大[17]，2-癸酮、2-壬酮、2-十一酮、2-十二酮、2-十三酮、2-十四酮、2-十五酮等甲基酮類構(gòu)成發(fā)酵液中酮類的主要物質(zhì)，賦予發(fā)酵液果香、奶油香、花香，且酮類物質(zhì)隨著碳鏈的增長，花香味特征增強(qiáng)[25]。香葉基丙酮和苯乙酮均存在于4種酶解液中，被認(rèn)為是成熟蝦醬中的主要酮類物質(zhì)[26]，其中香葉基丙酮表現(xiàn)為果香、蠟香。烯酮類物質(zhì)具有玫瑰葉香，F(xiàn)ELA1菌株發(fā)酵的酶解液檢測出3-癸烯-2-酮、5-甲基-5-辛烯-2-酮、(Z)-十一基-6-烯-2-酮、(Z)-7-十四碳烯-2-酮等物質(zhì)，F(xiàn)ELA2菌株發(fā)酵的酶解液檢測出5-甲基-5-辛烯-2-酮、(Z)-十一基-6-烯-2-酮、(Z)-7-十四碳烯-2-酮等烯酮物質(zhì)，F(xiàn)ELA3菌株發(fā)酵液檢測出6-烯十五碳-2-酮、（Z)-十一基-6-烯-2-酮、(Z)-7-十四碳烯-2-酮等，相比于空白酶解液，烯酮類物質(zhì)種類增加，含量升高，賦予發(fā)酵液獨(dú)特的風(fēng)味。酮類物質(zhì)在4種酶解液中均占主導(dǎo)地位，含量高，對發(fā)酵液的風(fēng)味貢獻(xiàn)極大。

醇類物質(zhì)在4種酶解液中同樣占據(jù)重要地位，質(zhì)量濃度在52.800 6 ～ 284.144 9 ng/mL之間，添加菌株發(fā)酵的酶解液，醇類含量顯著增加，主要以1-辛醇、1-癸醇、2-癸醇、2-十七醇和2-五癸醇為主，該醇類物質(zhì)具有花香、蠟香和蘑菇香味等，但飽和醇的感覺閾值較高，對發(fā)酵液的風(fēng)味貢獻(xiàn)較小，空白酶解液主要以2-乙基己醇、順-4-癸烯-1-醇和芳樟醇為主，其中2-乙基己醇具有花香[27]，芳樟醇具有鈴蘭香和檸檬香味[24]，1-辛烯-3-醇在空白酶解液中質(zhì)量濃度為0.457 9 ng/mL，具有蘑菇香和金屬味，含量較低時(shí)能改善風(fēng)味[25]。FELA2發(fā)酵液和空白酶解液中還檢測出十二醇，該物質(zhì)是煮蝦的重要香氣成分[28]，劉曉娟等[25]在木瓜蛋白酶酶解蝦頭的酶解液也檢測出十二醇。乙醇在4種酶解液中均被檢測出，可能是發(fā)酵過程中酵母的糖酵解產(chǎn)物，江津津等[29]認(rèn)為乙醇是魚露風(fēng)味物質(zhì)的前體，經(jīng)長期發(fā)酵后，可轉(zhuǎn)變?yōu)橥悺⑷╊?、酯類等其他風(fēng)味物質(zhì)。

表4 4種酶解液的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

注Note：“-”表示未檢測到- menans not detected

醛類物質(zhì)種類較少，含量低，但醛類物質(zhì)閾值較低[30]，對發(fā)酵液的風(fēng)味也有貢獻(xiàn)。添加菌株發(fā)酵的酶解液中均檢測出苯甲醛，該物質(zhì)是氨基酸Strecker反應(yīng)的產(chǎn)物，呈現(xiàn)令人愉快的堅(jiān)果香味[31]?？瞻酌附庖褐袡z測出辛醛，該物質(zhì)可能是脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，具有魚腥味和油脂味[27]，除了FELA2菌株發(fā)酵的酶解液，其他2種發(fā)酵液和空白酶解液中檢測出壬醛，壬醛呈現(xiàn)出脂肪味和青草味[32]。4種酶解液中醛類種類差異較大，可為后續(xù)篩選特征風(fēng)味物質(zhì)提供依據(jù)。

酯類一般有酯化反應(yīng)或脂質(zhì)氧化產(chǎn)生，通常具有果香味、甜香[33]，可增加水產(chǎn)品的風(fēng)味，閾值較低[34]，酶解液中檢測出大部分為乙酯，可能與高含量的乙醇與酸反應(yīng)有關(guān)[35]。FELA3菌株發(fā)酵的酶解液中檢測出5Z-十二烯醇乙酸酯和(Z,E)-9,11-十四碳二烯-1-醇乙酸酯質(zhì)量濃度達(dá)10.493 8 ng/mL和15.935 9 ng/mL，其賦予水產(chǎn)品果香甜味[17]，鄰苯二甲酸二丁酯在4種酶解液中檢測出，被認(rèn)為是原料包裝的污染物[27]。

4種酶解液中還檢測到了烴類、吡嗪吡啶類，胺類、酸類等，烴類物質(zhì)閾值較高[36]，在酶解液中含量較少，對其風(fēng)味貢獻(xiàn)極少。吡嗪類物質(zhì)主要來源于美拉德反應(yīng)和Strecker反應(yīng)，呈現(xiàn)出堅(jiān)果香和烤香味[17]，4種酶解液中檢測出的2,6-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪含量不高，但此類物質(zhì)閾值較低，對酶解液風(fēng)味有一定的影響，同時(shí)這些物質(zhì)也在蝦醬發(fā)酵過程中被報(bào)道，被認(rèn)為可賦予水產(chǎn)品良好的風(fēng)味[26]。胺類物質(zhì)如三甲胺等是判定水產(chǎn)品新鮮程度的物質(zhì)，具有魚腥味和氨臭味[34]，F(xiàn)ELA2菌株和FELA1菌株發(fā)酵的酶解液中檢出三甲胺質(zhì)量濃度分別達(dá)到16.072 3 ng/mL和1.760 6 ng/mL。吲哚是成熟蝦的特征風(fēng)味之一[26]，除了FELA2菌株發(fā)酵液，其他2種發(fā)酵液和空白酶解液均被檢測出。

3 結(jié)論

從傳統(tǒng)制作的蝦醬中篩選出3株菌FELA1、FELA2和FELA3，經(jīng)形態(tài)觀察和分子生物學(xué)分析鑒定分別為深海微小桿菌（）、松鼠葡萄球菌（）和雞葡萄球菌（）。三株菌均具有一定的耐鹽性和產(chǎn)酶能力，最佳生長溫度為25 ～ 35 ℃。利用三株菌分別發(fā)酵蝦頭酶解液，經(jīng)GC-MS分析，添加菌株發(fā)酵酶解液的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量遠(yuǎn)高于無添加菌株發(fā)酵的酶解液，其中酮類、醇類和酯類物質(zhì)的含量在3種添加菌株發(fā)酵的酶解液增加，并占據(jù)主導(dǎo)地位。此外，F(xiàn)ELA1發(fā)酵液中烴類、胺類和吡嗪吡啶類物質(zhì)減少，F(xiàn)ELA2發(fā)酵液中烴類物質(zhì)和胺類物質(zhì)均增加，F(xiàn)ELA3發(fā)酵液醛類含量增加最多，但胺類物質(zhì)明顯減少。添加菌株發(fā)酵酶解液后，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量均發(fā)生變化。

[1] 邊昊, 陳柏宇, 李銳.微生物復(fù)合發(fā)酵沙蟹汁的制備工藝優(yōu)化及其風(fēng)味研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2021, 47(15): 234-241.

[2] UDOMSIL N, CHEN S, RODTONG S, et al.Improvement of fish sauce quality by combined inoculation ofMS33 andsp.SK37[J].Food Control, 2017, 73: 930-938.

[3] DO QUYNH NGUYEN A, SEKAR A, KIM M, et al.Fish sauce fermentation usingSPQ isolate as a starter culture[J].Food Science & Nutrition, 2020, 9(2): 651-661.

[4] WANG Y Q, LI C S, ZHAO Y Q, et al.Novel insight into the formation mechanism of volatile flavor in Chinese fish sauce (Yu-lu) based on molecular sensory and metagenomics analyses[J].Food Chemistry, 2020, 323: 126839.

[5] 戴玲瑛, 齊曼婷, 王立梅, 等.蝦醬中間產(chǎn)物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性[J].食品科學(xué), 2018, 39(22): 173-178.

[6] 徐文歡, 吳若菡, 李采嬋, 等.傳統(tǒng)蝦醬中酵母菌分離鑒定及碳源利用特性[J].中國食品學(xué)報(bào), 2021, 21(4): 303-309.

[7] LYU X R, LI Y, CUI T Q, et al.Bacterial community succession and volatile compound changes during fermentation of shrimp paste from Chinese Jinzhou region[J].LWT, 2020, 122: 108998.

[8] OUOBA L I I, VOUIDIBIO MBOZO A B, ANYOGU A, et al.Environmental heterogeneity ofspecies from alkaline fermented foods and associated toxins and antimicrobial resistance genetic elements[J].International Journal of Food Microbiology, 2019, 311: 108356.

[9] UQAB B, NAZIR R, AHMAD GANAI B, et al.MALDI-TOF-MS and 16S rRNA characterization of lead tolerant metallophile bacteria isolated from saffron soils of Kashmir for their sequestration potential[J].Saudi Journal of Biological Sciences, 2020, 27(8): 2047-2053.

[10] TAKAHASHI N, NAGAI S, FUJITA A, et al.Discrimination of psychrotolerantgroup based on MALDI-TOF MS analysis of ribosomal subunit proteins[J].Food Microbiology, 2020, 91: 103542.

[11] GUAN L, CHO K H, LEE J H.Analysis of the cultivable bacterial community in jeotgal, a Korean salted and fermented seafood, and identification of its dominant bacteria[J].Food Microbiology, 2011, 28(1): 101-113.

[12] 劉延波, 邢星月, 趙志軍, 等.高產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].中國釀造, 2019, 38(7): 54-59.

[13] SAAD W F, OTHMAN A M, ABDEL-FATTAH M, et al.Response surface methodology as an approach for optimization of α-amylase production by the new isolated thermotolerantWF67 strain in submerged fermentation[J].Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2021, 32: 101944.

[14] 陳麗花, 史旭雯, 肖作兵, 等.對蝦頭的酶解研究[J].食品科學(xué), 2008, 29(2): 261-265.

[15] 周晶, 袁麗, 高瑞昌.產(chǎn)低溫蛋白酶動(dòng)性球菌的篩選及其在低鹽魚露發(fā)酵中的應(yīng)用[J].食品科學(xué), 2021, 42(8): 122-128.

[16] 連鑫.傳統(tǒng)蝦醬中風(fēng)味微生物的分離及快速發(fā)酵技術(shù)的研究[D].湛江: 廣東海洋大學(xué), 2014.

[17] 孟凌玉.蝦頭酶解產(chǎn)物微生物混合發(fā)酵工藝及其風(fēng)味成分的變化[D].湛江: 廣東海洋大學(xué), 2013.

[18] 孫海鑫, 陳智慧, 王盛美, 等.發(fā)酵魚中菌群組成及發(fā)酵特性研究進(jìn)展[J/OL].食品工業(yè)科技:1-12(2121-07-05) [2021-11-25].https://kns.cnki.net/ kcms/detail/detail.aspx.DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2021030067.

[19] 白妞妞, 白鍇凱, 何建林, 等.魚露發(fā)酵技術(shù)及風(fēng)味研究進(jìn)展[J].中國調(diào)味品, 2021, 46(2): 175-179.

[20] 呂欣然, 李瑩, 馬歡歡, 等.傳統(tǒng)錦州蝦醬中產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌的分離與鑒定[J].食品工業(yè)科技, 2016, 37(7): 121-125.

[21] 周新尚, 逄飛, 竇少華, 等.海洋低溫淀粉酶菌株的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].中國釀造, 2017, 36(8): 57-61.

[22] 王文娟, 劉志東, 寧喜斌.南極磷蝦產(chǎn)低溫淀粉酶菌株的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2019, 45(19): 38-44.

[23] 王琦, 岳大鵬, 王然然, 等.風(fēng)干金鯧魚制品加工過程中脂質(zhì)氧化和揮發(fā)性成分的變化[J].食品工業(yè)科技, 2021, 42(1): 54-60.

[24] 尹樂斌, 楊瑩, 陳浩, 等.固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測定湘派豆干老鹵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化[J].中國調(diào)味品, 2021, 46(8): 147-154.

[25] 劉曉娟, 杜征, 趙力超, 等.HS-SPME-GC-MS分析毛蝦酶解液揮發(fā)性成分[J].食品科學(xué), 2012, 33(14): 175-180.

[26] 尹超.蝦醬發(fā)酵過程中菌相變化規(guī)律及對風(fēng)味形成的影響[D].青島: 青島科技大學(xué), 2019.

[27] 余遠(yuǎn)江, 龐一揚(yáng), 袁桃靜, 等.基于電子鼻、HS-GC-IMS和HS-SPME-GC-MS分析五種水產(chǎn)原料的風(fēng)味特征[J].食品工業(yè)科技, 2021, 42(19): 106-117.

[28] 孫寶國, 陳海濤.食用調(diào)香術(shù): 第三版[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2015: 214.

[29] 江津津, 嚴(yán)靜, 鄭玉璽, 等.不同產(chǎn)地傳統(tǒng)魚露風(fēng)味特征差異分析[J].食品科學(xué), 2021, 42(12): 206-214.

[30] 張沙沙, 羅曉莉, 曹晶晶, 等.電子鼻結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析松茸減壓貯藏過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分變化[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2020, 46(14): 243-248.

[31] 范秀萍, 秦小明, 章超樺, 等.珍珠龍膽石斑魚肌肉營養(yǎng)成分與揮發(fā)性風(fēng)味成分的分析與評價(jià)[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 38(1): 39-46.

[32] 馬雙, 郝淑賢, 李來好, 等.基于主成分分析的六種魚子醬揮發(fā)性成分評價(jià)[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2020, 46(11): 269-276.

[33] 劉鑫, 樸春香, 鞠銘, 等.基于SPME-GC-MS電子鼻電子舌技術(shù)聯(lián)用對不同替代鹽干腌火腿風(fēng)味成分進(jìn)行表征[J/OL].食品科學(xué):1-24 (2121-07-27) [2021-12-01].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20210727.0912.012.html.DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20210427-381.

[34] 章雪琴.南極磷蝦微生物混合發(fā)酵制備呈味基料的研究[D].湛江: 廣東海洋大學(xué), 2018.

[35] 陳麗麗, 白春清, 袁美蘭, 等.全二維氣相色譜-質(zhì)譜法對魚露發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分分析[J].食品科學(xué), 2020, 41(22): 238-244.

[36] 刁玉段.草魚肉氣味形成機(jī)理初步探究[D].上海: 上海海洋大學(xué), 2017.

Isolation of Flavor Strains in Shrimp Paste and Analysis of Fermentation Characteristic

LUO Mei-yan1, LIU Huan-ming1, XIANG Jiang1, JIANG Jia-hui1, HONG Peng-zhi1, DENG Chu-jin1, GAO Ping2

（1.//////,524088,; 2.,524018,）

【Objective】Toisolate and identify the flavor strains in the fermentation process of traditional shrimp sauce made from farmed shrimp in Zhanjiang, Guangdong, and to analyze the fermentation characteristics, and development of the flavor microbial resources of shrimp sauce.【Methods】The traditional culture-based method was used to isolate the flavor microorganisms from head paste of the shrimp, and the growth characteristic and enzyme production ability of the strains were analyzed.Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was used to analyze the volatile flavor compounds of fermentation of shrimp head hydrolysate by isolated strains.【Result】The three isolated strains (FELA1, FELA2 and FELA3) were,and, respectively.Strain FELA1, strain FELA2 and strain FELA3 were tolerant to 12%, 21% and 15% salt concentration and the optimal growth temperatures were 25, 30 and 35 ℃, respectively.According to hydrolytic circle analysis, strain FELA1 could produce protease lipase and amylase.Strain FELA2 could only produce protease, and strain FELA3 could only produce lipase.GC-MS analysis showed that the contents of ketones, alcohols and esters in hydrolysates fermented with added strain were significantly increased.The contents of olefin, amines, pyrazines and pyridines were decreased in FELA1 fermentation broth, the contents of olefin and amines were increased in FELA2 fermentation broth, the contents of aldehydes increased in FELA3 fermentation broth, while the contents of amines decreased significantly.【Conclusion】Addition of isolated strain could improve the flavor of enzymatic hydrolysate.

shrimp paste，flavor strains，fermentation characteristic，GC-MS，volatile flavor compounds

Q939.11

A

1673-9159（2022）02-0079-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.02.010

2021-10-02

湛江市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2019A03021）；南方海洋科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湛江）資助項(xiàng)目（ZJW-2019-07）；湛江市海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展示范市建設(shè)項(xiàng)目（2017C8B1）；廣東省普通高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2021KCXTD021）

羅美燕（1997―），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與貯藏。E-mail: 18807647789@163.com

劉喚明（1978―），男，碩士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工。E-mail: Liu241253@gdou.edu.cn

羅美燕，劉喚明，香江，等.蝦醬中風(fēng)味菌株的篩選及其發(fā)酵性能分析[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，42（2）：79-87.

（責(zé)任編輯：劉朏）