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    潛在性藥物靶點PARP16的研究進展*

    2022-03-31 02:11:04吳見樂盧小路邊水根朱金妹
    生物化學與生物物理進展 2022年3期

    吳見樂 盧小路 邊水根 朱金妹 張 進 江 峰* 李 健*

    (1)贛南醫(yī)學院康復學院,贛州341000;2)贛南醫(yī)學院藥學院,贛州341000;3)贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院,贛州341000;4)大余縣人民醫(yī)院,贛州341500;5)南昌大學基礎醫(yī)學院,南昌330031)

    PARP16(也稱為diphtheria toxin-like ART15,ARTD15)是單ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶[1],其功能是通過對底物NAD+催化,然后將單個ADP-核糖轉(zhuǎn)移到靶蛋白的特定氨基酸殘基上[2]。PARP16 可以通過對靶蛋白修飾,改變其生物活性,參與機體內(nèi)許多細胞的調(diào)節(jié),從而影響癌癥、囊性纖維化、心血管疾病等的發(fā)生與發(fā)展。近年來針對PARP16的小分子抑制劑不斷出現(xiàn),表明PARP16作為一個潛在性的藥物靶點已經(jīng)成為研究熱點。本文主要綜述PARP16 目前已解析的結構、相關疾病以及已有的小分子抑制劑,展望PARP16作為潛在藥物靶點的未來發(fā)展方向。

    1 PARP16的催化結構域

    PARP16 與聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly(adenosinediphosphate-ribose) polymerase,PARP)家族的其他成員相比,有兩個明顯不同的特征:a.PARP16 是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜錨定蛋白;b.它是唯一已知有C端跨膜區(qū)和N端胞質(zhì)催化結構域的家族成員[1,3]。作為已發(fā)現(xiàn)的PARP 家族成員中分子質(zhì)量最小的一員,PARP16 含有322 個氨基酸。其N端區(qū)域(氨基酸1~280)位于細胞質(zhì),C 端尾部(氨 基 酸300~322) 位 于 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) 腔 跨 膜 區(qū)[3]。Karlberg 等[2]解析了PARP16 的晶體結構,結構表明PARP16 的N 端催化結構域是由6 個α 螺旋形成的不規(guī)則束狀結構,與其他PARP家族成員的催化結構域氨基酸序列同源性不高。在結構上PARP16由3 個部分組成,分別為螺旋結構域(helical domain,HD;氨基酸5~91)、ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶催化結構域(ADP-ribosyltransferase,ART;氨基酸94~279) 以 及 跨 膜 區(qū)(transmembrane motif,TM;氨基酸288~308)[2](圖1a)。大多數(shù)PARP家族成員的ART 結構域中有一個與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的結合位點,叫做組氨酸-酪氨酸-谷氨酸(H-Y-E)基序,而PARP16 的H-Y-E 基序中沒有谷氨酸(E),與NAD+的結合位點是組氨酸H152,酪氨酸Y182 和Y254[2,4]。研究發(fā)現(xiàn),PARP家族成員中多ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的HD有參與到與NAD+的結合過程中,比如PARP1/2/3的HD靠近其ART 結合位點并且在其上方,從而阻止與NAD+的結合[5-7]。Karlberg 等[2]解析的PARP16 晶體結構表明,PARP16的HD不靠近NAD+的結合位點,因此他們提出了兩個關于HD 可能參與到NAD+結合的過程:a.PARP16 ART 中α2 和β3 鏈的氨基酸(Y193、Ⅰ208)與PARP16 HD的α2′鏈氨基酸之間形成的疏水作用,從而影響其與NAD+的結合;b.PARP16 HD 中的α2′鏈氨基酸與ART 中的環(huán)-螺旋-環(huán)基序通過疏水作用堆積在ART的α1鏈,從而影響二者的結合。

    Fig.1 Structure of PARP16圖1 PARP16的結構

    2 PARP16的功能與其所介導的相關疾病

    PARP 家族成員的主要功能是將細胞中NAD+的ADP-核糖轉(zhuǎn)移到靶蛋白的氨基酸殘基上,其連接方式主要是通過酯鍵。一般來說,將轉(zhuǎn)移一個ADP-核糖的PARP 家族成員稱為單ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶,轉(zhuǎn)移多個相同的ADP-核糖形成聚腺苷二磷酸核糖(Poly(ADP-ribose)PAR)鏈稱為多ADP-核糖轉(zhuǎn)移基轉(zhuǎn)移酶[8-10]。而PARP16屬于單ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶,可將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號傳給NAD+,與NAD+的結合位點是由其催化結構域中的H152、Y182 和Y254 構成[2]。PARP16 的C 端是發(fā)揮上述功能所必要的,它可以將信號轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)催化結構域,然后再傳導給下游信號分子[1]。與其他單ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶不同,PARP16 并不是將ADP-核糖轉(zhuǎn)移到靶蛋白的精氨酸或半胱氨酸殘基[3],其靶蛋白的特定氨基酸主要是天冬氨酸(D)、谷氨酸及酪氨酸[8]。PARP16 可以激活由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激下引起的未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)的兩個壓力傳感器:蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK) 和肌醇需求酶1α(ⅠRE1α)[1]。通過對其ADP-核糖基化使葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GPR78/BiP)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)分離,從而使PERK 和ⅠRE1α 發(fā)生磷酸化[11-12]。同時PARP16還參與對核轉(zhuǎn)運蛋白β1(Kapβ1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管緊張素ⅠⅠ(AngⅠⅠ)的單ADP-核糖基化[13-15]。通過對上述靶蛋白的修飾,PARP16參與了腫瘤、高血壓等疾病的發(fā)生與發(fā)展。

    2.1 PARP16與癌癥等疾病密切相關

    越來越多的證據(jù)表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是調(diào)節(jié)多種癌癥的關鍵因素之一,其中ⅠER1α和PERK分別參與乳腺癌、肝癌和大腸癌等疾病的調(diào)節(jié)[16-18]。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊或者折疊錯誤的蛋白質(zhì)增多時,就會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時間正常時,機體中的UPR 通過ATF6、PERK 和ⅠRE1α 三個壓力傳感器來維護內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)[19]。但如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過強或者時間過長就導致UPR 無法維護內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài),使UPR 通過上述三個壓力傳感器傳導給下游凋亡信號通路,將保護細胞機制轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎蛲鰴C制,這是調(diào)節(jié)癌細胞進程的關鍵因素之一[20]。PARP16 可以通過對UPR 壓力傳感器PERK 和ⅠRE1α 的單ADP-核糖基化從而調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,影響癌癥的進程[1,21]。此外,PARP16還參與對Kapβ1的單ADP-核糖基化,有相關研究發(fā)現(xiàn),Kapβ1 與核轉(zhuǎn)運蛋白α(Kapα)以及核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)組成復合物將腫瘤抑制因子P53通過核孔復合體運輸?shù)郊毎?;而Kapβ1 作為P53 核導入的關鍵因素,當其活性發(fā)生改變可能會導致P53的細胞內(nèi)定位發(fā)生錯誤,從而影響機體腫瘤細胞的進程。因此PARP16 可通過對Kapβ1 活性的調(diào)節(jié)從而對腫瘤的發(fā)生與發(fā)展產(chǎn)生影響[14]。

    2.2 PARP16與心血管疾病密切相關

    研究表明,導致動脈粥樣硬化、高血壓和缺血性心臟病等心血管疾病的重要因素之一是血管內(nèi)皮細胞衰老和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[22-23]。AngⅠⅠ作為導致動脈粥樣硬化和高血壓的主要激素,可以促進血管內(nèi)皮細胞衰老和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[24-25]。Yang等[13]的研究表明,PARP16 作為上游信號分子可以調(diào)節(jié)AngⅠⅠ活性以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,從而影響心血管疾病。他們還發(fā)現(xiàn),Smyd3作為一種賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶,通過結合到PARP16 基因的啟動子區(qū),然后增加PARP16的活性從而增強AngⅠⅠ的活性[13]。除此之外,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)也是上述心血管疾病的重要影響因素之一,其功能是通過促進血管生成從而調(diào)節(jié)血管張力以及壓力[26]。VEGF 的生物活性在多個水平上受到嚴格控制,包括涉及翻譯后修飾的過程,其中ADP-核糖基化是影響VEGF 生物活性的最重要因素之一[27-28]。由于VEGF是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體進行加工和修飾,PARP16 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中對VEGF 先進行單ADP-核糖基化,這是VEGF 進行多ADP-核糖基化的先決條件,之后位于高爾基體的端錨聚合酶(TNKS2多ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶)再對VEGF 進行多ADP-核糖基化[29]。因此,VEGF 的ADP-核糖基化由PARP16 和TNKS2 共同介導,PARP16 可能通過調(diào)節(jié)VEGF 的活性從而影響心血管疾?。?5]。

    2.3 PARP16介導囊性纖維化疾病

    囊性纖維化(cystic fibrosis,CF)是一種致死性的遺傳疾病,最常見的原因是由囊性纖維化跨膜調(diào) 節(jié) 因 子 (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR) 中 的 基 因 片 段F508del突變引起的[30]。據(jù)表明,UPR中壓力傳感器ⅠRE1α 的活性與CF 存在密切關系[31],當CFTR發(fā)生突變時就會導致氯離子通道發(fā)生失常,引起機體內(nèi)大量未折疊或者折疊錯誤的蛋白質(zhì)進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)[32-33]。從而導致ⅠRE1α的核糖核酸內(nèi)切酶活性被激活,并通過XBP1信號通路來維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡[34]。但是由于ⅠRE1α 活性過強而導致機體內(nèi)的巨噬細胞糖酵解速率、ATP消耗以及代謝增加造成機體能量消耗過大[35]。因此,機體較長時間處于能量不足就會引起以慢性疲勞、營養(yǎng)不良和呼吸衰竭為特征的囊性纖維化疾?。?2]。Carlile等[31]的研究發(fā)現(xiàn),PARP16 可以通過對ⅠRE1α 單ADP-核糖基化增強其活性,參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激去調(diào)節(jié)CF 的進程,表明其可能通過參與ⅠRE1α-XBP1信號通路從而介導CF疾病.

    3 PARP16的小分子抑制劑及其晶體結構研究

    目前發(fā)現(xiàn),PARP 家族成員的多個抑制劑,這些抑制劑大多是關于聚腺苷二磷酸核糖基化轉(zhuǎn)移酶小分子抑制劑。比如已經(jīng)通過臨床試驗而獲批上市的PARP1和PARP2抑制劑(奧拉帕利、魯卡帕尼、尼拉帕利、他拉唑帕尼和氟唑帕利[36]),以及靶向PARP16 的抑制劑Latonduine 衍生物和EGCG 等[31,37-38](圖2)。在PDB 蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)庫中也有PARP16 的4 個小分子抑制劑,其與PARP16 之間形成的結合口袋和表面靜電勢分布已被解析(圖3)。

    3.1 PARP16與小分子抑制劑的共結晶結構

    Karlberg等[2]在2012年解析了PARP16與3-氨基苯甲酰胺的晶體結構(PDB:4F0D,圖4a),結構表明:PARP16 中G153 與該化合物分別形成2.6 ? 和3.2 ? 的氫鍵作用力,而其H152、Y193 與該化合物則形成范德華力。結構表明,PARP16 與NAD+結合的H-Y-E 基序的第3 個氨基酸被Y254 取代,其作用是穩(wěn)定兩者的結合中間體,說明PARP16具有ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性,可被PARP抑制劑煙酰胺類似物抑制。

    Karlberg 等在2018 年 解析了PARP16 與2-[4-[(2S,3S,4R,5R)-5-(6-氨基嘌呤-9-基)-3,4-雙(氧化氧烷基)氧雜戊-2-基]羰基哌嗪-1-基]-N-(1-氧化亞烷基-2,3-二氫異吲哚-4-基)乙酰的晶體結構(PDB:6HXR,圖4b),結構表明:該化合物與PARP16 H152形成2.7 ?的氫鍵作用力、與Y153分別形成2.9 ? 和3.1 ? 的兩對氫鍵、與S154 側鏈形成2.7 ?的氫鍵、與S161分別形成2.9 ?和3.3 ?的兩對氫鍵作用力、與G166 形成2.8 ? 的氫鍵作用力、與H168側鏈形成3.1 ?的氫鍵作用力。

    Karlberg 等在2018 年還解析了PARP16 與碳煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的晶體結構(PDB:6HXS,圖4c),結構表明:該化合物與PARP16 S154 的側鏈形成2.8 ? 的氫鍵、與S161 形成兩對分別為2.8 ?和3.3 ?的氫鍵、與G166形成2.8 ?的氫鍵作用力、與H170的側鏈形成3.1 ?的氫鍵作用力、與PARP16 N158、Y182 形成水介導的氫鍵相互作用力。

    Fig.2 Small molecule inhibitors of PARP16圖2 PARP16的小分子抑制劑

    Fig.3 Binding pockets and electrostatic potential surface distribution of PARP16-inhibitors圖3 PARP16與抑制劑的結合口袋和表面靜電勢分布

    Fig.4 Structures of PARP16 with small molecule inhibitors圖4 小分子抑制劑與PARP16的結構

    Wigle 等[39]在2020 年解析了PARP16 與5-{5-[(哌啶-4-基)氧基]-2H-異吲哚-2-基}-4-(三氟甲基)噠嗪-3(2H)酮(RBN01086)的晶體結構(PDB:6W65,圖4d),結構表明:該化合物與PARP16主要通過G153 進行結合,與G153 形成兩對2.7 ? 的直接氫鍵作用力和一對水介導的氫鍵。

    PARP16 與這些小分子抑制劑的結構解析和研究在分子水平闡述了它們的分子機理和構效關系,為進一步研發(fā)出親和力強、特異性高、副作用小的抑制劑提供了堅實的結構基礎。

    3.2 Latonduine衍生物

    Carlile 等[31]發(fā)現(xiàn),Latonduine 衍生物對引起CF 的基因片段F508del-CFTR 校正具有較好的效果,其主要作用是通過抑制PARP3、PARP16 的活性 從 而 介 導CF[37,40]。他 們 通 過 比 較 發(fā) 現(xiàn),MCG315(圖2 Latonduine衍生物1)體外抑制的校正效果最好,其中MCG315對抑制PARP16的活性達到97%。主要原因是PARP16與ADP結合位點煙酰胺口袋由亮氨酸(L)和酪氨酸組成,形成的略大口袋能夠讓MCG315 更深地嵌入[31]。之后Centko 等[37]比較了不同的Latonduine 衍生物在體外分別對PARP3 以及PARP16 的抑制,發(fā)現(xiàn)了對PARP16更強的抑制劑。在檢測中,發(fā)現(xiàn)Latonduin A 與Latonduine 衍生物2(圖2)有相似的IC50值(分別為10.427 μmol/L、60.362 μmol/L),在體外LatonduinA 對PARP16 的活性抑制達到95%,Latonduine 衍生物2 對PARP16 的抑制幾乎達到100%。他們還指出,雖然Latonduine 衍生物2 對PARP16 的抑制性較好,但治療CF 需要同時抑制PARP3 與PARP16 的 活 性,Latonduine 衍 生 物 如MCG315 與魯瑪卡托(VX809)結合可能是治療CF的一種最佳手段[37]。

    3.3 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)

    綠茶中豐富的表兒茶素沒食子酸酯(ECG)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)(圖2)具有廣泛的藥理學作用,如化學預防、抗癌、抗感染等[41-42]。吳家雪研究團隊[38]通過篩選多種抑制PARP16 活性的化合物發(fā)現(xiàn),ECG 的抑制效果較好,在體外能夠完全抑制PARP16,表明ECG是其潛在抑制劑。后來,該研究團隊使用朗繆爾反應模型擬合結合曲線,根據(jù)其結合動力學常數(shù)發(fā)現(xiàn),PARP16分別與ECG和EGCG結合時,其解離常數(shù)(Kd)分別為3.41 nmol/L和6.16 nmol/L,表明其與ECG 和EGCG 都具有高親和力。ECG 和EGCG 在體 外 對PARP16 的IC50分 別 為47.18 μmol/L 和14.52 μmol/L。因此,他們認為EGCG 是PARP16更好的潛在抑制劑。研究也表明,EGCG作為一種潛在的抑制劑,通過對PARP16活性抑制介導癌細胞的凋亡。先前的研究發(fā)現(xiàn),由于在人體腸道容易被吸收,口服單純的EGCG會導致其生物利用度很低[43]。Gan 等[44]發(fā)現(xiàn),EGCG 與一些天然小分子比如姜黃素、人參二醇、紫檀芪、槲皮素結合時會增加其在機體的生物利用度,從而更有效地抑制癌細胞增殖。因此,未來將誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的藥物或者一些其他天然小分子與EGCG相結合可能成為治療腫瘤的一種有效方法[38]。

    4 展 望

    近年來,研究人員對于PARP16通過參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和核質(zhì)運輸而調(diào)節(jié)癌癥、CF 和心血管疾病等進行了許多的研究和深入探索。本課題組對于PARP16 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的信號轉(zhuǎn)導通路也進行了初步研究,但對于怎樣將應激信號轉(zhuǎn)導給下游信號分子這一具體通路尚未完全了解,比如PARP16通過PERK 和ⅠRE1α 這兩個壓力傳感器介導癌癥等疾病的作用機制。目前,PARP16 抑制劑的研發(fā)正在逐漸成為藥物研發(fā)的熱點,PAPR16可以與ADP-核糖基化酶的典型抑制劑3-氨基苯甲酰胺結合,這為接下來研究人員了解其煙酰胺亞位點,從而開發(fā)下一代關于煙酰胺模擬物抑制劑提供了一個很好的思路。同時,由于PARP16的抑制劑不斷地涌現(xiàn),研究人員發(fā)現(xiàn)其抑制劑與一些小分子化合物相結合治療相關疾病具有較好的效果。比如EGCG與天然小分子相結合對于治療腫瘤取得較好的療效,這為PARP16 抑制劑在未來治療癌癥以及心血管疾病提供了一個非常好的方向。另外,PARP16 還可以與其他PARP家族成員一起參與多種疾病調(diào)節(jié),比如CF,表明PARP家族成員在機體中協(xié)同參與了多種細胞生命進程。

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