高通量測序檢測米線中的食源性致病菌

吳 怡，劉露露，吳永民，代詩瓊，商 穎，曹建新，韓 鵬

（昆明理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650500）

米線是中國西南部最具代表性的特色小吃，廣受消費(fèi)者的喜愛，但是其較高的水分活度，為微生物的生長繁殖提供了良好環(huán)境。若消費(fèi)者誤食含食源性致病菌的米線食品，就可能引起身體不適等不良反應(yīng)。近年來，從米線制品中檢出食源性致病菌的報道時有出現(xiàn)，如食用含蠟樣芽孢桿菌的米粉引起腹瀉腹痛[1]。某地疾控中心從米粉米線中檢出4 種食源性致病菌[2]。在米線及配料食品中發(fā)現(xiàn)變形桿菌污染[3]。因此控制米線中的微生物污染不可忽視，在以往的研究中，用于篩選鑒別米面制品中的食源性致病菌方法包括傳統(tǒng)的平板篩選法、生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定和高通量測序技術(shù)等。徐梅瓊等[4]利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)從米線樣品中檢出蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌。鐘曉等[5]從涼拌米線中檢出阪崎腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門菌等致病菌。從以往的研究結(jié)論來看，傳統(tǒng)培養(yǎng)法和生理生化鑒定具有一定的局限性，對含量較低的非優(yōu)勢菌群和不可培養(yǎng)微生物[6]可能有所遺漏。目前Yi Cuiping等[7]利用16S rDNA高通量測序技術(shù)分析米粉發(fā)酵液中的菌群組成，發(fā)現(xiàn)主要細(xì)菌包括不動桿菌、醋酸桿菌、伯克霍爾德氏菌、乳酸菌和乳球菌等。由此報道可以看出利用高通量測序技術(shù)可獲得較詳盡的微生物信息，以便研究樣品中細(xì)菌的多樣性、相對豐度及其變化趨勢。

雖然高通量測序技術(shù)在食源性致病菌檢測領(lǐng)域中已有較成熟的應(yīng)用，如應(yīng)用高通量測序技術(shù)檢測即食沙拉中的細(xì)菌多樣性和食源性致病菌[8]，利用高通量測序技術(shù)從黃油中檢出蠟樣桿菌、單核細(xì)胞性李斯特菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌等條件致病菌[9]。但是至今高通量測序技術(shù)在分析米線中食源性致病菌污染情況的應(yīng)用鮮見報道。因此，本研究選擇高通量測序作為研究方法，分析米線從原材料、生產(chǎn)加工、存儲運(yùn)輸?shù)戒N售食用的各個環(huán)節(jié)中，可能存在的食源性致病菌污染情況。并結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行進(jìn)一步的檢測，以期為降低米線食用風(fēng)險，控制微生物污染提供充分可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米線樣品采自某米線工廠。細(xì)菌基因組提取試劑盒（Cat#DP1301）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑 北京百泰克生物技術(shù)有限公司；exTaqDNA聚合酶 寶生物工程（大連）有限公司；DL2000/10000 DNA Marker 美國Life Science公司；實(shí)驗(yàn)所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；所有顯色培養(yǎng)基 法國科瑪嘉公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平 美國Mettler Toledo公司；T100 PCR儀 美國Bio-Rad公司；Invitrogen Qubit 4.0熒光定量儀、NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì) 美國賽默飛世爾科技公司；超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；高壓滅菌鍋 廈門（致微）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理及DNA提取

采集原料、生產(chǎn)、銷售、消費(fèi)環(huán)節(jié)的米線樣品共11 份，其中原料樣品2 份（大米和黏米粉），來自某米線工廠內(nèi)，大米標(biāo)記為mx-1，黏米粉標(biāo)記為mx-2；生產(chǎn)環(huán)節(jié)樣品4 份，與原料采自同一個工廠，分別標(biāo)記為mx-3、mx-4、mx-5、mx-6；銷售環(huán)節(jié)樣品共3 份，采自由同一工廠供貨的農(nóng)貿(mào)市場，分別標(biāo)記為mx-7、mx-8、mx-9；消費(fèi)環(huán)節(jié)樣品2 份，采自該農(nóng)貿(mào)市場內(nèi)的涼米線餐館，分別標(biāo)記為mx-10和mx-11。采樣過程嚴(yán)格按照國家食品污染和有害因素風(fēng)險監(jiān)測工作手冊要求進(jìn)行。

采樣結(jié)束后返回實(shí)驗(yàn)室立即提取樣品中微生物總DNA。參照Lee等[10]的樣品預(yù)處理方法，在超凈工作臺中取適量樣品，用無菌生理鹽水適當(dāng)渦旋漂洗樣品，得到樣品漂洗液備用。使用細(xì)菌基因組提取試劑盒從各樣品漂洗液中提取細(xì)菌菌落宏基因組DNA。使用超微量分光光度計(jì)檢測DNA濃度及純度。

1.3.2 16S rDNA基因擴(kuò)增及Illumina NovaSeq高通量測序

選取16S rDNA全基因序列為擴(kuò)增及測序?qū)ο?。以提取的總?xì)菌基因組DNA為模板，利用引物1492-R（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）和27-F（5’-AGATTTGATCCTGGCTCAG-3’）擴(kuò)增16S rDNA序列全長[11]。PCR體系：模板DNA 1 μL，dNTP Mixture 2 μL，10×buffer 2.5 μL，Taq酶0.2 μL，正反引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件參考杜靜芳等[12]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改動，具體條件如下： 95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 個循環(huán)；72 ℃補(bǔ)延伸10 min；4 ℃保存。

擴(kuò)增結(jié)束后，參照Temmerman等[13]的方法，以1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。達(dá)到測序要求后將各組樣品DNA 送至邏捷（濟(jì)南）生物醫(yī)藥有限公司進(jìn)行高通量測序，使用高保真酶對DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，并使用熒光定量儀進(jìn)行濃度定量。使用KAPA Hyper Prep Kit進(jìn)行文庫構(gòu)建，通過Illumina NovaSeq進(jìn)行測序。

1.3.3 食源性致病菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測與鑒定

根據(jù)各樣品高通量測序結(jié)果配制對應(yīng)的食源性致病菌顯色培養(yǎng)基若干，利用顯色培養(yǎng)基檢測金黃色葡萄球菌、沙門菌、蠟樣芽孢桿菌等致病菌。吸取100 μL樣品漂洗液進(jìn)行涂布，按照各顯色培養(yǎng)基說明進(jìn)行培養(yǎng)。部分常見食源性致病菌顯色培養(yǎng)基信息見表1。

表1 食源性致病菌顯色培養(yǎng)基Table 1 Chromogenic media for identification of foodborne pathogenic bacteria used in this study

檢出的菌株通過16S rDNA序列擴(kuò)增，測序，再利用NCBI（美國國家生物技術(shù)信息中心）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。測序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

通過Illumina NovaSeq測序平臺得到下機(jī)數(shù)據(jù)，截去Barcode序列并拆分成單個樣本數(shù)據(jù)，使用Trimmomatic 0.38對拆分后的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制。使用Usearch 11.2.64對過濾后的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接并切除擴(kuò)增引物序列，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)（有效數(shù)據(jù)）。

使用Usearch fastq_filter 去除Tags數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量序列，使用Usearch fastx_uniques 獲得按照豐度排序的非冗余序列。通過Usearch unoise3算法（minsize=8）進(jìn)行去噪，獲得Zero-radius可操作分類單元（Zeroradius operational taxonomic units，zOTU）序列，最后將所有的Tags數(shù)據(jù)比對到代表序列獲得zOTU在每個樣本中的相對豐度。使用SINTAX算法（Usearch 11.2.64）與RDP 16S Training set v16數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，并選取算法可信度大于0.8的作為注釋結(jié)果，去除注釋為葉綠體或線粒體相關(guān)的可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）后使用 Useaerch otutab_rare對于zOTU表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

基于zOTU使用KRONA對單個樣本的物種注釋結(jié)果進(jìn)行可視化。使用R軟件（版本3.2.3）對物種注釋結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和可視化展示，并使用hclust對OTU級別和不同分類級別的部分物種信息繪制熱圖并進(jìn)行聚類分析。使用Usearch alpha_div子命令（版本11.2.64）進(jìn)行多樣性指數(shù)（richness、Chao1、Shannon等）的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 Shannon指數(shù)稀釋曲線及物種累積曲線

從樣品中隨機(jī)抽取一定測序量的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)其所對應(yīng)的多樣性指數(shù)，以數(shù)據(jù)量與物種多樣性構(gòu)建的曲線稱為稀釋曲線。通常用來說明樣品的測序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣品中物種的豐富度。

圖1 10個樣本中細(xì)菌的Shannon指數(shù)曲線Fig. 1 Shannon curves of bacteria in ten samples

如圖1所示，10 個米線樣本的曲線趨勢先直線上升然后再趨向平坦，說明測序量足夠大，能覆蓋樣品中絕大多數(shù)微生物信息。10 個米線樣品中細(xì)菌群落的多樣性都比較豐富，數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

物種累積曲線常用于描述樣本量與物種豐富度之間的關(guān)系，是調(diào)查樣本物種組成和預(yù)測樣本中物種豐度的有效方式，被廣泛用于判斷樣本量是否充分以及估計(jì)物種豐富度。

圖2 10個樣本的物種積累曲線Fig. 2 Species accumulation curves for ten samples

由圖2可知，隨著樣品數(shù)量增加，物種數(shù)目也逐漸增加，顯現(xiàn)出拋物線走勢，且斜率逐漸減小，未出現(xiàn)直線上升，表明米線中的物種并不會隨著樣品量的增加而加多，表明對10 個米線樣品抽樣調(diào)查充分。

2.2 熱圖分析

選取豐度排名較高的30 個菌屬及其在每個樣品中的豐度信息繪制熱圖，并從分類信息和樣品間差異兩個層面進(jìn)行聚類。如圖3所示，濕鮮米線樣品mx-5和mx-6，消費(fèi)樣品mx-10和mx-11中微生物分布在屬水平上差異相對較小，可以聚類到一個系統(tǒng)分支。而不同的原料間及銷售階段的各樣品間的微生物分布差異則較大。在屬分類水平上，10 個樣品中微生物主要包括不動桿菌屬、氣單胞菌屬、乳酸球菌屬等。另外沙門菌屬和芽孢桿菌屬普遍存在于各米線樣品中。

圖3 基于屬水平的樣品物種豐度聚類熱圖Fig. 3 Heatmap of bacterial community abundance at the genus level

2.3 樣品中細(xì)菌多樣性及其豐度

11 個樣品中，除mx-3號樣品外，其余10 個樣品均成功從漂洗液中提取到DNA。取mx-3號樣品漂洗液進(jìn)行涂板，培養(yǎng)48 h后無菌落生長。分析其原因是由于mx-3號樣品取于米線壓條機(jī)出口，糊化成型過程中的高溫處理對原料中微生物具有一定的殺菌作用，但后續(xù)加工過程中又帶來微生物污染[14]。

基于OTU的分類結(jié)果表明，10 個米線樣品中細(xì)菌分屬于5 個門、11 個綱、19 個目、24 個科和29 個屬；16S rDNA高通量測序共注釋出了放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflex）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）5 個門。在10 個樣品中，變形菌門細(xì)菌為優(yōu)勢菌，在10 個樣品中相對豐度分別占73.86%、53.52%、52.55%、83.79%、82.25%、61.19%、76.42%、91.71%、88.17%、85.28%。在屬分類水平（圖4），高通量測序共檢測出29 個屬的細(xì)菌，包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、李斯特菌屬（Listeria）、沙門菌屬（Salmonella）、埃希氏菌屬（Escherichia）、志賀菌屬（Shigella）等食源性致病菌相關(guān)菌屬。結(jié)果表明在兩個原料樣品mx-1和mx-2中主要存在乳酸球菌屬（Lactococcus）和腸桿菌科未確定屬（Enterobacteriaceae unassigned）。而在生產(chǎn)加工過程的3 個樣品mx-4、mx-5、mx-6中，優(yōu)勢菌屬主要為不動桿菌屬（Acinetobacter）和氣單胞菌屬（Aeromonas），與原料相比米線成品在細(xì)菌菌屬分布上存在較明顯的差異，可能由于在米線生產(chǎn)過程中，高溫高壓處理使原料中大部分的微生物失活。而生產(chǎn)出的米線成品在貯運(yùn)環(huán)節(jié)中，由于工廠規(guī)模小，自動化程度低，再加之與食品直接接觸的容器或設(shè)備不定期清洗，又受到不同種類的細(xì)菌交叉污染，從而使細(xì)菌菌屬分布發(fā)生改變[15]。

圖4 米線樣品中細(xì)菌在屬分類水平的相對豐度Fig. 4 Relative abundance of bacteria in rice noodle samples at the genus level

基于米線生產(chǎn)過程中的加工工藝，本研究認(rèn)為成品貯藏環(huán)節(jié)是米線成品的微生物污染的關(guān)鍵控制點(diǎn)，不同于石文松等[16]研究發(fā)現(xiàn)預(yù)包裝濕米粉，生產(chǎn)環(huán)節(jié)為質(zhì)量控制關(guān)鍵。由于原料中的微生物在生產(chǎn)環(huán)節(jié)能夠被控制，所以對鮮濕米線成品，一方面要避免生產(chǎn)出的鮮濕米線因長時間存放導(dǎo)致菌落總數(shù)超標(biāo)[17]；而另一方面可使用含有0.6%乳酸的浸泡液處理鮮濕米線2 min，真空包裝后95 ℃熱殺菌25 min以延長鮮濕米線的貨架期[18]。對于干米線產(chǎn)品來說，可采取適當(dāng)?shù)母稍锾幚?，在保證成品率的前提下延長貨架期，干燥后的米線應(yīng)及時進(jìn)行包裝以防吸濕返潮[19]。

銷售過程中的mx-7、mx-8、mx-9樣品中，細(xì)菌種屬無明顯一致性，可能由于各銷售攤位的空氣流通性不同，熟食與生食擺放不規(guī)范以及不同的銷售方式使銷售環(huán)節(jié)的米線細(xì)菌菌屬存在一定差異[20]。在銷售環(huán)節(jié)中，應(yīng)要求銷售商規(guī)范經(jīng)營方式，改善營業(yè)環(huán)境，避免不同的食品發(fā)生交叉污染。消費(fèi)環(huán)節(jié)的兩份涼米線樣品mx-10和mx-11在菌屬分布上具有較高的一致性，推測是因?yàn)樵跊雒拙€制作過程中，相同的焯水溫度及時間，使不耐熱菌屬如李斯特菌屬或埃希氏菌屬等非芽孢桿菌屬細(xì)菌失活，而耐熱菌屬如芽孢桿菌屬、微桿菌屬（Exiguobacterium）得以存活。對于米線的銷售消費(fèi)階段，分析認(rèn)為關(guān)鍵控制點(diǎn)在于涼米線的售賣環(huán)節(jié)，大部分商販只經(jīng)過簡單的焯水，再添加輔料就完成制作供消費(fèi)者食用。根據(jù)高通量測序?qū)悍N屬的聚類分析，涼米線中的細(xì)菌物種多樣性并沒有因?yàn)檩o料的加入而出現(xiàn)明顯的上升。所以食用前的焯水環(huán)節(jié)顯得尤為重要，由于大部分商販在焯水時僅將米線在熱水中短暫漂燙，使米線的口感溫度上升，而忽略了高溫處理對微生物的殺滅作用。根據(jù)以往的研究，涼米線制作過程中熱燙30 s后再添加輔料即可大幅增加食用安全性[21]。應(yīng)避免開水熱燙食用或直接食用，充分的加熱能殺滅大部分微生物，從而防止出現(xiàn)衛(wèi)生安全問題。在涼米線的銷售過程中，要求攤販餐館應(yīng)規(guī)范餐點(diǎn)制作流程，盡可能采用帶溫控裝置的設(shè)備，并定時清潔與食品直接或間接接觸的平面，對于涼米線等即食類食品做到加工后即時食用，縮短從制作至食用的時間間隔[22]。

2.4 傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測結(jié)果

根據(jù)高通量測序結(jié)果中注釋到的埃希氏菌屬、葡萄球菌屬、李斯特菌屬、芽孢桿菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬等食源性致病菌相關(guān)菌屬信息，選擇大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞性李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門菌、志賀菌為檢測對象。分別配制各顯色培養(yǎng)基若干，進(jìn)行涂布培養(yǎng)，結(jié)果見表2。

表2 樣品中食源性致病菌檢測結(jié)果Table 2 Results of detection of foodborne pathogenic bacteria in samples

挑取不同的目標(biāo)菌株進(jìn)行16S rDNA測序比對，比對結(jié)果與相應(yīng)特異性篩選培養(yǎng)基篩選結(jié)果一致，顯示出較高的可信度。如表2所示。在米線生產(chǎn)、貯運(yùn)、銷售、消費(fèi)等環(huán)節(jié)中的食源性致病菌污染主要以蠟樣芽孢桿菌和沙門菌為主，與高通量測序結(jié)果相吻合。郭海艷等[2]研究260 份食品樣品后發(fā)現(xiàn)米粉米線中主要的污染病原菌為沙門菌和蠟樣芽孢桿菌。羅素梅等[23]通過分析150 份即食米粉中污染狀況，發(fā)現(xiàn)在各種食源性致病菌中蠟樣芽孢桿菌和沙門菌的檢出率最高，與本研究結(jié)果一致。對于米面制品來說，由于其本身的特性而且在貯運(yùn)過程中長時間暴露于空氣中，易受到蠟樣芽孢桿菌的污染[24]。由于芽孢狀態(tài)下該致病菌對不良環(huán)境有著較強(qiáng)的抵抗力不易被徹底殺滅，所以對于抑制蠟樣芽孢桿菌生長的研究較多。以溫度為例，有研究表明蠟樣芽孢桿菌在5 ℃條件下生長極為緩慢，該條件下蠟樣芽孢桿菌的安全風(fēng)險降至最低[25]。但是在較低貯藏溫度下，淀粉老化使米粉等米面制品質(zhì)地變硬，彈性下降，斷條率也隨之升高[26]，這對于米粉的加工貯運(yùn)來說都是不能接受的。而過高的貯藏溫度下，微生物的生長繁殖又會使成品的貨架期縮短，所以選擇合適的貯運(yùn)溫度很重要。楊金平等[27]研究發(fā)現(xiàn)，濕米粉在16 ℃條件下貯藏期能達(dá)到24 h，且具有較理想的感官評價得分。

以往的研究發(fā)現(xiàn)沙門菌污染主要表現(xiàn)在生鮮肉如鮮豬肉、鮮牛肉、雞肉中[28]。也有報道在豆沙面包和肉松面包等糕點(diǎn)食品中檢出沙門菌污染[29]。有分析認(rèn)為是由于在糕點(diǎn)制作過程中使用含沙門菌污染的蛋類作為食品原料而引入了沙門菌污染[30]。而對于米粉、米線、涼皮等米面制品中沙門菌檢測分析的報道還較少，通過分析現(xiàn)有的論文研究結(jié)果，推測米面制品中的沙門菌污染主要是由于貯運(yùn)銷售環(huán)節(jié)中發(fā)生了交叉污染所致[31]。除蠟樣芽孢桿菌和沙門菌外，本研究在原料、米線成品和銷售環(huán)節(jié)中也的確發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌污染，在原料和產(chǎn)品中還檢出志賀菌、單核細(xì)胞性李斯特菌等食源性致病菌。

3 結(jié) 論

本研究利用高通量測序結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)法分析不同階段米線樣品中食源性致病菌的污染情況，16S rDNA高通量測序結(jié)果一共注釋到5 個門、11 個綱、19 個目、24 個科和29 個屬的樣品微生物信息，包括食源性致病菌相關(guān)菌屬如芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、李斯特菌屬、沙門菌屬等。米線各樣品中也檢出如上幾種常見食源性致病菌，此外部分樣品中還檢出志賀菌、大腸桿菌O157:H7。兩種檢測方法的結(jié)果加深了對米線中食源性致病菌群落組成和多樣性的認(rèn)識。

由結(jié)果分析可知，最應(yīng)加強(qiáng)管控的環(huán)節(jié)為在末端的消費(fèi)環(huán)節(jié)，大部分商販在焯水時僅將米線在熱水中短暫漂燙，使米線的口感溫度上升，而忽略了高溫處理對微生物的殺滅作用。建議在制作過程中米線應(yīng)在沸水中加熱至少30 s再食用[21]，避免開水熱燙食用或直接食用，因?yàn)槌浞值募訜峥梢詺绱蟛糠治⑸?，從而防止出現(xiàn)衛(wèi)生安全問題，增加食用安全性。