基于UPLC-QE-MS探究褐變反應對酸乳中代謝物的影響

李 萌，寧雪楠，康佳欣，廖敏和，任皓威，劉 寧

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

酸乳是以生牛（羊）乳或乳粉為原料，經(jīng)殺菌后添加乳酸菌發(fā)酵而成的乳制品。因其口感獨特、營養(yǎng)豐富、易于人體消化而備受消費者喜愛[1]。除了營養(yǎng)特性以外，風味和顏色也被作為乳制品選擇的關鍵因素之一。在這種情況下，市場上出現(xiàn)了一種新興的酸乳產(chǎn)品，即褐色酸乳[2]。褐色酸乳又稱熟酸乳、烤酸乳、炭燒酸乳[3]。與普通酸乳相比，褐色酸乳具有咖啡般的顏色和焦糖般的風味，這種特殊的顏色和風味主要由褐變反應引起。褐變反應包括酶促褐變和非酶促褐變，非酶促褐變一般包括美拉德反應、抗壞血酸氧化、多酚氧化縮合、焦糖化反應[4]，其中美拉德反應被認為是褐色酸乳風味和顏色變化的主要原因[5]，其反應機理是還原糖的羰基與蛋白質(zhì)、氨基酸的氨基發(fā)生非酶促褐變反應[6-7]。

目前，關于褐色酸乳的研究主要集中于褐變工藝。張俊山[8]探究了不同還原糖對美拉德反應程度的影響，通過色度值分析發(fā)現(xiàn)葡萄糖的褐變效果最好。王曉倩等[9]對褐色酸乳的褐變工藝進行優(yōu)化，最終發(fā)現(xiàn)在葡萄糖添加量8%、褐變溫度98 ℃、褐變時間150 min條件下生產(chǎn)出的褐色酸乳顏色及口感最好。關于褐色酸乳在代謝組學方面的信息鮮見報道，褐變反應會對酸乳的風味及顏色有所影響。代謝組學作為一種高通量的檢測方法，主要對樣品中的小分子物質(zhì)進行全面定量和定性技術[10]，現(xiàn)已廣泛用于乳制品研究中，Caboni等[11]采用氣相色譜質(zhì)譜-非靶向代謝組學研究了熱處理對奶酪代謝物的影響，結果表明經(jīng)熱處理后羊奶發(fā)酵生產(chǎn)出的奶酪半乳糖、葡萄糖酸等物質(zhì)的相對含量顯著上調(diào)，α-羥基丁酸的相對含量顯著下調(diào)。Rubert等[12]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜-非靶向代謝組學研究了熱加工對油莎草（Cyperus esculentusL.）乳成分的影響，結果表明新鮮油莎草乳中生物素和精氨酸的相對含量高于熱加工的油莎草乳，這些研究說明可以用代謝組學的方法分析乳制品中小分子代謝物的變化。目前，代謝組學中關于褐色酸乳的研究較少，褐變反應是影響褐色酸乳風味和顏色變化的主要原因，因此本研究以普通酸乳和褐色酸乳為研究對象，利用超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole electrostatic field orbitrap mass spectrometry，UPLC-QE-MS）對2 種酸乳進行非靶向代謝組學分析，建立2 種酸乳的代謝圖譜，同時探究褐變反應對酸乳中小分子代謝物的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛乳 市購；乳糖酶 滄州夏盛酶生物技術有限公司；白砂糖 樂陵市廚大媽食品有限公司；直投式發(fā)酵菌粉YO-MIX883 丹尼斯克（中國）有限公司；甲醇、乙腈、乙酸銨、氨水（均為分析純） 德國CNW公司；超純水 香港屈臣氏集團有限公司；無水乙醇湖北福星生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Vanquish超高效液相色譜、Q Exactive HFX高分辨質(zhì)譜儀、Heraeus Fresco17離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；JXFSTPRP-24研磨儀 上海凈信科技有限公司；PS-60AL超聲儀 深圳市雷德邦電子有限公司；SPL-150生化培養(yǎng)箱、ZQPW-70全溫培養(yǎng)振蕩器天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋 常州賽普實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵乳的制備

分別向2 個相同的生牛乳樣品中加入0.814%的乳糖酶并置于52 ℃培養(yǎng)箱中，50 min后將牛乳取出并置于96 ℃水浴鍋中15 min，使乳糖酶失活，將其中一個牛乳樣品放在94.4 ℃水浴鍋中使其轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚Ｈ椋?12 min后將其取出，另一個作為普通牛乳；將普通牛乳和褐色牛乳接種YO-MIX883發(fā)酵劑，此發(fā)酵劑的菌種為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，接種量為萬分之四，然后在42 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，待pH值到達4.6時將酸乳取出，4 ℃后熟18 h。

1.3.2 樣品前處理

代謝物的提取參考Cai Yuping等[13]提出的方法并稍作改動，將2 種酸乳樣品真空冷凍干燥，取20 mg研磨成粉后的樣品并加入1 000 μL萃取溶液（甲醇-乙腈-水，2∶2∶1，V/V，帶有同位素標記的內(nèi)標混合物），渦旋混勻4 min，隨后在冰水浴中超聲5 min。勻漿及超聲處理重復3 次。將樣品在－40 ℃孵育1 h，然后在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，將得到的上清液轉(zhuǎn)移新瓶中進行上機分析，并通過等分混合2 種樣品的上清液制備質(zhì)量控制樣品，每個樣本的生物學重復為6 個。

1.3.3 UPLC-QE-MS檢測

UPLC條件：ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：A為水相（含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水），B為乙腈；樣品盤溫度4 ℃，進樣體積3 μL。

MS條件：選擇QE HFX質(zhì)譜儀，采用電噴霧電離源，在正離子和負離子模式下采集數(shù)據(jù)。正離子模式下噴霧電壓為3 600 kV；負離子模式下噴霧電壓為－3 200 kV。鞘氣體流量為30 arb；輔助氣體流量為25 arb；毛細管溫度為350 ℃；全MS分辨率為60 000，MS/MS分辨率為7 500；轟擊能量為10/30/60 eV。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后，使用XCMS進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理，然后與BiotreeDB（V2.1）二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進行物質(zhì)注釋，算法打分的Cutoff值設為0.3。采用SIMCA軟件（V16.0.2, Sartorius Stedim Data Analytics AB, Umea,Sweden）對UPLC-QE-MS的數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析，主要包括無監(jiān)督的主成分分析（principal components analysis，PCA）和有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。

PCA主要研究樣本分布、偏差特征和共同趨勢，OPLS-DA主要是對樣本進行分類，并對大多數(shù)判別變量進行識別，并基于擬合優(yōu)度和預測優(yōu)度驗證分類和預測能力，通過置換實驗（n=200）對模型進行過擬合檢驗，所得截距（Q2）的負值表明模型的穩(wěn)健性。變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）得分顯示每個變量對模型的貢獻，對預測成分中的VIP得分進行分析，只有VIP值大于1的代謝物才被視為類別之間的鑒別[14]。最后將得到的代謝物信息根據(jù)VIP值、Studentt檢驗的P值和差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）以2為底的對數(shù)值進行篩選，從而得到具有顯著差異的代謝物。

2 結果與分析

2.1 UPLC-QE-MS代謝圖譜分析

基于UPLC-QE-MS分別在正負離子模式下對普通酸乳和褐色酸乳進行檢測，得到2 種酸乳樣品的總離子流圖（total ion current，TIC）。由圖1可知，普通酸乳和褐色酸乳的基線穩(wěn)定，說明儀器數(shù)據(jù)采集穩(wěn)定性很好。正負離子模式下TIC出峰的保留時間、峰面積以及峰的數(shù)量有所不同，因此需要在后續(xù)對原始數(shù)據(jù)進行處理分析。

圖1 普通酸乳和褐色酸乳隨機單個樣品的TICFig. 1 Total ion current chromatograms of random single samples of ordinary yogurt and brown yogurt

2.2 PCA結果

圖2 普通酸乳和褐色酸乳PCA模型得分圖Fig. 2 PCA score plots of ordinary yogurt and brown yogurt

由圖2可以很明顯地看出，在正離子和負離子模式下2 種酸乳樣品有明顯分離趨勢，正離子模式下PCA模型的負離子模式下PCA模型的PCA模型的代表模型對X變量的解釋性，當它的值大于0.4時，說明此模型可靠，能夠用于解釋普通酸乳和褐色酸乳之間的代謝物差異[15]。

2.3 OPLS-DA結果

圖3 普通酸乳和褐色酸乳的OPLS-DA模型圖及置換檢驗圖Fig. 3 OPLS-DA model plot and permutation test plot of ordinary yogurt and brown yogurt

為了更好地對數(shù)據(jù)進行可視化及后續(xù)分析，采用OPLS-DA對數(shù)據(jù)進一步分析，可以過濾掉代謝物中與分類變量不相關的正交變量，并分別對正交變量和非正交變量分析，從而更加準確地識別代謝物的差異[16]。如圖3A、B所示，2 種酸乳樣本能夠明顯地分開，所有樣本均處在95%置信區(qū)間的橢圓內(nèi)。正離子模式下模型Q2=0.993；負離子模式下模型代表模型對Y變量的解釋性，Q2代表模型的可預測性，非常接近1，說明建立的模型符合樣本數(shù)據(jù)的真實情況。原模型Q2非常接近1，說明如果有新樣本加入模型，會得到近似的分布情況，因此該模型可以很好地解釋兩組樣本之間的差異[17]。為了防止模型出現(xiàn)過度擬合，對該模型進行200 次置換檢驗，最終結果如圖3C、D所示，正離子模式下置換檢驗模型Q2=－0.96；負離子模式下Q2=－0.98。置換檢驗隨機模型的Q2值均小于原模型的Q2值，說明原模型具有良好的穩(wěn)健性，不存在過擬合現(xiàn)象。

2.4 差異性代謝物的篩選與鑒定

為了在數(shù)百個變量中找到比較重要的差異性代謝物，本研究根據(jù)VIP值大于1.2、Studentt檢驗的P值小于0.001、log2FC的絕對值大于3的篩選原則進行進一步篩選，最終共得到117 種代謝物，這些代謝物的具體信息如表1所示，主要包括氨基酸、肽、糖類和風味化合物等，2 種酸乳的主要差異是顏色與風味，因此本研究主要是對酸乳顏色及風味有影響的代謝物進行討論。

表1 普通酸乳和褐色酸乳差異性代謝物Table 1 Differential metabolites between ordinary yogurt and brown yogurt

續(xù)表1

續(xù)表1

2.4.1 氨基酸和二肽

如表1所示，與普通酸乳相比，褐色酸乳中異亮氨酸、纈氨酸的相對含量下調(diào)，組氨酸的相對含量上調(diào)。纈氨酸與異亮氨酸是疏水性氨基酸，大多數(shù)疏水性氨基酸都有苦味[18]。除了氨基酸的相對含量發(fā)生變化外，普通酸乳和褐色酸乳中共有8 種二肽有顯著差異，分別為京都啡肽、焦谷氨酰胺基谷氨酰胺、Asp-Lys、Phe-Ala、Asp-Thr、Pro-Asp、Glu-Pro和N-γ-谷氨酰谷氨酰胺。這8 種二肽在褐色酸乳中的相對含量高于普通酸乳，其中京都啡肽、焦谷氨酰胺基谷氨酰胺在2 組酸乳中相對含量的FC顯著高于其他6 種二肽，京都啡肽是一種內(nèi)源性鎮(zhèn)痛神經(jīng)肽[19]，雖然鮮見其在乳制品中生成機理的研究報道，但根據(jù)本研究結果可以推測，褐變反應可能對酸乳中京都啡肽的生成具有促進作用。此外，褐色酸乳中京都啡肽的相對含量是普通酸乳中的13 975 倍，它是117 種差異性代謝物中FC最大的代謝物，可作為褐色酸乳潛在的標志性代謝物。焦谷氨酰胺基谷氨酰胺是一種能夠賦予食品一定鮮味的味覺化合物，褐色酸乳中焦谷氨酰胺基谷氨酰胺的相對含量是普通酸乳中的3 096 倍，這可能是因為牛乳在加熱過程中，焦谷氨酸和游離氨基酸在焦谷氨酰環(huán)化酶的作用下生成焦谷氨酰胺基谷氨酰胺[20]，相比于普通酸乳，褐色酸乳在發(fā)酵前會經(jīng)過更長時間的熱處理，因此褐色酸乳中焦谷氨酰胺基谷氨酰胺的相對含量高于普通酸乳。這些氨基酸和二肽相對含量的變化可能是賦予褐色酸乳特殊風味的原因之一。

2.4.2 糖類

糖類是乳酸菌發(fā)酵的主要碳源，可為微生物的生長繁殖提供能量[21]。與普通酸乳相比，褐色酸乳中共有12 種糖類的相對含量顯著升高，糖類含量的升高可能是褐變反應和酸乳中微生物發(fā)酵代謝所致[22]。由表1可知，褐色酸乳中5-氨基咪唑核苷酸和6-磷酸果糖的相對含量分別是普通酸乳的464 倍和289 倍。5-氨基咪唑核苷酸是乳酸菌核酸代謝途徑中重要的中間產(chǎn)物，其經(jīng)過羧基化最終會形成腺嘌呤核苷酸和鳥嘌呤核苷酸，它們是發(fā)酵食品中重要的風味核苷酸，對酸乳的風味和香氣有一定貢獻[23]。有研究表明，牛乳在熱處理過程中會生成半乳糖和吡喃半乳糖基甘露糖[24]。半乳糖會經(jīng)過Leloir途徑最終轉(zhuǎn)化為葡萄糖[25]，葡萄糖在糖酵解過程中會生成6-磷酸葡萄糖，并在己糖激酶的作用下轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖[26]。因此褐色酸乳中6-磷酸果糖的相對含量顯著升高。這些糖含量的升高有助于褐色酸乳甜味的提升。

2.4.3 風味化合物和其他類物質(zhì)

由表1可知，褐色酸乳中2-乙?；秽?,6-二氫-4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮的相對含量顯著升高，分別是普通酸乳中的1 555 倍和13 倍，它們都是美拉德反應過程的中間體或產(chǎn)物。2-乙?；秽窃S多熱處理食品中的風味成分，它的氣味閾值很低，是一種具有甜味、杏仁味和香醋味的風味化合物，對食品的感官特性有顯著的貢獻[27]。5,6-二氫-4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮是吡喃酮的衍生物，它能夠賦予食物焦糖般的香氣。由表1可觀察到，褐色酸乳中苯醌相對含量是普通酸乳中的2 113 倍，這可能是牛乳褐變過程中發(fā)生了多酚氧化縮合反應，這種反應是以酚類為底物，在高溫、潮濕條件下將酚類氧化為苯醌，從而使牛乳的顏色變深[28-29]。因此可以推斷，褐色酸乳的顏色除了受美拉德反應影響外，可能在一定程度上也與苯醌有關。同時，苯醌可能會與其他氨基酸發(fā)生反應，進而生成一些風味化合物（醛、胺等）[30]。與普通酸乳相比，褐色酸乳中酚類、醇類、酮類、酯類、萜類等物質(zhì)的相對含量顯著上調(diào)，它們是酸乳中風味物質(zhì)的前體，同時還具有一些有益功能，對酸乳的風味及營養(yǎng)功能有很大的貢獻。

3 結 論

本研究考察褐變反應對酸乳中小分子代謝物的影響，2 種酸乳代謝物的相對含量有顯著差異，這些代謝物主要包括氨基酸、二肽、糖類、風味化合物等。褐色酸乳中糖類、風味化合物等物質(zhì)的相對含量普遍升高，這可能是引起2 種酸乳風味不同的主要原因。與普通酸乳相比，苯醌在褐色酸乳中的相對含量顯著上調(diào)，這說明褐色酸乳在生產(chǎn)過程中除了會發(fā)生美拉德反應外，還可能發(fā)生多酚氧化縮合反應，反應產(chǎn)生的苯醌可能對褐色酸乳的風味及顏色有所影響。酚類、醇類、酮類、萜類等在褐色酸乳中含量較高，對酸乳的風味有一定貢獻作用。京都啡肽是117 種差異性代謝物中含量差異最大的代謝物，可作為褐色酸乳潛在的標志性代謝物，本研究結果可以為褐色酸乳的研究與開發(fā)提供一定理論依據(jù)。