冬棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析

田 晏，侯召華

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353）

冬棗（Ziziphus jujubaMill.cv. Dongzao）為鼠李科棗屬冬棗植物的果實(shí)，果皮較薄，果肉脆嫩多汁，口感鮮甜，主要種植于山東沾化一帶，是我國(guó)特有的品種[1]，因其采摘時(shí)氣溫較低，故稱之為冬棗[2]。冬棗含有多種人體必需氨基酸[3]及微量元素，維生素含量較高[4]，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時(shí)代出現(xiàn)的一個(gè)新的研究領(lǐng)域，是研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的新技術(shù)，可用于研究植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物和非生物脅迫的響應(yīng)及發(fā)病機(jī)理等[5]。蛋白質(zhì)作為功能執(zhí)行體，是基因表達(dá)的直接產(chǎn)物[6]。與轉(zhuǎn)錄組相比，蛋白質(zhì)組能更直接地反映植物基因的表達(dá)狀態(tài)。目前已有將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于枇杷[7]、葡萄[8]、荔枝[9]、石榴[10]等果品的相關(guān)報(bào)道。在冬棗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，果皮由綠色向黃白、紅色轉(zhuǎn)變，隨著果皮中可溶性固形物、香氣物質(zhì)、色素相關(guān)物質(zhì)的持續(xù)積累，相關(guān)基因表達(dá)及蛋白質(zhì)合成也出現(xiàn)相應(yīng)變化[11]。目前以冬棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象的報(bào)道較少，且數(shù)據(jù)庫(kù)不夠完整，因此有必要對(duì)冬棗果實(shí)成熟過(guò)程的蛋白質(zhì)表達(dá)特性開(kāi)展深入研究。

本研究以‘沾冬2號(hào)’冬棗為研究對(duì)象，利用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）和最新數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，比較冬棗果實(shí)4 個(gè)階段差異蛋白質(zhì)表達(dá)特征，結(jié)合生物學(xué)代謝通路分析，篩選出冬棗果實(shí)的關(guān)鍵代謝通路及重要差異蛋白，以期從蛋白質(zhì)水平闡明果實(shí)的發(fā)育機(jī)制，為研究冬棗的成熟發(fā)育機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冬棗果實(shí)品種為‘沾冬2號(hào)’（Ziziphus jujubaMill.‘Zhandong 2’），2020年7—10月采于山東省濱州市沾化區(qū)。在4 個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段，即幼果（DE01）、膨大期果實(shí)（DE02）、白熟期果實(shí)（DE03）、脆熟期果實(shí)（DE04）分別采集果實(shí)（圖1），樣品用液氮速凍粉碎后，置－80 ℃冰箱貯藏備用。

胰蛋白酶 普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司；二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、尿素、碳酸氫銨（均為分析純） 美國(guó)Sigma公司；三氟乙酸（分析純），乙腈、甲醇、甲酸、乙酸（均為質(zhì)譜級(jí)） 美國(guó)Thermo Fisher公司。

圖1 不同生長(zhǎng)階段的冬棗果實(shí)Fig. 1 Winter jujube fruits at different developmental stages

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000 RSLC Nano液相色譜儀、Q Exactive HF納升液相色譜-四極桿串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道阱超高分辨質(zhì)譜儀（Orbitrap 240000FWHM） 賽默飛世爾科技有限公司；Allgera X-30R冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；BTP8ZL真空冷凍干燥器 美國(guó)SP Scientific公司；BILON-650Y超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選擇大小均勻、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械傷的幼果期果實(shí)（DE01A、DE01B、DE01C），膨大期果實(shí)（DE02A、DE02B、DE02C），白熟期果實(shí)（DE03A、DE03B、DE03C），脆熟期果實(shí)（DE04A、DE04B、DE04C），去除棗核后液氮速凍，粉碎，－80 ℃冰箱貯藏備用。每一階段樣品分別進(jìn)行3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 蛋白質(zhì)提取及肽段酶解

參考文獻(xiàn)[12]的方法，并略作改進(jìn)。稱取3 g樣品粉末于50 mL離心管，加入5 倍體積－20 ℃預(yù)冷丙酮；勻漿混勻后于－20 ℃靜置4 h以上；4 ℃、10 000×g離心30 min，棄上清液；沉淀用100%預(yù)冷丙酮5 mL，清洗3 次；4 ℃、10 000×g離心15 min；沉淀用氮?dú)獯蹈珊?，得蛋白質(zhì)粗提物。取0.25 g蛋白質(zhì)樣品，溶于2.5 mL尿素裂解液（5 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2% CHAPS、2% SB-3-10、1% PMSF、20 mmol/L二硫蘇糖醇），超聲波破碎處理（50%功率，工作2 s，間歇3 s，循環(huán)5～10 min）；處理后，20 ℃、14 000×g離心40 min，得上清液；0.45 μm濾膜過(guò)濾，得蛋白質(zhì)溶液，考馬斯亮藍(lán)法定量分析，－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

各組樣品按超濾輔助樣品制備法進(jìn)行胰蛋白酶酶解[13]，通過(guò)C18Cartridge固相萃取柱對(duì)酶解肽段脫鹽，供液相色譜檢測(cè)。

1.3.3 LC-MS/MS檢測(cè)

樣品酶解后，采用Q Exactive HF納升液相色譜對(duì)酶解肽段混合物進(jìn)行質(zhì)譜分析。

NanoViperC18色譜柱（75 μm×15 cm，2 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸-80%乙腈溶液；流速300 nL/min；梯度洗脫：120 min；0～3 min，96% A、4% B；3～100 min，96%～66% A、4%～34% B；100～115 min，66%～55% A、34%～45% B；115～120 min，1% A、99% B。

質(zhì)譜采用離子源為陽(yáng)離子模式、DDA模式數(shù)據(jù)采集，得到LC-MS/MS原始數(shù)據(jù)，用軟件Proteome Discoverer 2.2（PD2.2）搜庫(kù)鑒定，并進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Perseus軟件（版本號(hào)1.6.5.0）和悟空快速查看與分析數(shù)據(jù)云平臺(tái)（https://wkomics.Omicsolution.com）對(duì)PD搜庫(kù)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行顯著分析、主成分分析（principle component analysis，PCA）。對(duì)蛋白質(zhì)含量豐度進(jìn)行數(shù)值質(zhì)控，變異系數(shù)不大于0.2，數(shù)值轉(zhuǎn)化log2-transformed，Z-scores中心化，并且缺失值正態(tài)分布填充（width 0.3, downshift 1.8）；Benjamini-Hochberg FDR＜0.01。差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥2，P＜0.05或FC≤0.5，P＜0.05，差異顯著。

1.5 生物信息學(xué)分析

用Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ebi.uniprot.org）對(duì)所鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）注釋，依據(jù)蛋白質(zhì)參與的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞學(xué)組分和分子功能屬性，與各自的前一階段比較，利用在線分析軟件Omicsbean（http://www.omicsbean.cn）對(duì)冬棗果實(shí)不同發(fā)育階段出現(xiàn)的差異蛋白分別進(jìn)行GO、京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）注釋富集分析以及蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）分析，挖掘冬棗果實(shí)在發(fā)育過(guò)程中由差異蛋白表達(dá)變化導(dǎo)致發(fā)生改變的重要代謝信號(hào)通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)鑒定及相對(duì)定量

采用Proteome Discoverer 2.2軟件對(duì)冬棗蛋白質(zhì)質(zhì)譜進(jìn)行檢索，篩選出可信度水平在95%以上的蛋白質(zhì)共2 107 個(gè)；根據(jù)3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中至少2 次鑒定到同一蛋白的原則，從4 個(gè)發(fā)育階段分別鑒定到2 095、2 039、2 065、2 042 個(gè)蛋白質(zhì)，其中定量1 986 個(gè)，占總數(shù)的94.26%。冬棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中差異表達(dá)蛋白質(zhì)的數(shù)量分布和差異如圖2A所示，其中DE01組和DE02組共有差異表達(dá)蛋白質(zhì)2 033 個(gè)，DE02組和DE03組共有差異表達(dá)蛋白質(zhì)2 021 個(gè)，DE03組和DE04組共有差異表達(dá)蛋白質(zhì)2 029 個(gè)。

圖2 發(fā)育過(guò)程中冬棗樣品的蛋白質(zhì)差異Fig. 2 Venn diagram and PCA plot for differentially expressed proteins in winter jujube samples between different developmental stages

為進(jìn)一步揭示不同發(fā)育階段冬棗果實(shí)的蛋白質(zhì)差異性，對(duì)4 個(gè)不同發(fā)育階段果實(shí)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA（圖2B），變量PC1、PC2累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)86.7%。12 個(gè)樣本被顯著的分為4 類，依次為：DE01A、DE01B、DE01C，DE02A、DE02B、DE02C，DE03A、DE03B、DE03C，DE04A、DE04B、DE04C，表明不同發(fā)育階段的冬棗果實(shí)蛋白質(zhì)存在顯著差異，且生物學(xué)重復(fù)之間具有密切的相關(guān)性。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 不同發(fā)育階段蛋白鑒定結(jié)果

對(duì)4 組蛋白質(zhì)進(jìn)行方差分析，使用t檢驗(yàn)對(duì)表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，與各自的前一階段相比，在膨大期、白熟期、脆熟期果實(shí)中差異表達(dá)蛋白數(shù)分別為96、185、138 個(gè)（表1）。對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，Level 3水平上進(jìn)行GO、KEGG分析及PPI分析，參考擬南芥進(jìn)行映射。

表1 不同階段差異表達(dá)蛋白的數(shù)量Table 1 Number of differentially expressed proteins between different developmental and ripening stages

2.2.2 差異表達(dá)蛋白的GO注釋及富集分析

使用GO功能分類系統(tǒng)對(duì)3 組對(duì)比的差異蛋白進(jìn)行生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能分析，以明確差異表達(dá)蛋白參與行使的功能。GO表明，DE02 vs DE01差異表達(dá)蛋白主要參與的生物過(guò)程有單一生物細(xì)胞過(guò)程、單一生物代謝過(guò)程、化學(xué)響應(yīng)、壓力響應(yīng)、細(xì)胞成分組織；經(jīng)細(xì)胞組分分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)蛋白主要富集在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外部分、膜結(jié)合細(xì)胞器、細(xì)胞周?chē)?；差異表達(dá)蛋白的分析功能主要包括氧化還原酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、水解酶活性等（圖3A）。

圖3 GO功能注釋及富集分析Fig. 3 Functional annotation and enrichment analysis using GO

DE03vs DE02差異表達(dá)蛋白主要參與的生物過(guò)程有單一生物代謝過(guò)程、單一生物細(xì)胞過(guò)程、壓力響應(yīng)、細(xì)胞成分組織、化學(xué)響應(yīng)；經(jīng)細(xì)胞組分分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)蛋白主要富集在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外部分、膜結(jié)合細(xì)胞器、細(xì)胞周?chē)?；差異表達(dá)蛋白的分析功能主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合、氧化還原酶活性、核糖體結(jié)構(gòu)組成、輔助因子結(jié)合等（圖3B）。

DE04 vs DE03差異表達(dá)蛋白主要參與的生物過(guò)程有單一生物細(xì)胞過(guò)程、單一生物代謝過(guò)程、生物合成的過(guò)程、細(xì)胞成分組織、壓力響應(yīng)；經(jīng)細(xì)胞組分分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)蛋白主要富集在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外部分、膜結(jié)合細(xì)胞器；差異表達(dá)蛋白的分析功能主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合、氧化還原酶活性、核糖體結(jié)構(gòu)組成等（圖3C）。

2.2.3 KEGG注釋富集分析

KEGG通路分析為探討蛋白參與的生物學(xué)代謝通路及其潛在的作用提供了重要信息，表2～4中分別列出了DE02 vs DE01組、DE03 vs DE02組、DE04 vs DE03組富集途徑重要差異表達(dá)蛋白的定量信息。冬棗果實(shí)各發(fā)育階段中差異表達(dá)蛋白質(zhì)的顯著富集代謝通路（P＜0.05）如圖4所示。圖4A表明，DE02 vs DE01的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，類黃酮生物合成、檸檬烯和蒎烯降解、芪類、二芳基庚酸和姜酚的生物合成、光合作用和苯丙烷類生物合成等重要代謝通路存在顯著差異。圖4B表明，DE03 vs DE02的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，光合作用、核糖體、乙醛酸和二羧酸代謝等重要代謝通路存在顯著差異。圖4C表明，DE04 vs DE03的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，光合作用、類黃酮生物合成、核糖體、脂肪酸生物合成、脂肪酸代謝和脂肪酸降解等重要代謝通路存在顯著差異。

表2 DE02 vs DE01組的差異蛋白質(zhì)富集的代謝通路Table 2 KEGG pathway of differentially expressed proteins in DE02 vs DE01

表3 DE03 vs DE02組的差異蛋白質(zhì)富集的代謝通路Table 3 KEGG pathway of differentially expressed proteins in DE03 vs DE02

表4 DE04 vs DE03組的差異蛋白質(zhì)富集的代謝通路Table 4 KEGG pathway of differentially expressed proteins in DE04 vs DE03

圖4 KEGG富集分析Fig. 4 KEGG enrichment pathway

2.2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 不同發(fā)育時(shí)期差異蛋白網(wǎng)絡(luò)互作Fig. 5 Interaction networks of differentially expressed proteins between different developmental periods

在生物體中，蛋白質(zhì)功能的行使必須借助于其他蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)和介導(dǎo)。這種調(diào)節(jié)或介導(dǎo)作用的實(shí)現(xiàn)首先要求蛋白質(zhì)之間有相互作用。研究蛋白質(zhì)之間的相互作用及其形成的網(wǎng)絡(luò)對(duì)于揭示蛋白質(zhì)的功能具有重要意義[14]。圖5中圓點(diǎn)紅色表示差異顯著性高，綠色表示差異顯著性低；方框藍(lán)色表示富集顯著性高，黃色表示富集顯著性低。實(shí)線表示2 個(gè)蛋白質(zhì)有直接的互作關(guān)系，虛線表示有間接的互作關(guān)系。與蛋白關(guān)聯(lián)的線條數(shù)量越多，表明該蛋白在網(wǎng)絡(luò)中越關(guān)鍵。冬棗果實(shí)不同發(fā)育時(shí)間的差異蛋白彼此間與互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的其他蛋白間聯(lián)系緊密，主要相關(guān)通路為光合作用、類黃酮生物合成、檸檬烯和蒎烯降解、芪類、二芳基庚酸和姜酚的生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、苯丙烷類生物合成以及核糖體等途徑。

3 討 論

冬棗4 個(gè)不同發(fā)育成熟過(guò)程（DE01、DE02、DE03、DE04）中，參與光合作用、苯丙烷類生物合成、檸檬烯和蒎烯降解、芪類、二芳基庚酸和姜酚的生物合成、類黃酮生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝以及核糖體合成等生物學(xué)過(guò)程的蛋白質(zhì)差異顯著，這些代謝過(guò)程在果實(shí)品質(zhì)形成過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用。

3.1 冬棗果實(shí)發(fā)育中與光合作用相關(guān)蛋白質(zhì)

4 個(gè)時(shí)期差異蛋白共同顯著富集在光合作用途徑，說(shuō)明光合作用途徑貫穿并調(diào)控冬棗果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。光合作用可為植物生長(zhǎng)提供能量、作為環(huán)境信號(hào)調(diào)節(jié)植物自身生長(zhǎng)發(fā)育的形態(tài)，以增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。光系統(tǒng)I是一種色素-蛋白質(zhì)復(fù)合體，可介導(dǎo)類囊體膜上的光驅(qū)動(dòng)電子從可溶性電子供體（質(zhì)體藍(lán)素）到可溶性電子受體（鐵氧還蛋白）的傳遞[15]。冬棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，光合作用中光系統(tǒng)II的PsbA、PsbB、PsbC、PsbH不同程度的下調(diào)，涉及光系統(tǒng)I的PSAD2、PSAE2、PasA、PsaC表達(dá)也受抑制。冬棗果實(shí)發(fā)育初期富含葉綠素，光合作用相關(guān)蛋白質(zhì)出現(xiàn)極顯著表達(dá)，而在果實(shí)膨大、轉(zhuǎn)色成熟過(guò)程中，相關(guān)蛋白質(zhì)穩(wěn)定下降。質(zhì)體藍(lán)素是高等植物中為細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體與光系統(tǒng)I之間傳遞電子的一種含銅原子的蛋白質(zhì)，位于類囊體膜內(nèi)表面，是光合鏈中的重要成員[16]。冬棗DE03階段質(zhì)體藍(lán)素的表達(dá)量高于DE02階段，質(zhì)體藍(lán)素作為光系統(tǒng)I的電子供體，使電子經(jīng)鐵氧還蛋白催化NADP＋生成NADPH，從而完成光反應(yīng)電子鏈的最后一步。細(xì)胞色素b6是細(xì)胞色素b6-f復(fù)合物的組成部分，介導(dǎo)光系統(tǒng)II和光系統(tǒng)I之間的電子轉(zhuǎn)移，光系統(tǒng)I周?chē)难h(huán)電子流動(dòng)以及狀態(tài)轉(zhuǎn)換，它參與光誘導(dǎo)的光合電子傳遞，起電子載體的作用[17]。果實(shí)發(fā)育中后期細(xì)胞色素b6表達(dá)升高，在光合作用逐漸降低的情況下，有助于冬棗果實(shí)發(fā)育后期的能量轉(zhuǎn)化和利用。

3.2 冬棗果實(shí)發(fā)育中與苯丙烷類生物合成相關(guān)蛋白質(zhì)

苯丙烷類化合物是碳和能量流的重要途徑，用于維持黃酮類生物合成能量和碳骨架[18]。本研究中類β-葡萄糖苷酶11亞型X1在苯丙烷類生物合成途徑中被上調(diào)，類β-葡萄糖苷酶11亞型X1正向調(diào)控順-2-羥基肉桂酸酯，從而合成在冬棗果實(shí)發(fā)育中起保護(hù)素作用的香豆素化合物。同時(shí)，過(guò)氧化物酶在此途徑的最后一步反應(yīng)木質(zhì)素單體催化聚合為木質(zhì)素，提高植物對(duì)病原菌侵害和逆境脅迫的抵御力[19]。苯丙氨酸解氨酶（phenylalaninammonialyase，PAL1）是苯丙素生物合成途徑的關(guān)鍵酶[20]，PAL1在合成途徑的前端催化苯丙氨酸直接脫氨基轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸，反式肉桂酸是植物苯丙烷類次生代謝物生物合成的起始物，能反饋抑制PAL1的活性，苯丙烷類代謝途徑酶系可能受其影響[21]。PAL1調(diào)控木質(zhì)素和類黃酮合成，PAL1活性降低，類黃酮含量隨之減少，從而提高冬棗果實(shí)的木質(zhì)素活性。幼果期冬棗過(guò)氧化物酶和類β-葡萄糖苷酶11亞型X1表達(dá)量上調(diào)能正向調(diào)節(jié)冬棗果實(shí)生長(zhǎng)活動(dòng)，調(diào)控木質(zhì)素合成與積累，提高冬棗在發(fā)育初期的抗病抗逆境脅迫力。DE02 vs DE01階段中，檸檬烯和蒎烯降解，芪類、二芳基庚酸和姜酚的生物合成顯著富集，說(shuō)明這些途徑對(duì)冬棗果實(shí)發(fā)育以及抗擊逆境意義重大。

3.3 冬棗果實(shí)發(fā)育中與類黃酮生物合成相關(guān)蛋白質(zhì)

類黃酮化合物是植物重要的次生代謝物，具有化學(xué)信使和抗氧化劑等多種生物學(xué)功能。黃烷醇類物質(zhì)是類黃酮物質(zhì)的亞類，在果實(shí)呈現(xiàn)綠色時(shí)大量合成，隨著冬棗果皮著色，類黃酮、葉綠素含量逐漸降低[22]。查耳酮合酶（chalcone synthase，CHS）是參與類黃酮生物合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶，可催化對(duì)香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A生成查耳酮，進(jìn)一步衍生出類黃酮化合物[23]，直接影響類黃酮色素的積累。查耳酮合酶超家族（chalcone synthase superfamily，CHI1）在植物中合成各種次生代謝物，提高植物早期進(jìn)化過(guò)程中對(duì)環(huán)境脅迫的抵御力。黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）是黃酮類化合物合成途徑的關(guān)鍵酶，可催化柚皮素合成，為黃酮醇、花青素的前體的合成提供原料[24]。二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）在花青素合成下游途徑中將二氫黃酮醇轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄇ嗨剀辗磻?yīng)的第一個(gè)酶，直接調(diào)控花青素合成[25]?；ㄇ嗨剡€原酶（anthocyanidin reductase，BAN）對(duì)花青素的生物合成有重要的調(diào)控作用，且其在冬棗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式與花青素的合成呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，是花青素積累中關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控因子[26]。本研究中，冬棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中CHS、CHI1、F3H、BAN、DFR不同程度的下調(diào)，這些蛋白是來(lái)自不同蛋白翻譯后修飾的異構(gòu)體，連續(xù)作用于類黃酮生物合成。它們都有一個(gè)相似的模式，在第1個(gè)生長(zhǎng)期結(jié)束后急劇下降，呈現(xiàn)與前人研究葡萄類黃酮合成途徑較一致的規(guī)律[27]。

3.4 冬棗果實(shí)發(fā)育中與乙醛酸和二羧酸代謝相關(guān)蛋白質(zhì)

谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GLN1-1）是高等植物氮代謝中重要的酶，表達(dá)受不同外界因素的影響，其中最主要的是氮源、光照調(diào)節(jié)和葉綠體發(fā)育[28]。本研究中GLN1-1在乙醛酸和二羧酸代謝途徑中下調(diào)，這與冬棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中光合作用逐漸下調(diào)有關(guān)。絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（serine hydroxymethyl transferase，SHMT2）作為L(zhǎng)-絲氨酸合成中的關(guān)鍵酶，能催化甘氨酸和L-絲氨酸的相互轉(zhuǎn)化。絲氨酸是光呼吸關(guān)鍵酶的代謝調(diào)控因子，甘油酸脫氫酶（glycerol dehydrogenase，HPR）正向調(diào)控光呼吸氧化底物乙醇酸的合成。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，光呼吸是為植物提高抗逆性而形成的一條代謝途徑，具有重要的生理意義[29-30]。本研究中SHMT2和HPR表達(dá)上調(diào)，有助于調(diào)控光呼吸的進(jìn)行，為冬棗果實(shí)發(fā)育中后期適應(yīng)環(huán)境變化而提高其抗逆性，以維持冬棗果實(shí)的正常生理作用。過(guò)氧化氫酶幾乎能在所有需氧呼吸的生物體中發(fā)生，可保護(hù)冬棗細(xì)胞免受過(guò)氧化氫的毒性作用。蘋(píng)果酸脫氫酶能夠?qū)⑻O(píng)果酸脫氫轉(zhuǎn)化為草酰乙酸并還原成蘋(píng)果酸，蘋(píng)果酸用于調(diào)節(jié)細(xì)胞pH值和維持滲透壓平衡，并作為三羧酸循環(huán)的中間代謝物為植物生長(zhǎng)發(fā)育提供能量，對(duì)細(xì)胞代謝調(diào)控起重要作用[31]。

3.5 冬棗果實(shí)發(fā)育中與核糖體合成相關(guān)蛋白質(zhì)

核糖體由核糖體蛋白復(fù)合物組成，是蛋白質(zhì)合成的重要場(chǎng)所，細(xì)胞內(nèi)核糖體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)序列的作用下，附著到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上并合成可溶性蛋白[32]?？扇苄缘鞍资窃S多植物體內(nèi)酶的重要組成部分，為植物生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)和能量，參與調(diào)控植物的多種代謝過(guò)程，與植物生長(zhǎng)發(fā)育、成熟衰老以及抗逆性等密切相關(guān)。本研究中，核糖體蛋白家族40S、60S核糖體以及60S酸性核糖體在DE03 vs DE02中顯著下調(diào)，說(shuō)明冬棗在膨大期迅速積累糖分，蛋白質(zhì)合成速率逐漸降低。而在冬棗果實(shí)成熟后期以60S核糖體為主的蛋白不同程度的上調(diào)，與下調(diào)蛋白數(shù)目相比，比率接近1。與前人棗類發(fā)育過(guò)程中果實(shí)的可溶性蛋白質(zhì)含量呈三峰曲線變化趨勢(shì)研究結(jié)果一致[33]，可溶性蛋白質(zhì)含量在冬棗發(fā)育期內(nèi)變化不明顯，至成熟時(shí)游離氨基酸含量降低。

4 結(jié) 論

通過(guò)沾化冬棗不同成熟階段（DE01、DE02、DE03、DE04）的蛋白質(zhì)組分析，共定性2 107 個(gè)蛋白質(zhì)，定量1 986 個(gè)蛋白質(zhì)，其中DE02 vs DE01、DE03 vs DE01、DE04 vs DE03差異表達(dá)蛋白質(zhì)分別為96、185、138 個(gè)。差異蛋白質(zhì)GO顯示，主要富集單一生物細(xì)胞過(guò)程、單一生物代謝過(guò)程、化學(xué)響應(yīng)、壓力響應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程。KEGG代謝通路分析表明，差異表達(dá)蛋白顯著富集在光合作用、苯丙烷類生物合成、檸檬烯和蒎烯降解、類黃酮生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝以及核糖體合成等。冬棗果實(shí)不同成熟階段蛋白質(zhì)組差異顯著，差異蛋白質(zhì)主要參與能量代謝、遺傳信息處理和其他次生代謝物的生物合成等途徑，這些代謝途徑在二代冬棗果實(shí)品質(zhì)形成過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用。