植物乳桿菌對(duì)干腌馬鮫魚降鹽增鮮效果的影響

梁進(jìn)欣，陳曉紅，李 珊，楊 娟,2，趙文紅，白衛(wèi)東,2,*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院，廣東 廣州 510225）

馬鮫魚是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚類，其肉質(zhì)鮮美，且含有大量的蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸以及礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。馬鮫魚不僅可以鮮食，還可以作為干腌制品，干腌馬鮫魚在我國(guó)的銷量與消費(fèi)潛力巨大。目前市面上的干腌馬鮫魚制作過(guò)程中通常加入大量食鹽，以此降低產(chǎn)品水分含量與水分活度，抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而達(dá)到延長(zhǎng)馬鮫魚貨架期的目的[1]。但高食鹽的制作方式不僅會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量，而且對(duì)人體健康有一定的傷害，會(huì)引發(fā)高血壓、心血管等慢性疾病[2]。因此，近年來(lái)在魚的腌制過(guò)程中大多使用鉀鹽、鈣鹽等，以代替部分食鹽[3-4]，但鉀鹽、鈣鹽等食鹽替代物會(huì)使干腌魚制品產(chǎn)生不良的滋味特性，如金屬味與苦澀味[5]。

目前許多研究表明乳酸菌在食品生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，不僅能夠抑制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖，還能夠產(chǎn)蛋白酶，降解蛋白質(zhì)，促進(jìn)滋味物質(zhì)的產(chǎn)生，如小分子肽、游離氨基酸等滋味物質(zhì)[6]。滋味物質(zhì)通常賦予食物鮮味、厚味等味感[7]，同時(shí)也具有咸味和增咸作用[8]，因此在魚的腌制過(guò)程中，接種乳酸菌能起到降鹽增鮮的效果，如游剛[9]發(fā)現(xiàn)乳酸菌不僅可改善干腌魚的風(fēng)味還能在腌制過(guò)程中減少食鹽的用量；吳燕燕等[10]在魚腌制后接種乳酸菌且降低用鹽量，發(fā)現(xiàn)其鮮味氨基酸占比大于高鹽組，說(shuō)明乳酸菌促進(jìn)了滋味物質(zhì)的產(chǎn)生，同時(shí)也增強(qiáng)了產(chǎn)品的滋味特性；閆博文等[11]通過(guò)電子舌測(cè)定發(fā)現(xiàn)添加植物乳桿菌制作酸面團(tuán)，其咸味強(qiáng)度高于空白組，認(rèn)為其咸味與植物乳桿菌代謝形成的小分子肽有關(guān)。因此本研究以馬鮫魚為原料，腌制后接種植物乳桿菌制作干腌馬鮫魚，以經(jīng)過(guò)4%（m/m）食鹽與2%（m/m）食鹽腌制處理的干腌馬鮫魚分別作為對(duì)照組1與對(duì)照組2，研究植物乳桿菌對(duì)干腌馬鮫魚的降鹽增鮮作用，旨在為探究植物乳桿菌應(yīng)用于馬鮫魚加工生產(chǎn)與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鮫魚購(gòu)于海南省?？谑杏X(jué)森商店；植物乳桿菌24258（Lactobacillus plantarum）購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

5’-腺苷酸（adenosine 5’-monophosphate，5’-AMP）、5’-肌苷酸（inosine 5’-monophosphate，5’-IMP）、5’-鳥(niǎo)苷酸（guamosine 5’-monophosphate，5’-GMP）、肌苷（inosine，HxR）、次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx） 上海源葉生物試劑有限公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品及衍生試劑 安捷倫科技有限公司；細(xì)胞色素C（12 384 Da）、抑酞酶（6 511 Da）、氧化型谷胱甘肽（621 Da）和Gly-Gly-Gly（189 Da） 美國(guó)Sigma公司；其他試劑購(gòu)自廣州東巨生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-02型生化培養(yǎng)箱 黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司；CR-400色差儀 深圳市天友利標(biāo)準(zhǔn)光源有限公司；水分活度儀 深圳冠亞水分儀科技有限公司；FiveEasy Plus pH計(jì) 梅特勒-托利多公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；5810型高速冷凍離心機(jī) 艾本德中國(guó)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 干腌馬鮫魚加工與取樣

加菌組：按2%（m/m）加入食鹽，均勻涂抹于魚塊表面，5 ℃靜腌5 h，接種植物乳桿菌，菌液濃度108CFU/mL，接種量為10 mL/100 g，25 ℃靜置發(fā)酵2 h，然后魚塊置于15 ℃生化培養(yǎng)箱干燥，干燥至魚塊水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%～35%，包裝為成品。

對(duì)照組1：按4%（m/m）加入食鹽，均勻涂抹于魚塊表面，5 ℃靜腌5 h，腌制后的魚塊加無(wú)菌水，加水量為10 mL/100 g，置于25 ℃生化培養(yǎng)箱2 h，后魚塊置于15 ℃生化培養(yǎng)箱干燥，干燥至魚塊水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%～35%，包裝為成品。

對(duì)照組2：按2%（m/m）加入食鹽，其余同對(duì)照組1。

加工過(guò)程分5 個(gè)階段取樣：生肉、腌制期、干燥1 d、干燥3 d、干燥5 d，每個(gè)階段取樣后均用絞肉機(jī)絞碎，且置于－40 ℃冰箱保存。

1.3.2 基本理化指標(biāo)的測(cè)定

水分含量的測(cè)定：參考GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》直接干燥法；水分活度的測(cè)定：參考GB 5009.238—2016《食品水分活度的測(cè)定》水分活度儀擴(kuò)散法；pH值的測(cè)定：參考GB 5009.237—2016《食品pH值的測(cè)定》；食鹽含量測(cè)定：參考GB 5009.44—2016《食品中氯化物的測(cè)定》銀量法；色度：用色度儀測(cè)定。

1.3.3 干腌馬鮫魚的感官評(píng)定

對(duì)13 名參與人員進(jìn)行甜、苦、咸、鮮、厚味等味道的鑒別實(shí)驗(yàn)，組成感官評(píng)價(jià)小組，分別對(duì)兩組干腌馬鮫魚的滋味進(jìn)行評(píng)價(jià)（甜味、苦味、咸味、鮮味、厚味）。采用10 分制進(jìn)行打分，然后取結(jié)果的平均值。每個(gè)評(píng)定員，獨(dú)立評(píng)分，每品嘗完一個(gè)樣品，用蒸餾水漱口，再進(jìn)行下一個(gè)樣品的品嘗。

1.3.4 核苷酸及其降解產(chǎn)物的測(cè)定

樣品制備參照Ryder[12]的方法，準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品，加入15 mL 5%高氯酸溶液，重復(fù)均質(zhì)3 次，10 000 r/min離心15 min，上清液過(guò)濾，用去離子水定容到25 mL，用1 mol/L KOH溶液調(diào)pH值至6.5，過(guò)0.22 μm水系濾膜，待測(cè)。色譜柱采用ZIC?-HILIC（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A為0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH 5.3），流動(dòng)相B為純乙腈；洗脫程序?yàn)閂（A）∶V（B）=20∶80；等度洗脫；流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

1.3.5 游離氨基酸的測(cè)定

樣品前處理參考Aro等[13]的方法略作修改：準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品，添加4%的三氯乙酸25 mL，重復(fù)均質(zhì)3 次，10 000 r/min離心20 min，上清液過(guò)濾，用去離子水定容到50 mL，37 ℃水浴1 h后，用0.22 μm水系濾膜過(guò)濾。采用Agilent自動(dòng)衍生進(jìn)樣程序，用高效液相色譜儀分析。

1.3.6 肽分子質(zhì)量分布的測(cè)定

參考莫加利等[14]的方法略作修改：準(zhǔn)確稱取5.00 g碎肉，加入20 mL去離子水，重復(fù)勻質(zhì)3 次，沸水浴提取120 min，8 000 r/min離心15 min，取上清液，過(guò)0.22 μm水系濾膜，待測(cè)。色譜柱采用TSKGel-G2000-SWXL（7.8 mm×300 mm），流動(dòng)相為0.1 mol/L磷酸鹽溶液（pH 6.7），流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。標(biāo)準(zhǔn)樣品的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值與洗脫體積擬合直線方程為y=－0.887 5x＋27.793（R2=0.976 8），其中y為標(biāo)準(zhǔn)肽相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)；x為保留時(shí)間/min。

1.3.7 滋味強(qiáng)度值（taste activity value，TAV）分析

TAV為樣品中某呈味物質(zhì)濃度與其味道閾值之比，若TAV大于1，則可以認(rèn)為該物質(zhì)對(duì)樣品的滋味有重要貢獻(xiàn)，若TAV小于1，則可以認(rèn)為該物質(zhì)對(duì)樣品滋味貢獻(xiàn)不明顯[15]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及相關(guān)性分析，P＜0.05，差異顯著；采用Origin 2018進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 干腌馬鮫魚加工過(guò)程中基本理化指標(biāo)分析

從表1可知，在干腌過(guò)程中，干腌馬鮫魚的水分活度與水分含量呈顯著的下降趨勢(shì)。到干燥第5天，加菌組、對(duì)照組1、對(duì)照組2的水分活度和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.83、0.86、0.86和33.92%、34.27%、34.86%，均達(dá)到保藏要求，且加菌組的水分活度顯著低于對(duì)照組1、對(duì)照組2（P＜0.05），其原因可能是植物乳桿菌的活動(dòng)加速產(chǎn)品的水分活度的降低及水分的流失[16]。在干腌過(guò)程中，微生物快速繁殖，分解魚肉中的蛋白質(zhì)、碳水化合物等，產(chǎn)生乳酸、乙酸等酸性代謝產(chǎn)物，pH值會(huì)逐漸降低。加菌組在干燥5 d pH值顯著降低，達(dá)到5.85，由于植物乳桿菌能夠大量產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，而且作為優(yōu)勢(shì)菌，還能抑制腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖[17]。在干腌過(guò)程中，由于水分不斷散失與食鹽的滲透作用，氯化物質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷上升，從生肉0.09%上升到產(chǎn)品的5.02%（對(duì)照組1）、2.66%（對(duì)照組2）和2.58%（加菌組），樣品含鹽量均顯著增加，但是由于加菌組與對(duì)照組2的食鹽添加量均為對(duì)照組1的一半，因此最終產(chǎn)物中鹽含量也低于對(duì)照組1。

2.2 干腌馬鮫魚加工過(guò)程中色差變化

從表2可看出，加菌組與對(duì)照組1、對(duì)照組2的亮度（L）、紅度（a*）、黃度（b*）在加工過(guò)程有顯著變化（P＜0.05），在腌制發(fā)酵過(guò)程中，魚肉收縮，肌纖維間距減小，導(dǎo)致亮度變暗，而在干燥過(guò)程中，由于血紅蛋白氧化，以及微量的美拉德反應(yīng)等使魚肉的色澤降低，從而魚肉的亮度隨著降低，紅度上升[18]；而在腌制過(guò)程中，紅度變?yōu)樨?fù)值，可能是由于魚肉表面的少量的肌紅蛋白與食鹽反應(yīng)產(chǎn)生膽綠素[19]。魚肉在干燥環(huán)境下，黃度升高，說(shuō)明魚肉脂肪氧化，在黃度上，加菌組與對(duì)照組1、對(duì)照組2沒(méi)有明顯差異。在干燥第5天加菌組樣品的亮度、紅度、黃度與對(duì)照組1、對(duì)照組2沒(méi)有明顯的差異（P＞0.05），說(shuō)明植物乳桿菌的添加對(duì)干腌馬鮫魚的外觀品質(zhì)無(wú)顯著影響。

表1 干腌馬鮫魚加工過(guò)程中水分含量、水分活度、pH值、鹽含量的變化Table 1 Changes in water content, water activity, pH and salt content of dry-cured mackerel at different processing stages

表2 干腌馬鮫魚加工過(guò)程中色差變化Table 2 Changes in color parameters of dry-cured mackerel at different processing stages

2.3 干腌馬鮫魚的味覺(jué)特性分析

為確定干腌馬鮫魚基本味感特性，將3 組干腌馬鮫魚隔水蒸煮，并且進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。如圖1所示，咸、鮮、厚味是干腌馬鮫魚主要的味覺(jué)特性，加菌組與對(duì)照組1、對(duì)照組2的味覺(jué)特性有明顯差異。加菌組與對(duì)照組2的干腌馬鮫魚只添加了2%食鹽，其氯化物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.66%與2.58%，但加菌組的咸味、鮮味、厚味均高于對(duì)照組1與對(duì)照組2，說(shuō)明植物乳桿菌有較好的增咸、增鮮效果。植物乳桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶，促進(jìn)蛋白質(zhì)分解成小肽與氨基酸。小肽與氨基酸是干腌馬鮫魚主要的呈味物質(zhì)[20-21]，因此可以推測(cè)，植物乳桿菌的添加有利于干腌馬鮫魚中呈味物質(zhì)的產(chǎn)生，尤其是咸味、鮮味和厚味物質(zhì)。

圖1 干腌馬鮫魚感官評(píng)定雷達(dá)圖Fig. 1 Radar chart for sensory evaluation of dry-cured mackerel

表3 干腌馬鮫魚加工過(guò)程中游離氨基酸含量的變化Table 3 Changes in free amino acid contents in dry-cured mackerel at different processing stages mg/100

2.4 干腌馬鮫魚加工過(guò)程中游離氨基酸含量的變化與TAV分析

游離氨基酸是干腌魚中典型的滋味物質(zhì)，其種類及含量能夠改善干腌魚的口感，提高味感。從表3可知，樣品經(jīng)過(guò)干腌后，其游離氨基酸含量均顯著增加，而加菌組增幅顯著高于對(duì)照組1、對(duì)照組2（P＜0.05），到干燥5 d其總游離氨基酸是對(duì)照組1與對(duì)照組2的1.3、1.5 倍。其中，鮮味氨基酸與甜味氨基酸的含量與占比均高于對(duì)照組1，而苦味氨基酸的占比則低于對(duì)照組1與對(duì)照組2，說(shuō)明植物乳桿菌的添加，有利于產(chǎn)品鮮、甜味氨基酸的產(chǎn)生，降低苦味氨基酸的占比，提高了產(chǎn)品的整體滋味。

圖2 干腌馬鮫魚游離氨基酸的TAVFig. 2 TAV of free amino acids in dry-cured mackerel

從圖2可知，甜味氨基酸中，只有甲硫氨酸的TAV大于1，其余的甜味氨基酸的TAV均小于1，高濃度的咸味會(huì)抑制甜味，而且鮮味物質(zhì)對(duì)甜味有一定的抑制作用[22]，Kemp等[23]發(fā)現(xiàn)高濃度的谷氨酸鈉能夠抑制甜味的呈現(xiàn)，因此在干腌馬鮫魚的感官評(píng)定中，甜味不是主要的味感。對(duì)照組1與對(duì)照組2中鮮味氨基酸的TAV均小于1，對(duì)鮮味的貢獻(xiàn)不大，而加菌組中雖然天冬氨酸的TAV低于1，但谷氨酸的TAV接近1.5，對(duì)干腌馬鮫魚的鮮味貢獻(xiàn)極大，更好地促進(jìn)加菌組干腌馬鮫魚的鮮味味感的呈現(xiàn)。許多研究表明谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、精氨酸能夠增強(qiáng)咸味味感，屬于咸味或增咸氨基酸[24-26]，因?yàn)楣劝彼崤c天冬氨酸能夠與氯化鈉產(chǎn)生協(xié)同增效作用，不僅能增強(qiáng)鮮味強(qiáng)度[27]，還能增強(qiáng)咸味強(qiáng)度，Rocha等[28]發(fā)現(xiàn)谷氨酸能夠在低濃度的氯化鈉溶液中表現(xiàn)出增強(qiáng)咸味的能力，而且比GMP、IMP的增咸能力更強(qiáng)；Jinap等[25]發(fā)現(xiàn)在辣湯中加入0.7%味精可以降低32.5%的鈉添加量；而精氨酸、賴氨酸盡管是苦味氨基酸，但也具有增強(qiáng)風(fēng)味的能力，在一定程度上能夠提高產(chǎn)品的咸味強(qiáng)度[26]，Toelstede等[26]在奶酪蛋白的感官重組實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)缺乏精氨酸的實(shí)驗(yàn)組其咸味強(qiáng)度降低了0.6 個(gè)單位；而且苯丙氨酸和酪氨酸等苦味氨基酸在低于其閾值時(shí)也能增加干腌馬鮫魚的呈味復(fù)雜性，并適當(dāng)提高咸味與鮮味強(qiáng)度[29-30]。因此通過(guò)干腌馬鮫魚的游離氨基酸含量及其TAV分析，加菌組樣品的鮮味氨基酸、咸味及增咸氨基酸的TAV均高于對(duì)照組1與對(duì)照組2（P＜0.05），因此其咸味與鮮味強(qiáng)度與圖1干腌馬鮫魚味感特性評(píng)價(jià)相符。

2.5 干腌馬鮫魚肽分子質(zhì)量分布分析

從圖3可知，對(duì)照組1中＜5 kDa的小分子肽段高于對(duì)照組2，說(shuō)明4%食鹽腌制比2%食鹽腌制更好地增強(qiáng)魚內(nèi)組織蛋白酶的活性，促進(jìn)魚肉蛋白的分解，該結(jié)果與表3總游離氨基酸含量結(jié)果相符，其原因可能是由于在一定范圍內(nèi)適度的高鹽腌制可增強(qiáng)組織蛋白酶活性[31]。加菌組樣品中呈味小分子肽段（＜5 kDa）[32-33]占比顯著高于對(duì)照組1、對(duì)照組2（P＜0.05），其中加菌組＜1 kDa的肽段占比為21%，是對(duì)照組1、對(duì)照組2的1.5、3 倍，此肽段區(qū)間是鮮、厚味富集區(qū)域[34]，說(shuō)明植物乳桿菌的添加有利于鮮、厚味肽的產(chǎn)生，而大部分的鮮、厚味肽具有一定的增鮮、增咸的作用[33]，可以提高產(chǎn)品的整體風(fēng)味，而這些肽段里是否含有咸味肽則需要進(jìn)一步的研究。因此可推測(cè)加菌組樣品中含有較多的鮮味肽、厚味肽，進(jìn)一步證明其鮮味、咸味、厚味強(qiáng)度與圖1吻合。

圖3 干腌馬鮫魚的肽分子質(zhì)量分布Fig. 3 Molecular mass distribution of peptides in dry-cured mackerel

2.6 干腌馬鮫魚加工過(guò)程中的核苷酸含量的變化

核苷酸中AMP、IMP、GMP是典型的鮮味劑，在食物中廣泛存在，核苷酸的代謝途徑為ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx）[35-36]。從表4可知，在生肉中檢測(cè)鮮味物質(zhì)AMP、IMP分別是10.51、247.37 mg/100 g，GMP未檢出。而在腌制時(shí)期，加菌組與對(duì)照組1、對(duì)照組2均檢出AMP、IMP，但加菌組的IMP含量顯著低于對(duì)照組1與對(duì)照組2，可能是植物乳桿菌加快了IMP的代謝；到干燥5 d，加菌組與對(duì)照組1、對(duì)照組2都未檢出鮮味核苷酸，而Hx在干腌過(guò)程中的含量不斷升高，可能由于內(nèi)源酶與微生物酶的作用，核苷酸已全部降解為HxR和Hx。加菌組樣品中的苦味核苷酸含量（Hx、HxR）顯著高于對(duì)照組1、對(duì)照組2，及其部分苦味氨基酸的TAV大于1，特別是組氨酸，其TAV高達(dá)3.3，對(duì)苦味強(qiáng)度有一定的提高，而對(duì)照組1樣品中食鹽含量較高，可能在一定程度上掩蓋苦味，與圖1感官評(píng)價(jià)結(jié)果吻合。

表4 干腌馬鮫魚加工過(guò)程中核苷酸含量的變化Table 4 Changes in nucleotide contents in dry-cured mackerel at different processing stages mg/100 g

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)干腌馬鮫魚的基本理化指標(biāo)與色度測(cè)定，得出加菌組的水分活度與pH值顯著低于對(duì)照組1、對(duì)照組2（P＜0.05），腌制后接種植物乳桿菌有利于干腌馬鮫魚的保藏，對(duì)色澤的影響不顯著，不影響干腌馬鮫魚的外觀品質(zhì)。經(jīng)過(guò)感官評(píng)價(jià)與呈味物質(zhì)的比較分析，加菌組樣品鮮味、咸味、厚味都優(yōu)于對(duì)照組1、對(duì)照組2，特別在咸味特性中，加菌組只添加2%食鹽，咸味強(qiáng)度卻高于對(duì)照組1，證明植物乳桿菌在一定程度上能促進(jìn)干腌馬鮫魚中鮮味、厚味及增咸物質(zhì)的產(chǎn)生。加菌組的鮮味氨基酸TAV和＜1 kDa肽占比顯著高于對(duì)照組1與對(duì)照組2（P＜0.05），由于鮮味氨基酸與＜1 kDa的肽段本身具有鮮味、厚味等味感，而且也具有一定的增咸作用，因此加菌組樣品的鮮味、咸味、厚味強(qiáng)度與感官評(píng)定的結(jié)果相符，證明植物乳桿菌的添加可以降低干腌制品中食鹽的添加，同時(shí)還可以增加干腌制品的鮮味、咸味及厚味等味感，有較好的降鹽增鮮效果。本研究探討植物乳桿菌對(duì)干腌馬鮫魚的降鹽增鮮效果，為植物乳桿菌應(yīng)用于干腌制品的工藝改良、產(chǎn)品開(kāi)發(fā)與滋味研究提供一定的理論支撐。