雙酶協(xié)同降解膠體幾丁質(zhì)及其作用機(jī)制

吳 昊，劉嘉荔，楊靜文，胡雪芹，張洪斌

（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc），化學(xué)式為C8H15NO6，是一種重要的多功能單糖，在生物體內(nèi)作為多糖透明質(zhì)酸、肝素、硫酸角質(zhì)素的重要組成部分之一，維持生物體正常的生理功能[1]。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，GlcNAc治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有顯著功效[2]；而在食品行業(yè)中，它不僅能用于食品抗氧化劑及嬰兒食品添加劑，還是糖尿病患者的甜味劑及膳食補(bǔ)充劑等[3-5]，具有保護(hù)骨關(guān)節(jié)及軟骨組織的作用[6-8]。GlcNAc在食品等行業(yè)的多功能性使其年需求量激增，在市場(chǎng)上具有廣闊的應(yīng)用前景。

甲殼素（幾丁質(zhì)）作為全世界第2大天然多糖[9]，主要是由β-1,4-糖苷鍵連接的GlcNAc組成，廣泛存在于自然界包括甲殼類(lèi)動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、植物和微生物中[10]。有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年會(huì)生產(chǎn)約600～800萬(wàn) t螃蟹、蝦和龍蝦殼廢物，而蝦蟹的外殼中幾丁質(zhì)高達(dá)14%～27%[11-12]。如果能有效利用這些廢棄的幾丁質(zhì)資源，不僅能解決環(huán)境污染問(wèn)題，還可以帶來(lái)經(jīng)濟(jì)效益。目前，工業(yè)上從廢棄蝦蟹殼中獲得GlcNAc的方法還停留在傳統(tǒng)的酸（堿）解法，這種生產(chǎn)方法存在著許多缺點(diǎn)[13-14]。例如酸（堿）廢液處理困難、安全隱患、效率低等[15]。近幾年來(lái)，更加安全且高效的酶解法逐漸成為研究熱點(diǎn)。Bao Jingjing等[16]介紹了一種由生物膜介導(dǎo)的多酶自組裝級(jí)聯(lián)系統(tǒng)（multienzyme-assembly-cascade，MAC）用于幾丁質(zhì)降解制備氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN），該MAC系統(tǒng)顯示出色的催化活性、良好的溫度和pH值穩(wěn)定性，可以將（79.02±3.61）%的幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為GlcN。Lv Chenyin等[17]將商用幾丁質(zhì)酶（chitinase，ChiA）SgCtn與來(lái)自苜蓿鏈霉菌的β-N-乙酰基己糖胺酶SgHEX協(xié)同作用降解1%膠體幾丁質(zhì)，可以在6 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)93.7%的GlcNAc收率。酶解法制備GlcNAc具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、產(chǎn)率高、產(chǎn)物易于獲得且分子質(zhì)量均一等優(yōu)勢(shì)[18-20]。研究發(fā)現(xiàn)，自然界有很多微生物都能產(chǎn)生水解幾丁質(zhì)的酶[21-23]。目前為止，已發(fā)現(xiàn)有近40多種能夠水解幾丁質(zhì)的酶，分別來(lái)源于細(xì)菌、真菌、放線菌等[24-27]，其分離純化所得的酶都表現(xiàn)出很高的生物活性[28-30]。

本研究建立一種雙酶協(xié)同催化體系，由ChiA和β-N-乙?；禾前访窰J5N組成。在最適反應(yīng)條件下，該雙酶協(xié)同催化體系可以實(shí)現(xiàn)一步反應(yīng)高效降解膠體幾丁質(zhì)制備GlcNAc，具有反應(yīng)條件溫和、效率高、產(chǎn)物單一、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。旨在為酶法制備乙酰氨基葡萄糖的工業(yè)應(yīng)用提供一種有效策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BL21（DE3）/pET-22b（＋）-ChiA保存于實(shí)驗(yàn)室；HJ5N基因來(lái)自于微小桿菌（Microbacteriumsp.），pET-28a（＋）-HJ5N質(zhì)粒由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。質(zhì)粒提取試劑盒、用于表達(dá)的宿主菌大腸桿菌 BL21（DE3）均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

蝦殼幾丁質(zhì) 生工生物工程（上海）股份有限公司；GlcNAc標(biāo)準(zhǔn)品 上海泰坦科技股份有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)（配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和CSchrom plus色譜工作站） 美國(guó)科學(xué)儀器公司；XAmide色譜柱大連華譜科儀科技有限公司；VIS-723紫外分光光度計(jì)安徽中測(cè)儀器有限公司；ACQUITY UPLC Premier XE液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（配有電噴霧電離源） 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)及粗酶生產(chǎn)

將ChiA的表達(dá)菌菌株BL21（DE3）/pET-22b-ChiA按1%（V/V）的接種量接到含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于搖床250 r/min、37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)；14～16 h后取適量活化好的種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至新的液體LB培養(yǎng)基富集培養(yǎng)；在培養(yǎng)至菌液濃度OD600nm為2.0～3.0時(shí)加入適量異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）并于25 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h；誘導(dǎo)結(jié)束后4 ℃、8 000 r/min離心得到菌體沉淀；棄上清液后加入一定量K2HPO4/KH2PO4緩沖液；最后，振蕩、超聲破碎、離心即得ChiA粗酶液。

將HJ5N的表達(dá)菌菌株BL21（DE3）/pET28a-HJ5N按1%（V/V）的接種量接到含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于搖床250 r/min、37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)；14～16 h后取適量活化好的種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至新的液體LB培養(yǎng)基富集培養(yǎng)；在培養(yǎng)至菌體濃度OD600nm為2.0～3.0時(shí)加入適量IPTG并于25 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)11 h；誘導(dǎo)結(jié)束后4 ℃、8 000 r/min離心得到菌體沉淀；棄上清液后加入一定量的K2HPO4/KH2PO4緩沖液；最后，振蕩渦旋、超聲破碎、離心即得HJ5N粗酶液。

1.3.2 酶活力測(cè)定

ChiA活力測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸比色法：取酶液200 μL，加1.8 mL的1%膠體幾丁質(zhì)；在pH 6的K2HPO4/KH2PO4緩沖液中，50 ℃水浴反應(yīng)1 h；然后取500 μL反應(yīng)液加入到500 μL 3,5-二硝基水楊酸試劑中煮沸5 min，最終定容至5 mL，于紫外分光光度計(jì)540 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值；空白對(duì)照為加滅活的酶液。ChiA活力定義：50 ℃單位體積下每分鐘產(chǎn)生1 μg乙酰氨基葡二糖時(shí)所用的酶量為1 U。

HJ5N活力測(cè)定采用對(duì)硝基苯酚比色法[31]：取酶液50 μL，加入450 μL終濃度為2 mmol/L的pNP-GlcNAc，在pH 6的K2HPO4/KH2PO4緩沖液中50 ℃水浴10 min，然后終止反應(yīng)，加2 mL水，于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值；空白對(duì)照為加滅活的酶液；通過(guò)測(cè)定生成的黃色對(duì)硝基苯酚含量計(jì)算生成的GlcNAc含量，以此計(jì)算酶活力。HJ5N活力定義：50 ℃單位體積下每分鐘產(chǎn)生1 μg GlcNAc所需要的酶量為1 U。

1.3.3 膠體幾丁質(zhì)的制備

取適量粉碎后的蝦殼幾丁質(zhì)，緩慢加入一定量的磷酸，于40 ℃攪拌溶解2～3 h，4 ℃靜置過(guò)夜；然后加入等體積50%乙醇溶液使膠體幾丁質(zhì)完全析出；離心，棄上清液，測(cè)定pH值；最后重復(fù)用去離子水清洗膠體幾丁質(zhì)直至pH 5.5～6；用緩沖液復(fù)溶即得不同質(zhì)量濃度的膠體幾丁質(zhì)溶液[32]。

1.3.4 酶法降解膠體幾丁質(zhì)的產(chǎn)物分析

在一定質(zhì)量濃度的膠體幾丁質(zhì)溶液中，設(shè)置3 組實(shí)驗(yàn)，分別加入ChiA（A組）、HJ5N（B組）、ChiA和HJ5N的混合粗酶液（C組）進(jìn)行酶催化反應(yīng)；3 組反應(yīng)液經(jīng)高溫滅活、離心、取上清液后，通過(guò)HPLC檢測(cè)產(chǎn)物。

1.3.5 產(chǎn)物的HPLC和質(zhì)譜檢測(cè)

本研究所有樣品均通過(guò)HPLC檢測(cè)并結(jié)合外標(biāo)法計(jì)算產(chǎn)物單糖和幾丁二糖濃度。

HPLC檢測(cè)條件：紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)195 nm，流動(dòng)相65%乙腈-35% KH2PO4溶液（KH2PO4溶液取0.7 g溶于1 L水），流速為1.0 mL/min，色譜柱為XAmide柱。

液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)條件：65%乙腈-35%水的等度條件，流速1.0 mL/min，XAmide柱，波長(zhǎng)195 nm，檢測(cè)出產(chǎn)物的洗脫液引入質(zhì)譜儀中，通過(guò)質(zhì)量掃描識(shí)別進(jìn)行分析。

1.3.6 底物殘留計(jì)算

底物殘留計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 雙酶協(xié)同降解膠體幾丁質(zhì)催化體系的建立

本研究建立的雙酶協(xié)同催化體系主要包含ChiA和HJ5N。ChiA可以將多糖膠體幾丁質(zhì)降解為幾丁二糖(GlcNAc)2，其最適溫度50 ℃、最適pH 6，在pH 5～9和50 ℃以下都可以穩(wěn)定存在[27]。以此為基礎(chǔ)，從基因文庫(kù)中篩選得到了酶學(xué)性質(zhì)與ChiA相近的HJ5N基因，并構(gòu)建了重組工程菌BL21(DE3)/pET-28a-HJ5N，其誘導(dǎo)表達(dá)的HJ5N可以將幾丁二糖(GlcNAc)2進(jìn)一步降解為單糖GlcNAc，且其最適反應(yīng)溫度與pH值也為50 ℃和6.0。按1.3.4節(jié)方法對(duì)ChiA和HJ5N單獨(dú)或協(xié)同催化膠體幾丁質(zhì)的產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 膠體幾丁質(zhì)降解產(chǎn)物和GlcNAc標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC檢測(cè)圖Fig. 1 HPLC chromatograms of GlcNAc standard and colloidal chitin hydrolysate

圖2 雙酶協(xié)同催化產(chǎn)物質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectra of the products of colloidal chitin hydrolysis catalyzed by ChiA and HJ5N

排除9～10 min為K2HPO4/KH2PO4緩沖液的吸收峰，圖1A在第13分鐘左右出現(xiàn)了單一吸收峰，為ChiA水解后的產(chǎn)物幾丁二糖(GlcNAc)2。圖1B證明HJ5N不會(huì)對(duì)膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)生水解作用，在液相譜圖中未發(fā)現(xiàn)有明顯的吸收峰。而從ChiA和HJ5N協(xié)同催化膠體幾丁質(zhì)（圖1C）結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，第13分鐘的幾丁二糖吸收峰消失，在第15分鐘左右出現(xiàn)了新的產(chǎn)物峰，經(jīng)過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品（圖1D）對(duì)比可初步確定為GlcNAc；通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)進(jìn)一步鑒定該產(chǎn)物（圖2），經(jīng)分析可以確認(rèn)M=GlcNAc，分子質(zhì)量為221。質(zhì)譜中主要產(chǎn)生m/z=261=221＋39＋1，為[M＋K＋H]＋（反應(yīng)體系為磷酸鉀緩沖液，K為39），結(jié)合HPLC檢測(cè)結(jié)果可以確定雙酶協(xié)同降解膠體幾丁質(zhì)的終產(chǎn)物為GlcNAc。這一結(jié)果證明了ChiA和HJ5N在對(duì)膠體幾丁質(zhì)的水解過(guò)程中存在協(xié)同作用，ChiA將膠體幾丁質(zhì)催化降解為幾丁二糖(GlcNAc)2，再由HJ5N進(jìn)一步降解成GlcNAc（圖3）。

圖3 雙酶協(xié)同催化水解膠體幾丁質(zhì)流程圖Fig. 3 Flow chart of enzymatic hydrolysis of colloidal chitin

2.2 雙酶協(xié)同反應(yīng)機(jī)制

2.2.1 雙酶協(xié)同反應(yīng)機(jī)制分析

為研究ChiA和HJ5N在對(duì)降解膠體幾丁質(zhì)過(guò)程中的作用機(jī)制，以膠體幾丁質(zhì)為底物，對(duì)ChiA和HJ5N在單獨(dú)或協(xié)同催化的效果進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果如圖4所示。在相同反應(yīng)條件下，ChiA單獨(dú)催化僅有30%底物在6 h內(nèi)被降解，6 h后底物幾乎不會(huì)繼續(xù)下降，而ChiA和HJ5N協(xié)同催化12 h可以持續(xù)降解60%的膠體幾丁質(zhì)，雙酶協(xié)同催化降解膠體幾丁質(zhì)的效果遠(yuǎn)高于ChiA單獨(dú)降解的效果。為了驗(yàn)證ChiA是否變性失活，反應(yīng)6 h在ChiA單獨(dú)催化的反應(yīng)液中添加HJ5N，結(jié)果發(fā)現(xiàn)底物膠體幾丁質(zhì)可以繼續(xù)被降解。在之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以確定HJ5N無(wú)法單獨(dú)降解膠體幾丁質(zhì)，這表明ChiA可能只是被其產(chǎn)物(GlcNAc)2抑制了活性，而這種產(chǎn)物抑制現(xiàn)象也曾有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)[18,33]。HJ5N的加入可以快速將(GlcNAc)2轉(zhuǎn)化為GlcNAc，從而解除幾丁二糖對(duì)ChiA的抑制作用，恢復(fù)活性的ChiA則可以繼續(xù)降解膠體幾丁質(zhì)，ChiA與HJ5N的協(xié)同催化可以實(shí)現(xiàn)對(duì)膠體幾丁質(zhì)的持續(xù)降解。

圖4 不同反應(yīng)條件下的底物含量隨時(shí)間變化圖Fig. 4 Percentage of residual substrate as a function of hydrolysis time under different hydrolysis modes

2.2.2 雙酶協(xié)同催化的產(chǎn)物分析

通過(guò)對(duì)雙酶協(xié)同催化反應(yīng)不同反應(yīng)時(shí)間的產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析檢測(cè)，驗(yàn)證產(chǎn)物抑制作用是否被消除。從圖5可以看出，整個(gè)催化過(guò)程中，并無(wú)ChiA的降解產(chǎn)物(GlcNAc)2產(chǎn)生，只有GlcNAc在持續(xù)增加，直至反應(yīng)平衡。這證明了ChiA和HJ5N的協(xié)同催化不僅可以完全消除ChiA的產(chǎn)物抑制作用，加強(qiáng)對(duì)膠體幾丁質(zhì)的降解，更可以實(shí)現(xiàn)一步反應(yīng)制備GlcNAc無(wú)中間副產(chǎn)物生成。

圖5 ChiA和HJ5N協(xié)同催化產(chǎn)物質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化圖Fig. 5 Changes in concentrations of GlcNAc and (GlcNAc)2 during colloidal chitin hydrolysis co-catalyzed by ChiA and HJ5N

2.3 不同因素對(duì)雙酶協(xié)同催化體系的影響

2.3.1 溫度對(duì)雙酶協(xié)同催化體系的影響

為探究溫度對(duì)雙酶協(xié)同催化體系的影響，在pH 6，不同溫度（30、35、40、50 ℃）條件下，向40 g/L蝦殼幾丁質(zhì)（膠體幾丁質(zhì)11.4 g/L）中，各加入30 U/mL ChiA和HJ5N的粗酶液反應(yīng)12 h，然后通過(guò)HPLC檢測(cè)產(chǎn)物質(zhì)量濃度。如圖6所示，HJ5N活力受溫度影響較大，當(dāng)溫度在40 ℃以上時(shí)，HJ5N穩(wěn)定性較差，隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，HJ5N活力會(huì)持續(xù)下降直至失活，導(dǎo)致后續(xù)反應(yīng)過(guò)程中只有ChiA在單獨(dú)催化降解膠體幾丁質(zhì)，即(GlcNAc)2的質(zhì)量濃度比GlcNAc高。而當(dāng)溫度低于40℃時(shí)，HJ5N較為穩(wěn)定，能與ChiA協(xié)同催化發(fā)揮作用，將膠體幾丁質(zhì)持續(xù)水解為GlcNAc，反應(yīng)液中也無(wú)(GlcNAc)2生成。因此雙酶協(xié)同催化體系的最適反應(yīng)溫度為30 ℃。

圖6 溫度對(duì)雙酶協(xié)同催化體系的影響Fig. 6 Effect of reaction temperature on concentrations of GlcNAc and (GlcNAc)2

2.3.2 pH值對(duì)雙酶協(xié)同催化體系的影響

pH值也是影響雙酶協(xié)同催化效率的重要因素，在30 ℃和不同pH值（4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5）條件下，向100 g/L蝦殼幾丁質(zhì)（膠體幾丁質(zhì)35.8 g/L）中各加入30 U/mL ChiA和HJ5N的粗酶液進(jìn)行反應(yīng)12 h，定時(shí)取樣，通過(guò)HPLC檢測(cè)產(chǎn)物，結(jié)果如圖7所示。當(dāng)pH值為6時(shí)，雙酶協(xié)同催化反應(yīng)的GlcNAc質(zhì)量濃度最高，當(dāng)pH值小于5時(shí)，反應(yīng)液中只有少量GlcNAc存在，說(shuō)明此pH值下的ChiA、HJ5N很快變性失活。而當(dāng)pH值大于6時(shí)，GlcNAc質(zhì)量濃度也只有pH 6時(shí)的一半左右，證明了雙酶協(xié)同催化體系的最適反應(yīng)pH值為6，此時(shí)ChiA和HJ5N可以發(fā)揮出最大的活性。

圖7 pH值對(duì)雙酶協(xié)同催化體系的影響Fig. 7 Effect of reaction pH on GlcNAc concentration

2.3.3 其余因素對(duì)雙酶協(xié)同催化體系的影響

研究在30 ℃和pH 6的最適反應(yīng)條件下進(jìn)行雙酶協(xié)同催化反應(yīng)，并通過(guò)HPLC檢測(cè)產(chǎn)物濃度。探究底物質(zhì)量濃度、雙酶添加比（加酶量（U）計(jì)）對(duì)雙酶協(xié)同催化體系的影響，結(jié)果如圖8所示。

圖8A為不同底物質(zhì)量濃度（40、50、60、70、80、90、100 g/L）對(duì)雙酶催化體系的影響，其中ChiA和HJ5N各添加30 U/mL。催化反應(yīng)所用底物來(lái)源為蝦殼幾丁質(zhì)，其幾丁質(zhì)含量并非100%。經(jīng)過(guò)預(yù)處理除去蝦殼雜質(zhì)后，剩余所得為膠體幾丁質(zhì)干質(zhì)量，經(jīng)烘干、稱(chēng)質(zhì)量、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=3.774x－3.455，x為底物質(zhì)量濃度，y為膠體幾丁質(zhì)質(zhì)量濃度）后發(fā)現(xiàn)膠體幾丁質(zhì)占比約33%，這與相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論一致[25,34]。根據(jù)產(chǎn)物GlcNAc質(zhì)量濃度與不同質(zhì)量濃度膠體幾丁質(zhì)對(duì)應(yīng)的底物質(zhì)量濃度比（即收率），探究底物質(zhì)量濃度對(duì)雙酶催化體系的影響，如圖8A所示，當(dāng)以40 g/L蝦殼幾丁質(zhì)（膠體幾丁質(zhì)11.4 g/L）為底物時(shí)，產(chǎn)物GlcNAc質(zhì)量濃度為9.11 g/L，收率達(dá)80%。當(dāng)蝦殼幾丁質(zhì)濃度上升到90 g/L（膠體幾丁質(zhì)30.3 g/L）時(shí)，GlcNAc質(zhì)量濃度為17.55 g/L，收率為58%。繼續(xù)增加蝦殼幾丁質(zhì)濃度到100 g/L（膠體幾丁質(zhì)35.8 g/L），GlcNAc質(zhì)量濃度反而下降到16.45 g/L，收率下降至46%。上述結(jié)果表明，雖然隨著底物質(zhì)量濃度的上升，產(chǎn)物GlcNAc質(zhì)量濃度也在升高，但是其收率卻在逐漸降低，證明即使雙酶協(xié)同催化可以消除產(chǎn)物抑制作用，但是由于底物膠體幾丁質(zhì)為多糖，隨著其質(zhì)量濃度升高，整個(gè)催化體系的黏度勢(shì)必會(huì)增加，進(jìn)而影響ChiA和HJ5N的活力，導(dǎo)致雙酶協(xié)同催化體系對(duì)膠體幾丁質(zhì)的降解效果降低，這也是收率下降的主要原因。

由圖8B可以看出，在固定ChiA添加量為30 U/mL的情況下，改變ChiA與HJ5N添加比對(duì)整個(gè)反應(yīng)的影響較小，最終的GlcNAc質(zhì)量濃度基本一致。因此按ChiA與HJ5N添加比為2∶1即保證雙酶協(xié)同催化體系對(duì)膠體幾丁質(zhì)的降解效果。

2.3.4 雙酶分步催化與協(xié)同催化效率對(duì)比

研究在上述最優(yōu)反應(yīng)條件下，對(duì)ChiA與HJ5N分步催化（反應(yīng)6 h在ChiA單獨(dú)催化的反應(yīng)液中添加HJ5N）與協(xié)同催化效率進(jìn)行對(duì)比分析，如圖9所示。結(jié)果表明，在不同底物質(zhì)量濃度下，當(dāng)ChiA與HJ5N分步催化時(shí)，由于產(chǎn)物抑制作用的存在，GlcNAc質(zhì)量濃度較低，且增長(zhǎng)緩慢。而當(dāng)ChiA與HJ5N協(xié)同催化時(shí)，GlcNAc質(zhì)量濃度會(huì)隨著底物質(zhì)量濃度上升而增加，且遠(yuǎn)高于分步催化的結(jié)果，證明了雙酶協(xié)同催化體系的有效性。

圖9 ChiA和HJ5N分步催化與協(xié)同催化產(chǎn)物質(zhì)量濃度對(duì)比圖Fig. 9 Comparison of GlcNAc concentration as a function of substrate concentration between stepwise and one-step catalysis

3 結(jié) 論

本研究建立的ChiA和HJ5N協(xié)同催化體系可以實(shí)現(xiàn)一步反應(yīng)高效降解膠體幾丁質(zhì)制備GlcNAc。通過(guò)對(duì)ChiA和HJ5N的協(xié)同作用機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)ChiA會(huì)被其產(chǎn)物(GlcNAc)2抑制酶活力，雙酶協(xié)同作用可以有效解除這種產(chǎn)物抑制作用。在高含量膠體幾丁質(zhì)下，雙酶協(xié)同催化降解膠體幾丁質(zhì)的效果遠(yuǎn)高于ChiA單獨(dú)催化。

探究了溫度、pH值、膠體幾丁質(zhì)質(zhì)量濃度、雙酶添加比對(duì)雙酶協(xié)同催化體系的影響。雙酶協(xié)同催化體系的最適反應(yīng)溫度為30 ℃，最適pH值為6，雙酶添加比對(duì)催化體系影響較小，ChiA與HJ5N比例2∶1即可。在上述最優(yōu)反應(yīng)條件下以40 g/L蝦殼幾丁質(zhì)（膠體幾丁質(zhì)11.4 g/L）為底物時(shí)，產(chǎn)物GlcNAc質(zhì)量濃度為9.11 g/L，收率達(dá)80%。當(dāng)蝦殼幾丁質(zhì)上升到90 g/L（膠體幾丁質(zhì)30.3 g/L）時(shí)，GlcNAc質(zhì)量濃度為17.55 g/L，收率為58%，該收率顯著高于Ma Wenlong等[35]通過(guò)微生物發(fā)酵法制備GlcNAc的收率37%。在酶法制備GlcNAc反應(yīng)過(guò)程中，底物多糖膠體幾丁質(zhì)質(zhì)量濃度升高會(huì)導(dǎo)致整個(gè)催化體系的黏度上升，進(jìn)而影響ChiA和HJ5N的活力，使GlcNAc整體收率下降。研究結(jié)果為酶法制備GlcNAc的工業(yè)應(yīng)用提供了一種有效策略。