蒜皮水溶性多糖的制備及結(jié)構(gòu)表征

蔣茂婷，冉艷紅，劉 娜，黃雪松,*

（1.暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632）

我國(guó)是世界最大的大蒜（Allium sativumL.）生產(chǎn)與消費(fèi)國(guó)，已占其國(guó)際貿(mào)易量的85%～90%。脫水蒜片是重要的國(guó)際貿(mào)易蒜加工品之一，其在加工過(guò)程中，產(chǎn)生了大量的蒜皮、蒜梗等副產(chǎn)品；根據(jù)脫水蒜片廠的統(tǒng)計(jì)，蒜皮的量一般為鮮蒜干質(zhì)量的5%。其實(shí)，蒜皮含有多種營(yíng)養(yǎng)成分及功能活性[1-2]，剛收獲鮮蒜的蒜皮可食性好，只是隨著采收時(shí)間延長(zhǎng)而干燥后，口感欠佳，以為“不可食”而已，故其常被丟棄或焚燒掉，僅有少量制成飼料或有機(jī)肥，造成了不必要的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。因此，為充分利用蒜皮資源，迫切需要研究其性能及化學(xué)組成、開(kāi)發(fā)其加工利用技術(shù)。

劉灣等[3]的研究表明蒜皮中水溶性粗多糖含量為（5.55±0.01）%，含量較高；但未見(jiàn)對(duì)其化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特性等方面的研究報(bào)道。多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，其結(jié)構(gòu)分析是糖化學(xué)研究的核心所在。因此本實(shí)驗(yàn)擬由蒜皮制備得蒜皮水溶性多糖（water-soluble polysaccharide from garlic skin，GSWSP），并研究其結(jié)構(gòu)特征，以期為GSWSP的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)，為蒜皮的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒜皮由山東金鄉(xiāng)縣大蒜研究所提供。

DEAE-52纖維素 美國(guó)GE公司；Sephadex G-100凝膠 上海源葉生物科技有限公司；濃硫酸、氫氧化鈉、氯化鈉（均為分析純） 天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇、苯酚、氯仿（均為分析純）廣州化學(xué)試劑廠；3,5-二硝基水楊酸（化學(xué)純） 上?；瘜W(xué)試劑公司；2,5-二羥基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB）、1-苯基-3-甲基-5-吡啶啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP） 美國(guó)Sigma公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；葡聚糖T-5、T-20、T-40、T-200，葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、木糖、果糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗糖 德國(guó)Augsburg公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國(guó)迪馬公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-9600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；CD-308粉碎機(jī) 順德市肯德利電器；SS-300三足式離心機(jī) 張家港市蘇南化工機(jī)械廠；LC-20A高效液相色譜儀、TM3030Plus型掃描電子顯微鏡日本島津公司；T18分散機(jī) 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；REFLEXTMIII基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted-laser-desorption-ionizer time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）儀、Equinox 55紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）儀、500 ultrashield核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）儀、Multimode 8原子力顯微鏡、D8 ADVANCE X射線衍射儀 德國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 GSWSP的制備

干燥蒜皮，粉碎后過(guò)60 目篩，加20 倍蒸餾水，用分散機(jī)組織破碎8 min，300 W、30 ℃超聲處理30 min，90 ℃恒溫水浴鍋浸泡40 min后，放置過(guò)夜。3 500 r/min離心20 min，取上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中60 ℃濃縮至可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，向濃縮后的蒜皮液中加入無(wú)水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)50%～80%后放置，沉淀過(guò)夜。取冷凍干燥后沉淀用蒸餾水溶解，過(guò)DEAE-52柱（2.5 cm×50 cm），分別用蒸餾水，0.3、0.6、0.9 mol/L NaCl溶液梯度洗脫。合并蒸餾水洗脫液中含多糖部分的流出液，過(guò)Sephadex G-100柱（1.2 cm×50 cm），蒸餾水洗脫。合并含多糖部分的流出液，冷凍干燥，即得GSWSP。提取分離過(guò)程中，采用苯酚-硫酸法[4]進(jìn)行跟蹤測(cè)試。

1.3.2 GSWSP純度鑒定

采用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）鑒定GSWSP純度[5]。色譜條件：PolySep-GPC-P4000色譜柱（7.8 mm×300 mm），流動(dòng)相蒸餾水，進(jìn)樣量10 μL，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射器（evaporative light-scattering detector，ELSD），ELSD撞擊器為關(guān)閉狀態(tài)，漂移管溫度110 ℃，載氣流速2.5 L/min。

1.3.3 GSWSP分子質(zhì)量測(cè)定

采用MALDI-TOF-MS[6]和HPGPC兩種方法測(cè)定。

MALDI-TOF-MS法：將GSWSP與適量DHB溶液混合，取0.5 μL混合液滴于樣品靶上，待溶劑揮發(fā)，樣品結(jié)晶后，進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定。

HPGPC法：測(cè)定條件同1.3.2節(jié)。以葡聚糖T-5、T-20、T-40、T-200和葡萄糖為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定獲得分子質(zhì)量-保留時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)曲線（lgmw=－0.331 3t＋9.076 7，n=5，r=－0.920 7）。

1.3.4 單糖組成與比例測(cè)定

1.3.4.1 制備GSWSP水解樣品

稱(chēng)取10 mg GSWSP，加入1 mL 2 mol/L TFA，封管后于110 ℃油浴水解4 h，減壓蒸餾除去TFA，并多次少量加入甲醇繼續(xù)蒸餾以除凈TFA。最后加入1 mL純水溶解，得水解樣品溶液。

1.3.4.2 水解樣品的測(cè)定

采用PMP柱前衍生化法測(cè)定GSWSP的醛糖和糖醛酸；使用糖柱無(wú)需衍生化直接測(cè)定GSWSP的果糖；綜合2 種方法測(cè)定結(jié)果獲得其單糖的組成與比例。

1）衍生化樣品：取GSWSP水解樣品溶液100 μL，加入100 μL 0.3 mol/L NaOH溶液和100 μL 0.5 mol/L PMP溶液，置于70 ℃烘箱反應(yīng)60 min，取出冷卻至室溫后，加入100 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和，并用1 mL氯仿重復(fù)萃取3 次去除PMP等雜質(zhì)。取上層水相加水1 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)后高效液相色譜測(cè)定分析。以各單糖標(biāo)準(zhǔn)樣品（甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖）為對(duì)照。

高效液相色譜條件：Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.8），B為乙腈；A-B（17∶83，V/V）等度洗脫；進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm[7-8]。

2）未衍生化樣品：將GSWSP水解樣品溶液稀釋至約1 mg/mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)后高效液相色譜測(cè)定分析。以各單糖標(biāo)準(zhǔn)樣品（果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖）為對(duì)照。

高效液相色譜條件：Prevail Carbohydrate ES柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為水， B為乙腈；采用梯度洗脫方式，梯度條件：0～5 min，25%～50% A，75%～50% B；5～12 min，50%～25% A，50%～75% B；12～15 min，25% A，75% B。進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測(cè)器為ELSD，ELSD撞擊器為關(guān)閉狀態(tài)，漂移管溫度90 ℃，載氣流速2.5 L/min[9]。

1.3.5 構(gòu)型與連接方式測(cè)定

NMR測(cè)定：GSWSP溶解在D2O中，質(zhì)量濃度為40 mg/mL。使用500 MHz NMR儀，在30 ℃記錄1H、13C、1H-1H COSY和1H-13C HSQC NMR光譜。

IR測(cè)定：GSWSP和KBr按質(zhì)量比1∶100混合研磨均勻，壓片，在4 000～400 cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.3.6 三股螺旋結(jié)構(gòu)測(cè)定

1.3.6.1 剛果紅實(shí)驗(yàn)

取1.0 mL 2 mg/mL GSWSP溶液，分別加入3 mL不同濃度（0～1.0 mol/L）的NaOH溶液，1.5 mL 0.2 mmol/L剛果紅溶液及0.5 mL蒸餾水，渦旋混勻后，靜置1 h，運(yùn)用紫外分光光度計(jì)在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描[10]，記錄樣品在不同終濃度NaOH溶液體系中的最大吸收波長(zhǎng)。并以此為縱坐標(biāo)，NaOH溶液的終濃度為橫坐標(biāo)作圖。以蒸餾水為空白對(duì)照。

1.3.6.2 圓二色譜掃描

GSWSP用蒸餾水配制成1 mg/mL的溶液，然后用圓二色譜儀檢測(cè)其圓二色性，掃描波長(zhǎng)范圍為190～300 nm。

1.3.7 結(jié)晶度測(cè)定

采用X射線衍射儀測(cè)定GSWSP的結(jié)晶度[11]。測(cè)定條件：Cu-Kα輻射，掃描速率2 °/min，采樣步寬0.05°，掃描范圍2θ為4°～50°。

1.3.8 GSWSP介觀（微米或亞微米[12]）結(jié)構(gòu)表征

1.3.8.1 分子形貌測(cè)定

GSWSP用超純水配制成10 μg/mL的溶液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜后，用微量移液槍吸取5 μL多糖溶液，滴在潔凈的云母片上，置于室溫下風(fēng)干后進(jìn)行原子力顯微鏡觀察。

1.3.8.2 表觀形貌測(cè)定

取適量?jī)龈蒅SWSP均勻的粘在樣品盤(pán)上，吹去浮沫，噴金后在掃描電子顯微鏡下觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化分析結(jié)果

蒜皮經(jīng)水提醇沉后得水溶性粗多糖，得率為（6.92±0.07）%，略高于劉灣等[3]測(cè)得的（5.55±0.01）%，可能與蒜皮品種、新鮮程度等原料不同有關(guān)，也與浸泡時(shí)間、提取溫度等提取條件不同有關(guān)。

蒜皮水溶性粗多糖溶液上樣于DEAE-52柱，經(jīng)蒸餾水、0.3、0.6、0.9 mol/L NaCl溶液洗脫后，得到2 個(gè)吸收峰，其中蒸餾水洗脫部分（圖1a峰1）為多糖含量最高組分，收集該部分通過(guò)Sephadex G-100柱進(jìn)一步純化后得GSWSP，其洗脫峰為單峰（圖1b），表明GSWSP為均一組分，其得率為（2.83±0.02）%，呈粉末狀。

圖1 GSWSP分離純化圖Fig. 1 Separation and purification of GSWSP on DEAE-52 and Sephadex G-100

2.2 GSWSP的純度

GSWSP在HPGPC上的保留時(shí)間為16.913 min（圖2），且為單一、對(duì)稱(chēng)的尖峰，其結(jié)果與大蒜多糖純度測(cè)定結(jié)果[6]類(lèi)似。由面積歸一化法得GSWSP純度為95.57%，表明其純度較高，可滿足其結(jié)構(gòu)表征的要求。

圖2 GSWSP的HPGPC圖Fig. 2 HPGPC profile of GSWSP

2.3 GSWSP的一級(jí)結(jié)構(gòu)特征

2.3.1 分子質(zhì)量

2.3.1.1 MAIDI-TOF-MS測(cè)定結(jié)果

由圖3可以看出，GSWSP能被有效離子化，得到系列陽(yáng)離子峰。其中強(qiáng)度高的系列陽(yáng)離子峰，實(shí)際是GSWSP系列分子離子峰[M＋Na]＋，這是因?yàn)镚SWSP是由不同分子質(zhì)量聚糖組成；根據(jù)系列陽(yáng)離子峰，可以推斷GSWSP的分子質(zhì)量范圍在731～2 615 Da之間；這與其他多糖情況一致[13-14]，也基本符合Sephadex G-100柱分離純化1～100 kDa分子質(zhì)量范圍內(nèi)大分子化合物的特性。至于[M＋Na]＋附近較小的陽(yáng)離子峰，則是多糖分子失去質(zhì)子、羥甲基、甲氧基、水等所形成的離子峰。

除由圖3可以看出GSWSP的分子質(zhì)量范圍信息外，還可以分析出其他信息：

1）高強(qiáng)度的相鄰兩峰間的質(zhì)荷比差值（Δm/z），大多是162，推測(cè)為失去一分子水的己糖相對(duì)分子質(zhì)量（162=180－18），即表明GSWSP主要由己糖構(gòu)成。2）個(gè)別高強(qiáng)度的兩相鄰峰間Δm/z為158，推測(cè)可能為失去兩分子水的糖醛酸相對(duì)分子質(zhì)量（158=194－18×2）。3）個(gè)別高強(qiáng)度的兩相鄰峰間Δm/z為131，推測(cè)可能為失去一分子水和一個(gè)甲基的鼠李糖或巖藻糖相對(duì)分子質(zhì)量（131=164－18－15），但考慮到巖藻糖主要存在于海藻及樹(shù)膠中[15]，因此其更可能為鼠李糖殘基。4）個(gè)別高強(qiáng)度的相鄰兩峰間Δm/z為136，推測(cè)可能為失去一分子水的戊糖相對(duì)分子質(zhì)量，但戊糖失去一分子水的相對(duì)分子質(zhì)量應(yīng)為132（132=150－18），引起這種差異的原因可能是在低質(zhì)量范圍內(nèi)（＜800 Da）DHB產(chǎn)生背景干擾造成[16]，但其具體原因還需進(jìn)一步驗(yàn)證。5）當(dāng)高強(qiáng)度峰m/z為731時(shí)，推斷[17]其符合通式（176×3＋162）＋18＋23，即分子式為A3H1，以此類(lèi)推得GSWSP可能具有A4H10PRha型分子式（各符號(hào)含義見(jiàn)表1注）。6）從表1推測(cè)的可能分子式可以看出：所有可能的分子式均含有至少3 個(gè)A（糖醛酸），說(shuō)明糖醛酸穩(wěn)定地存在于GSWSP中；根據(jù)可能的分子式中4 種糖的出現(xiàn)次數(shù)，可判斷GSWSP中各糖含量為H＞A＞P＞Rha。

綜上所述：GSWSP為由己糖、糖醛酸、戊糖、鼠李糖等組成的雜多糖，其分子質(zhì)量范圍在731～2 615 Da，應(yīng)當(dāng)具有A4H10PRha型分子式（表1）。

圖3GSWSP的MALDI-TOF-MS圖Fig. 3 MALDI-TOF-MS spectrum of GSWSP

表1 各離子峰的歸屬Table 1 Assignment of all ion peaks shown

2.3.1.2 HPGPC測(cè)定的分子質(zhì)量

由圖2可知，GSWSP的保留時(shí)間為16.913 min，結(jié)合分子質(zhì)量-保留時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得GSWSP的分子質(zhì)量為2 969 Da，高于MALDI-TOF-MS測(cè)定的結(jié)果（731～2 615 Da）。

MALDI-TOF-MS與HPGPC所測(cè)分子質(zhì)量差異的原因可能是HPGPC法是依據(jù)對(duì)照品的分子體積獲得測(cè)定結(jié)果，其準(zhǔn)確性取決于樣品與對(duì)照品結(jié)構(gòu)的相似性。MALDI-TOF-MS法是采用脈沖激光使樣品分子離子化獲得測(cè)定結(jié)果，無(wú)需對(duì)照品，測(cè)定分子質(zhì)量的確定值；但激光照射多糖分子發(fā)生電離時(shí)，能量容易向低分子質(zhì)量樣品轉(zhuǎn)移[18]，所以一般樣品分子質(zhì)量越大，越不易發(fā)生離子化作用，電荷強(qiáng)度則相對(duì)降低，即越是分子質(zhì)量大的分子，其峰強(qiáng)度越低，以至于無(wú)法獲取。因此，MALDI-TOF-MS法的分子質(zhì)量測(cè)定值低于HPGPC法。

綜合上述分析，GSWSP的分子質(zhì)量應(yīng)確定約為2 969 Da。

2.3.2 單糖組成與比例

如圖4A所示，GSWSP由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖（圖4A（b）中的2、3、5、6、7和8）6 種單糖組成；進(jìn)一步證實(shí)了據(jù)MAODITOF-MS所分析的GSWSP中含有鼠李糖、半乳糖醛酸（即糖醛酸）的結(jié)果；其中己糖（即包括甘露糖、葡萄糖、半乳糖）含量最高；至于MAODI-TOF-MS所分析的戊糖，為圖4A所測(cè)定的阿拉伯糖。圖4B顯示，GSWSP由果糖和葡萄糖（圖4B（b）9和10）2 種單糖組成。

由各單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算GSWSP中各單糖含量，以葡萄糖含量為換算系數(shù)，得GSWSP的單糖組成及物質(zhì)的量比為果糖∶葡萄糖∶半乳糖醛酸∶半乳糖∶甘露糖∶阿拉伯糖∶鼠李糖=81.8∶17.6∶15.6∶14.5∶6.5∶4.2∶1，其中果糖含量最高，且具有較高的半乳糖醛酸含量，說(shuō)明GSWSP具有較好的水溶性、吸濕性和保濕性等理化特性，可用于食品、食品配料或添加劑、化妝品等領(lǐng)域。此結(jié)果與MALDI-TOF-MS得到的可能分子式A4H10PRha（表1）及各糖含量H＞A＞P＞Rha較為一致，如上所述：其中H包括果糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖，A、P和Rha則分別為半乳糖醛酸、阿拉伯糖和鼠李糖。

圖4 GSWSP的單糖組成與比例色譜圖Fig. 4 Chromatograms showing the monosaccharide composition of GSWSP

2.3.3 構(gòu)型與連接方式

2.3.3.1 NMR的結(jié)果與分析

將GSWSP的1H、13C NMR譜（圖5a和圖5b）結(jié)合1H-1H COSY、1H-13C HSQC NMR譜（圖5c和圖5d）分析，其結(jié)果如下：

1）糖殘基種類(lèi)[19]與GSWSP中單糖組成測(cè)定結(jié)果一致。

在1H NMR譜（圖5a）δ4.3～5.9區(qū)域有5 個(gè)異頭氫信號(hào)，分別為δ4.40、4.42、5.13、5.14和5.26，峰面積比為2.00∶1.87∶1.25∶1.00∶4.12，結(jié)合GSWSP單糖組成與比例分析結(jié)果及數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比推測(cè)得δ4.40、4.42、5.13、5.14和5.26分別對(duì)應(yīng)于半乳糖醛酸、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和葡萄糖的H1；在13C NMR譜（圖5b）δ90～112區(qū)域有6 個(gè)異頭碳信號(hào)，分析結(jié)果如表2所示，即除了上述5 種糖殘基外，還含有果糖，此外，δ174.59和δ19.53分別為半乳糖醛酸和鼠李糖的C6特征信號(hào)[20]，而對(duì)于無(wú)法得出鼠李糖的異頭氫和異頭碳信號(hào)，可能是因?yàn)槠浞迮c其他糖殘基峰發(fā)生了信號(hào)重疊或峰信號(hào)強(qiáng)度過(guò)低所致。即NMR糖殘基種類(lèi)分析結(jié)果與GSWSP中單糖組成測(cè)定結(jié)果一致。

2）糖殘基的端基差向異構(gòu)[21]：在1H NMR譜異頭氫信號(hào)區(qū)域（δ4.3～5.9）中有3 個(gè)H1信號(hào)高于δ5.0，分別為δ5.13、5.14和5.26，表明甘露糖、阿拉伯糖和葡萄糖為α構(gòu)型糖基；而果糖、半乳糖醛酸和半乳糖H1信號(hào)低于δ5.0，為β構(gòu)型糖基，即GSWSP中同時(shí)存在α和β兩種端基差向異構(gòu)構(gòu)型。

3）連接位置[20]：根據(jù)表2 NMR信號(hào)歸屬，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)單糖碳譜，果糖C1信號(hào)（δ59.74、59.94）、C2信號(hào)（δ102.65、103.13、103.28、103.44），C6信號(hào)（δ62.02、62.67）的化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)，因此，推測(cè)果糖殘基的連接位置分別為→1)-β-D-Fruf-(2→、→1,6)-β-D-Fruf-(2→、→6)-β-D-Fruf-(2→、β-DFruf-(2→；葡萄糖C1信號(hào)（δ95.48）的化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)，因此推測(cè)葡萄糖殘基的連接位置為α-D-Glc-(1→；半乳糖C1信號(hào)（δ102.65）的化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)，因此半乳糖殘基的連接位置可能為β-D-Gal-(1→；對(duì)于其他糖殘基，由于不能明確判斷其相關(guān)峰信號(hào)，所以也無(wú)法得出具體連接位置。

GSWSP中的果糖和葡萄糖的連接位置與1-蔗果三糖型果聚糖[6]中糖殘基的連接位置相似；但由于組成GSWSP的單糖種類(lèi)較多，糖殘基連接方式復(fù)雜，二維核磁圖譜重疊嚴(yán)重，無(wú)法直接由二維核磁圖譜推斷出各糖殘基間的連接位置。因此無(wú)法確定其具體糖殘基連接方式，這是由雜多糖特點(diǎn)決定，這為選擇多種糖苷酶進(jìn)行水解提供依據(jù)。

4）糖環(huán)構(gòu)型[20]：一般來(lái)說(shuō)，呋喃糖的C3或C5在δ80～84間有信號(hào)。由圖5b可以看出，僅果糖的C5信號(hào)（δ80.47、80.52、80.65）在δ80～84間，即GSWSP中的果糖為呋喃糖，這與大多數(shù)自然界中的果糖一樣；而其余單糖為吡喃糖，表明GSWSP中同時(shí)存在吡喃環(huán)和呋喃環(huán)2 種糖環(huán)構(gòu)型。

綜上所述：GSWSP中存在→1)-β-D-Fruf-(2→、→1,6)-β-D-Fruf-(2→、→6)-β-D-Fruf-(2→、β-DFruf-(2→、α-D-Glc-(1→和β-D-Gal-(1→六種糖殘基及β-DGalA、α-D-Man和α-D-Ara三種基團(tuán)，且同時(shí)存在呋喃糖與吡喃糖。其中果糖殘基的含量最高，與GSWSP的單糖組成與比例結(jié)果一致，表明GSWSP為典型的雜果聚糖。

圖5 GSWSP的NMR圖Fig. 5 NMR spectra of GSWSP

表2 GSWSP的NMR信號(hào)歸屬Table 2 Assignment of NMR signals of GSWSP

2.3.3.2 IR測(cè)定結(jié)果

由圖6可知，3 384 cm－1為多糖羥基（O—H）特征伸縮振動(dòng)峰；2 931 cm－1和1 410 cm－1分別為亞甲基（C—H）伸縮振動(dòng)和剪切振動(dòng)的相關(guān)峰；1 609 cm－1為羧酸根—COO－羰基（C=O）伸縮振動(dòng)峰，證實(shí)了GSWSP中存在半乳糖醛酸，且可能主要是以—COO－形式存在；1 129 cm－1和1 025 cm－1是多糖中的（C—O—C，C—O—H）伸縮振動(dòng)引起的；存在吡喃環(huán)醚鍵（—C—O—C—）非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰（934 cm－1）、呋喃環(huán)（C1—H）變角振動(dòng)峰（822 cm－1）[22-25]，其進(jìn)一步證實(shí)了GSWSP的單糖組成有吡喃環(huán)和呋喃環(huán)2 種糖環(huán)構(gòu)型，支持了13C NMR結(jié)果。

圖6 GSWSP紅外吸收光譜圖Fig. 6 Infrared absorption spectrum of GSWSP

2.4 GSWSP的高級(jí)結(jié)構(gòu)特征

2.4.1 三股螺旋結(jié)構(gòu)

2.4.1.1 剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

在一定濃度的NaOH范圍內(nèi)，剛果紅可與具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的多糖形成絡(luò)合物，其最大吸收波長(zhǎng)較剛果紅發(fā)生紅移現(xiàn)象[27]。如圖7所示，當(dāng)NaOH濃度為0 mol/L時(shí)，剛果紅溶液的最大吸收波長(zhǎng)為488 nm，而GSWSP剛果紅溶液的最大吸收波長(zhǎng)則紅移到了495 nm，這說(shuō)明GSWSP與剛果紅形成了絡(luò)合物，顯示GSWSP具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。

圖7 不同NaOH濃度下GSWSP與剛果紅復(fù)合物最大吸收波長(zhǎng)Fig. 7 Maximum absorption wavelength of GSWSP and Congo red complex under different NaOH concentrations

當(dāng)NaOH濃度為0.05～0.20 mol/L時(shí)，GSWSP剛果紅絡(luò)合物與剛果紅溶液相比最大吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)無(wú)規(guī)則變化，可能原因是GSWSP處于亞穩(wěn)定區(qū)所致，即GSWSP的三股螺旋結(jié)構(gòu)正經(jīng)歷螺旋-單鏈構(gòu)象的轉(zhuǎn)變；當(dāng)NaOH濃度大于0.20 mol/L時(shí)，隨著NaOH濃度的增加，GSWSP剛果紅絡(luò)合物溶液的最大吸收波長(zhǎng)開(kāi)始下降，與剛果紅溶液變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明GSWSP的三股螺旋結(jié)構(gòu)在高濃度NaOH的作用下已經(jīng)解體，不再與剛果紅形成絡(luò)合物。

2.4.1.2 圓二色譜分析

研究表明，具有三股螺旋結(jié)構(gòu)多糖的圓二色譜圖中會(huì)顯示負(fù)科頓效應(yīng)[28]。如圖8所示，GSWSP在波長(zhǎng)200 nm處具有負(fù)峰，顯示了負(fù)科頓效應(yīng)，說(shuō)明GSWSP具有三股螺旋結(jié)構(gòu)，這與剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；在波長(zhǎng)215 nm處具有正峰，顯示了正科頓效應(yīng)，可能與GSWSP生色羧基基團(tuán)中的C—O和O—H有關(guān)。

GSWSP的三股螺旋結(jié)構(gòu)，使其可能具有一定的生物活性[29]；另外，也具備了用于藥物遞送和控釋領(lǐng)域的潛能[30]。

圖8 GSWSP的圓二色譜圖Fig. 8 Circular dichroism spectrum of GSWSP

2.4.2 結(jié)晶度

由圖9可以看出，GSWSP衍射角在29.51°有明顯尖峰，說(shuō)明其含有粒度較大的微晶；在11.52°和19.31°時(shí)分別有一個(gè)彌散寬峰，說(shuō)明其不僅存在微晶體系，還存在微晶與非晶共存、亞微晶與非晶共存的多晶體系[31]，即GSWSP具有一定的結(jié)晶結(jié)構(gòu)或結(jié)晶度。此結(jié)果與菊粉類(lèi)果聚糖[24]的X衍射結(jié)果相似。

圖9GSWSP的X-射線衍射圖Fig. 9 X-ray diffraction pattern of GSWSP

2.5 GSWSP的介觀結(jié)構(gòu)特征

2.5.1 分子形貌

由圖10可知，GSWSP的原子力顯微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)球形，直徑約為25～111 nm，遠(yuǎn)大于單個(gè)糖鏈寬度（0.1～1 nm）[32]，因此可說(shuō)明GSWSP的原子力顯微結(jié)構(gòu)為糖鏈的聚集體，即GSWSP在水溶液中通過(guò)分子間氫鍵及范德華力發(fā)生了相互纏繞。

圖10 GSWSP的原子力顯微鏡圖Fig. 10 Atomic force microscopic images of GSWSP

2.5.2 表觀形貌

在低倍鏡下（圖11a）可以看出，GSWSP由不規(guī)則和破碎的塊狀組成，表面有碎片；在高倍鏡下（圖11b）可以看出，其具有結(jié)構(gòu)緊密及相對(duì)平整的表面，可能是由于GSWSP中存在的半乳糖醛酸，使分子間相互作用力增大所致。

圖11 GSWSP的掃描電鏡圖Fig. 11 Scanning electron micrographs of GSWSP

GSWSP在介觀尺度上的表觀形貌與其分子形貌顯示結(jié)果存在較大差異，原因如下：儀器分辨率不同：GSWSP的表觀形貌為微米級(jí)，而分子形貌為納米級(jí)；GSWSP的狀態(tài)不同：表觀形貌是直接觀測(cè)GSWSP的粉末狀構(gòu)象，而分子形貌是GSWSP在水溶液中的構(gòu)象。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從蒜皮中獲得GSWSP，測(cè)得其分子質(zhì)量為2 969 Da，組成單糖為果糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和鼠李糖，其物質(zhì)的量比為81.8∶17.6∶15.6∶14.5∶6.5∶4.2∶1，存在→1)-β-DFruf-(2→、→1,6)-β-D-Fruf-(2→、→6)-β-D-Fruf-(2→、β-D-Fruf-(2→、α-D-Glc-(1→和β-D-Gal-(1→六種糖殘基與β-D-GalA、α-D-Man和α-D-Ara三種基團(tuán)；其在溶液中具有三股螺旋高級(jí)結(jié)構(gòu)，固體粉末有一定的結(jié)晶度；原子力顯微鏡下GSWSP呈現(xiàn)球形結(jié)構(gòu)，掃描電鏡下呈現(xiàn)不規(guī)則和破碎的塊狀結(jié)構(gòu)。其結(jié)果說(shuō)明GSWSP有用于食品、食品配料或添加劑、化妝品等產(chǎn)品的潛力。