大豆蛋白肽聚集體與EGCG復(fù)合納米顆粒及其乳液特性

董亞博，蘭 天，付元濤，孫書境，李 萌，江連洲，隋曉楠，張 妍,2,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

酶水解大豆蛋白不僅具備豐富的營養(yǎng)價值還具備多種生物活性[1]。Zhang Lei等[2]研究表明大豆蛋白的特異性水解產(chǎn)物具有清除自由基和過渡金屬螯合活性。同時García-Nebot等[3]還發(fā)現(xiàn)大豆蛋白的一種水解肽對亞油酸的過氧化進程有抑制作用。此外，從大豆蛋白中提取的多肽還具有降低膽固醇和體脂、預(yù)防骨質(zhì)疏松、抑制血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶和抗高血壓等多種對健康有益的特性[4]。然而，在大豆蛋白水解過程中，由于疏水性氨基酸或疏水性蛋白的暴露，會不可避免地發(fā)生肽-肽聚集或蛋白-肽的相互作用，從而形成不溶性肽聚集體[5]。這些不理想的聚集體質(zhì)量可達總質(zhì)量的40%，顯著降低肽的可提取性和提取率。此外，這些聚集體通常被丟棄或用作動物飼料的原料，從而大大降低大豆蛋白的利用率，也增加對環(huán)境的不利影響。

(－)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）作為一種只存在于茶中的天然兒茶素（其他兒茶素也存在于水果和蔬菜中），通常被作為綠茶產(chǎn)品的質(zhì)量指標[6]。EGCG是一種強大的抗氧化劑，可以保護食物和生物體免受自由基介導(dǎo)的氧化損傷。此外，蛋白質(zhì)與多酚之間的相互作用也會通過修飾蛋白質(zhì)分子影響其生理活性。已有研究[7]證明兒茶素與大豆蛋白的結(jié)合會引起蛋白結(jié)構(gòu)和功能的變化。研究[8]表明EGCG與β-乳球蛋白通過疏水相互作用和氫鍵改變蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，形成更加穩(wěn)固的結(jié)構(gòu)。在堿性條件下（pH 9.0），茶多酚與大豆蛋白的共價相互作用使蛋白質(zhì)粒徑變大，疏水性降低，顯著提高蛋白質(zhì)的乳化能力和乳液穩(wěn)定性[9]。Kerckhoffs等[1]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EGCG修飾后，大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）結(jié)構(gòu)變得松散，暴露出更多的活性基團，從而使其發(fā)泡、乳化和抗氧化性能得到改善。

盡管已有研究表明大豆蛋白肽聚集體（soybean peptide aggregates，SPA）具有作為一種優(yōu)良的乳液穩(wěn)定劑的潛力[10]，但目前獲得的信息仍然非常有限。因此，本研究試圖通過與EGCG復(fù)合進一步改善SPA的理化特性，提高大豆蛋白的水解利用率，達到大豆蛋白的高值化利用，以期減少酶解廢棄物對環(huán)境的影響，并為SPA在食品工業(yè)中的進一步應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI由實驗室自制；葵花籽油 市購；EGCG（純度98%） 西安通澤生物技術(shù)公司；堿性蛋白酶2.4 L（2.4 AU/g） 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastersizer 2000激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；Microfuge 20R冷凍離心機 美國貝克曼公司；數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；X’pert PRO衍射儀 荷蘭PANalytical公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

參考Zhang Qiaozhi等[11]的方法稍加修改。大豆磨粉過篩，與正己烷混合3 次脫脂得到脫脂豆粉。將脫脂豆粉溶于去離子水中，并用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，45 ℃連續(xù)攪拌2 h后，6 000×g離心30 min后收集上清液，用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH值至4.5以沉淀蛋白質(zhì)，6 500×g離心20 min收集沉淀。將得到的沉淀用去離子水洗3 次，并用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，冷凍干燥，得到SPI粉末。

1.3.2 SPA的制備

以SPI為原料，采用酶解法制備SPA。將凍干SPI與去離子水混合使其質(zhì)量濃度為4 g/100 mL。然后加入1 g/100 mL堿性蛋白酶，并用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5，溫度保持50 ℃，反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液加熱到85 ℃并保持10 min，然后置于冰水中冷卻降至室溫，使堿性蛋白酶滅活終止反應(yīng)。隨后，用2 mol/L HCl溶液中和，調(diào)節(jié)pH值至7.0，并于8 000×g離心20 min，分離不溶性蛋白聚集物即為SPA。

1.3.3 納米顆粒的制備

參照Liu Fu等[12]的方法稍作修改進行納米顆粒的制備。將凍干SPA粉末分散于去離子水中，連續(xù)攪拌2 h，配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的SPA分散液，4 ℃過夜，以確保完全水化。將EGCG粉末按凍干SPA粉末質(zhì)量的0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.2%、1.6%和2.0%加入SPA分散液中，室溫下避光攪拌2 h得到SPA-EGCG復(fù)合物溶液。取不同添加比例的SPA-EGCG復(fù)合物溶液各30 mL進行超聲（900 W、25 kHz）處理10 min，得到SPA-EGCG納米顆粒（SPA-EGCG nanoparticles，ESNPs）。以未加入EGCG的納米顆粒（SNPs）為對照。ESNPs和SNPs以液體形式或凍干保存在4 ℃冰箱中，用于特性分析。

1.3.4 納米顆粒粒徑的測定

參考鞠夢楠等[13]的方法，測定前用pH 7.0、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將質(zhì)量濃度10 mg/mL的SPA、SNPs和ESNPs分散液稀釋100 倍，以避免聚集。

1.3.5 納米顆粒Zeta電位的測定

參考Tao Fei等[14]的方法，為避免顆粒聚集影響測定結(jié)果，用pH 7.0、0.01 mol/L PBS將10 mg/mL 的SPA、SNPs和ESNPs分散液稀釋1 000 倍，過0.45 μm水系膜后進行Zeta電位測定。

1.3.6 納米顆粒熒光光譜測定

根據(jù)Zhang Nanhai等[15]的方法，將10 mg/mL的SPA、SNPs和ESNPs分散液用10 mol/L PBS在室溫下稀釋100 倍。用熒光分光光度計測定熒光光譜。發(fā)射光譜范圍300～500 nm，激發(fā)波長280 nm。

1.3.7 納米顆粒X射線衍射的測定

利用X’pert PRO衍射儀，設(shè)置參數(shù)為電流40 A，電壓40 kV。Cu Kα X射線波長為0.1541 8 nm。在2θ4～75°、掃描速率0.056 °/s條件下捕獲X射線衍射圖。

1.3.8 乳液制備

參照Yang Han等[16]的方法加以修改。將40 mg/mL的SPA、SNPs和ESNPs分散液與葵花籽油混合，油相體積分數(shù)（φ）40%～60%，總體積20 mL。使用均質(zhì)機于12 000 r/min均質(zhì)2 min，制得乳液。

1.3.9 乳化性及乳化穩(wěn)定性測定

根據(jù)You Yaohui等[17]的方法，將新制乳液用0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液稀釋100 倍。使用紫外分光光度計測定，并以相同濃度SDS溶液調(diào)零?；靹蚝罅⒓醋x取樣品在500 nm波長處吸光度（A0）。放置10 min后，記錄相同波長下吸光度（A10）。乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）分別按式（1）、（2）計算：

式中：n為樣品稀釋倍數(shù)100；ρ為納米顆粒質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為油相體積分數(shù)/%。

1.3.10 乳液粒徑測定

參照1.3.3節(jié)方法進行。

1.3.11 乳液初級氧化產(chǎn)物測定

按照Shantha等[18]所述方法測定初級氧化產(chǎn)物脂質(zhì)過氧化值（peroxide values，POV）。將乳液倒入玻璃小瓶在60 ℃條件下加速氧化7 d，每天取樣評估乳液的氧化穩(wěn)定性。將15 mL醋酸-氯仿（3∶1，V/V）與0.3 mL乳液充分混合，渦旋振蕩10 s后，2 000×g離心10 min，取上清液0.2 mL與2.8 mL甲醇-正丁醇（2∶1，V/V）、15 μL 3.9 mol/L硫氰酸鉀溶液和15 μL 0.072 mol/L Fe2＋溶液充分混合，于室溫下暗反應(yīng)20 min。使用紫外分光光度計測定510 nm波長處吸光度，甲醇-丁醇（2∶1，V/V）作空白。以苯氫過氧化物為標準品，繪制標準曲線，根據(jù)曲線方程y=8.472x－0.070 9（R2=0.997 9）計算樣品POV。

1.3.12 乳液次級氧化產(chǎn)物的測定

參照Yang Jiayi等[19]的方法并稍作修改。用少量2 mol/L NaOH溶液溶解三氯乙酸后，再用去離子水稀釋，配制10 g/100 mL三氯乙酸溶液；然后用10 g/100 mL三氯乙酸溶液配制1 g/100 mL硫代巴比妥酸溶液。將1.0 mL乳液樣品與5 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液和2 mL 1 g/100 mL硫代巴比妥酸溶液混合，煮沸30 min，冷卻至室溫。將混合溶液與氯仿按體積比1∶3混合，4 000×g離心15 min，取上清液，用酶標儀測定532 nm波長處吸光度。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷為標準品，繪制標準曲線，根據(jù)曲線方程y=7.734 4x＋0.032 9（R2=0.998 3）計算樣品丙二醛含量。

1.3.13 乳液光學顯微鏡觀察

用pH 7.0、0.01 mol/L PBS將1 mL乳液樣品稀釋10 倍，取10 μL稀釋后乳液滴于載玻片上，用蓋玻片固定，采用正置顯微成像系統(tǒng)觀察乳液。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

2 結(jié)果與分析

2.1 納米顆粒粒徑

圖1 納米顆粒粒徑分布Fig. 1 Particle size distribution of nanoparticles

由圖1可知，SPA分散液有2 個明顯的峰，分別位于442 nm和955 nm處，經(jīng)超聲處理后生成的SNPs粒徑特征峰左移至142 nm附近，表明超聲作用有效地減小了蛋白質(zhì)顆粒的粒徑。超聲波減小蛋白質(zhì)顆粒粒徑的作用已得到廣泛報道，如向日葵分離蛋白顆粒[20]和乳清蛋白[21]在超聲作用后顆粒粒徑減小。超聲波能有效分解團聚體和聚集體，并通過破壞非共價相互作用減小顆粒粒徑[22]。Shanmugam等[23]報道，超聲空化效應(yīng)能夠減小蛋白質(zhì)顆粒大小，從而提高其溶解性。當EGCG添加量增加到2%時，ESNPs的粒徑減小到58.8 nm，表明在SPA中添加EGCG可以促進超聲后更小顆粒的形成。而EGCG能與食物蛋白相互作用形成大聚集體。Zagury等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在EGCG存在的情況下，β-乳球蛋白顆粒粒徑至少增大3～4 倍。據(jù)報道EGCG與大豆蛋白之間的主要作用力是疏水相互作用[25]，而超聲處理會使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的疏水殘基[26]，這些暴露的殘基促進蛋白之間的疏水相互作用，從而有助于蛋白質(zhì)聚集體的形成。此外，Lum等[27]報道稱疏水殘基在形成團簇前需排出水分子。同時，EGCG分子具有將水分子從蛋白質(zhì)表面排出的能力[28]。EGCG可能通過驅(qū)逐水分子促進相鄰解折疊蛋白之間的疏水相互作用，從而降低蛋白質(zhì)聚集的活化能壘。然而蛋白質(zhì)快速聚集后，疏水殘基定向形成致密的結(jié)構(gòu)，抵抗進一步的聚集。本研究旨在分析EGCG和超聲在減少蛋白質(zhì)聚集物粒徑大小方面的協(xié)同效應(yīng)，并且Yang Han等[16]報道，粒徑較小的蛋白顆粒能夠在油-水界面迅速吸附到油滴上，從而增加乳液液滴的比表面積，形成更穩(wěn)定的乳液。EGCG添加量0.8%的ESNPs粒徑最?。?0.7 nm），選擇EGCG添加量0.8%的ESNPs制備乳液。

2.2 納米顆粒Zeta電位分析

圖2 納米顆粒Zeta電位Fig. 2 Zeta potential of nanoparticles

從圖2可以看出，所有樣品Zeta電位均為負值，即帶負電氨基酸的數(shù)量多于帶正電氨基酸。與SPA相比，SNPs和ESNPs的Zeta電位絕對值有所增加，這是由于超聲處理使蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，增加了蛋白質(zhì)表面陰離子基團的暴露。中、高功率下超聲處理可能會增加蛋白質(zhì)表面電荷，提高蛋白顆粒間的靜電斥力，阻礙聚合，增強蛋白分散體系穩(wěn)定性，從而提高SNPs和ESNPs的溶解度[29]。此外，隨著EGCG添加量的增加，ESNPs的Zeta電位絕對值增大，在EGCG添加量0.8%達到最大（由17.0增加至34.12），這歸因于帶負電荷的EGCG與蛋白的結(jié)合。當Zeta電位絕對值增大，離子間的靜電斥力增大，體系相對穩(wěn)定，使蛋白以小顆粒形式分散，這與粒徑結(jié)果一致。此外，Zeta電位絕對值的增大也可能是由于EGCG與蛋白復(fù)合降低了蛋白等電點[30]。相似地，Wei Zihao等[31]研究表明，EGCG與牛乳蛋白共價結(jié)合，偶聯(lián)物Zeta電位絕對值較牛乳蛋白有所增加。

2.3 納米顆粒的熒光光譜分析

如圖3所示，與SPA對比，SNPs熒光強度顯著提高，這說明超聲處理可引起一定程度的蛋白分子結(jié)構(gòu)展開，從而增加暴露于外部環(huán)境的熒光基團數(shù)量[26]。這種現(xiàn)象主要是由空化效應(yīng)引起的流體混合和強剪切力造成的[32]。這與Jambrak等[33]對乳清蛋白的研究結(jié)果相似，其發(fā)現(xiàn)超聲波處理可以使蛋白分子結(jié)構(gòu)展開，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)疏水鍵，誘導(dǎo)更多蛋白分子內(nèi)的色氨酸殘基暴露。超聲和EGCG聯(lián)合處理后，ESNPs的熒光強度隨EGCG添加量的增加而降低。同樣地，當其他分子如花青素-3-葡萄糖苷與大豆蛋白相互作用時，也觀察到蛋白內(nèi)源性熒光強度的劑量依賴性猝滅[34]。ESNPs熒光強度的降低可能是分子內(nèi)相互作用（如氫鍵）導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)緊縮造成[35]。此外，超聲波高剪切作用使蛋白結(jié)構(gòu)部分展開，也使EGCG很容易進入蛋白分子內(nèi)部與熒光基團作用，導(dǎo)致熒光猝滅[36]。

圖3 納米顆粒熒光光譜Fig. 3 Fluorescence spectra of nanoparticles

2.4 納米顆粒的X射線衍射分析

圖4 納米顆粒X射線衍射圖譜Fig. 4 X-ray diffraction patterns of nanoparticles

如圖4所示，所有樣品均在2θ10°和22°附近表現(xiàn)出強烈的特征衍射峰，這與Chen Jun等[37]對SPI的研究結(jié)果一致。SNPs和ESNPs的特征衍射峰強度明顯低于SPA，這說明SNPs和ESNPs的結(jié)晶度有所降低。Zhang Yuanhong等[38]也報道了類似的結(jié)果，他們觀察到負載姜黃素的大豆蛋白肽納米顆粒的結(jié)晶程度明顯降低。與EGCG絡(luò)合后蛋白結(jié)晶度的降低表明蛋白從晶體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)結(jié)構(gòu)。此外，據(jù)報道蛋白在2θ約22°處的衍射峰強度能夠代表β-折疊結(jié)構(gòu)的含量[37]。SNPs和ESNPs在2θ約22°的衍射峰強度降低，表明其β-折疊結(jié)構(gòu)含量較SPA降低，這與Zhou Siduo等[39]報道的添加EGCG后SPIβ-折疊含量減少的結(jié)果一致。

2.5 乳液粒徑分析

圖5 不同油相體積分數(shù)乳液（40 mg/mL）的粒徑Fig. 5 Particle sizes of emulsions with different oil phase volume fractions

由圖5可知，乳液顆粒質(zhì)量濃度40 mg/mL，不同油相體積分數(shù)的ESNPs乳液平均粒徑均小于SPA和SNPs乳液。這說明ESNPs乳液與其他2 種乳液相比更加穩(wěn)定，EGCG與超聲共同作用制備的納米顆?？梢悦黠@改善乳液的穩(wěn)定性。這一結(jié)果也與納米顆粒的粒徑結(jié)果一致。Karnaukhova等[40]研究表明，添加適量的小分子物質(zhì)可以顯著改善大分子蛋白乳液的液滴粒徑。Li Dan等[41]研究表明，兒茶素的加入有效改善了EGCG-米糠蛋白復(fù)合物乳液粒徑，明顯小于米糠蛋白乳液。此外，隨著油相體積分數(shù)的增加，乳液液滴粒徑增大，最高達到13.6 μm（油相體積分數(shù)60% SPA組），這可能是由于一定質(zhì)量濃度的納米粒子只能穩(wěn)定有限的油-水界面。隨著油相體積分數(shù)的增加，需要在較小的總界面面積下形成較大的液滴，以實現(xiàn)所有油滴表面的充分覆蓋[16]。

2.6 乳液的乳化性和乳化穩(wěn)定性分析

圖6 乳液（40 mg/mL）的乳化性及乳化穩(wěn)定性Fig. 6 Emulsifying activity index and emulsion stability index of emulsions

如圖6所示，SPA乳液EAI為（46.6±4.27）m2/g，超聲處理后，SNPs乳液EAI顯著增加至（93.5±1.65）m2/g（P＜0.05），表明超聲處理促進了蛋白與油脂或蛋白與蛋白之間的相互作用。與SPA乳液相比，超聲處理使SNPs和ESNPs乳液的ESI分別增長至約2 倍和3 倍，說明超聲處理可提高乳液穩(wěn)定性。這與Shen Xue等[42]的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)超聲處理提高了乳清蛋白的ESI。Amiri等[43]發(fā)現(xiàn)不同超聲功率（100～300 W）處理30 min后，牛肉肌原纖維蛋白的EAI和ESI均有所提高。ESNPs乳液的EAI和ESI均高于SPA和SNPs乳液，說明EGCG的加入和超聲聯(lián)合處理有助于提高SPA的乳化能力。Yan Shizhang等[44]研究表明經(jīng)EGCG共價改性后，SPI乳化性能得到明顯改善。

2.7 乳液的氧化穩(wěn)定性分析

圖7 乳液（40 mg/mL）的POV（A）和丙二醛濃度（B）Fig. 7 Changes in peroxide value and malondialdehydem concentration of emulsions as a function of storage time

由圖7可知，質(zhì)量濃度40 mg/mL、油相體積分數(shù)60%的SPA、SNPs、ESNPs乳液于60 ℃貯藏7 d后，3 種乳液POV均隨貯藏時間的延長而增加，與SPA乳液相比，貯藏期間SNPs和ESNPs穩(wěn)定乳液POV顯著較低（P＜0.05），表明它們的氧化速率較慢。與初級氧化結(jié)果一致，貯藏期間SPA穩(wěn)定乳液的丙二醛濃度迅速增加，第7天時丙二醛濃度較初始水平增加了14 倍。與SPA乳液相比，ESNPs穩(wěn)定乳液的丙二醛濃度在整個貯藏期都較低，且增加較為緩慢，表明EGCG結(jié)合超聲處理抑制了油脂氧化，僅超聲處理的SNPs乳液的丙二醛含量雖然也低于SPA乳液，但其脂質(zhì)氧化的抑制效果不如ESNPs乳液。EGCG與SPA結(jié)合可以清除自由基或使促氧化劑（如油-水界面的過渡金屬離子）失活，從而阻止脂質(zhì)分解為烷氧基和過氧自由基[45]。此外，這些高活性的自由基與不飽和脂肪酸中的氫結(jié)合使其活性受到抑制，從而延緩脂質(zhì)的氧化[46]。此外，有研究[47]表明乳液的氧化穩(wěn)定性與顆粒大小密切相關(guān)。因此，SPA乳液對脂質(zhì)氧化的敏感性較SNPs和ESNPs高，這很大程度歸因于SPA顆粒粒徑更大、更不均勻。同時，ESNPs構(gòu)成致密的界面膜阻止促氧化劑的滲透和擴散，延緩了脂質(zhì)與促氧化劑的相互接觸，從而有效抵抗脂質(zhì)的次級氧化。Phoon等[48]也認為，交聯(lián)的界面蛋白層可能是阻止氧分子轉(zhuǎn)移的有效物理屏障，從而抑制了油脂氧化。Fan Yuting等[49]研究發(fā)現(xiàn)，乳球蛋白-EGCG共軛物有助于提高包封油脂或保健食品的氧化穩(wěn)定性?？傊?，EGCG結(jié)合超聲處理的ESNPs不僅顯著改善了乳液的物理穩(wěn)定性，而且阻礙了油脂氧化。

3 結(jié) 論

與SPA相比，SNPs和ESNPs粒徑減小，隨EGCG添加量的增加，ESNPs粒徑分布向左側(cè)移動，Zeta電位絕對值先增大后趨于平緩。EGCG添加量0.80%的ESNPs粒徑最小、Zeta電位絕對值最大。熒光光譜顯示，與SPA相比，SNPs熒光強度增強，而ESNPs熒光強度減弱，且呈EGCG劑量依賴性猝滅。X射線衍射圖顯示，SPA、SNPs和ESNPs均在2θ10°和22°附近有特征衍射峰，表明SNPs和ESNPs的結(jié)晶度較SPA降低，由晶態(tài)向非晶態(tài)轉(zhuǎn)變。此外，隨油相體積分數(shù)的增加，SPA、SNPs、ESNPs乳液粒徑均逐漸增大。SPA乳液粒徑最大，其次是SNPs，ESNPs乳液粒徑最小。氧化穩(wěn)定性結(jié)果顯示，ESNPs乳液的脂質(zhì)氧化分解被有效抑制，初級氧化產(chǎn)物和次級氧化產(chǎn)物含量均少于SPA和SNPs乳液?；谶@些結(jié)果，ESNPs具有作為優(yōu)異乳液穩(wěn)定劑的潛力。