體外模擬消化對(duì)海洋魚(yú)骨膠原低聚肽結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的影響

馮曉文,趙曉涵,潘驍琦,裴晨皓,谷瑞增,劉文穎*

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京,100015)2(北京城市學(xué)院 生物醫(yī)藥學(xué)部,北京,100094)

三文魚(yú),也稱(chēng)為鮭魚(yú)或大馬哈魚(yú),主要分布在挪威、加拿大、美國(guó)等高緯度地區(qū),因其肉質(zhì)鮮美,富含維生素A、B、D、E,各種礦物元素以及n-3系列不飽和脂肪酸,對(duì)人體健康極其有益,使得我國(guó)三文魚(yú)市場(chǎng)消費(fèi)量日益增加[1-2]。三文魚(yú)的大量消費(fèi)伴隨產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物三文魚(yú)骨。這些數(shù)量巨大的三文魚(yú)骨或被直接丟棄,或被用作飼料添加物,或用作生產(chǎn)魚(yú)粉等附加值很低的產(chǎn)品,造成了三文魚(yú)骨資源的嚴(yán)重浪費(fèi)[3]。

課題組前期以三文魚(yú)骨為原料,通過(guò)酶解法制得海洋魚(yú)骨膠原低聚肽,也證明了海洋魚(yú)骨膠原低聚肽中蛋白質(zhì)含量高,具有很好的抗氧化性。此外海洋魚(yú)骨膠原低聚肽還具有溶解性好、無(wú)副作用、安全性高等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。基于此,本研究以通過(guò)酶解制得的海洋魚(yú)骨膠原低聚肽為研究對(duì)象,通過(guò)體外模擬胃腸道消化,利用分子質(zhì)量分布測(cè)定、紫外全波長(zhǎng)掃描、圓二色光譜掃描技術(shù)表征消化前后海洋魚(yú)骨膠原低聚肽結(jié)構(gòu)的變化；通過(guò)測(cè)定DPPH自由基清除能力、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力、鐵離子還原能力(ferric reduction ability plasma assay,FRAP)、氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)4個(gè)抗氧化指標(biāo),研究消化前后海洋魚(yú)骨膠原低聚肽抗氧化活性的變化。深入研究海洋魚(yú)骨膠原低聚肽結(jié)構(gòu)和抗氧化性的消化穩(wěn)定性,為三文魚(yú)骨的高附加值利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

三文魚(yú)骨,北京中食海氏生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇、NaOH、濃鹽酸、KH2PO4、Na2HPO4、K2S2O8、醋酸鈉,北京化學(xué)試劑公司；堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶,諾維信生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶,北京Solarbio公司；DPPH、偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)、Fluorescein(熒光指示劑)、Trolox(水溶性維生素E),均為色譜純,胃蛋白酶,美國(guó)Sigma公司；ABTS,分析純,南京森貝伽生物科技有限公司；2,4,6-三吡啶基-1,3,5-三嗪(tripyridine triazine,TPTZ),酷爾化學(xué)科技(北京)有限公司；FeCl3、FeSO4,廣東汕頭市西隴化工有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

YG30型噴霧干燥機(jī),無(wú)錫市陽(yáng)光干燥設(shè)備廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,普瑞斯機(jī)械有限公司；FE20K型pH計(jì),瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-250E超聲波振蕩器,昆山市超聲儀器有限公司；J-810圓二色譜儀,美國(guó)Jasco公司；Spectra MR多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)Dynex公司；SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)MD公司；LC-20AD高效液相色譜儀、UV-1780紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),日本SHIMADZU公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的制備

將三文魚(yú)骨做潔凈處理,然后經(jīng)粉碎機(jī)制得三文魚(yú)骨粉。稱(chēng)取魚(yú)骨粉30 g溶于500 mL蒸餾水中混均,于90 ℃水浴鍋放置10 min,然后迅速降溫到50 ℃,使用pH計(jì)調(diào)節(jié)溶液pH值為8.5,加入堿性蛋白酶反應(yīng)3 h,反應(yīng)完畢后收取200 mL反應(yīng)液；將剩余反應(yīng)液pH值調(diào)至7,維持溫度在60 ℃,加入木瓜蛋白酶酶解2 h。反應(yīng)完畢后,100 ℃滅酶10 min。待降至室溫后,將上述經(jīng)不同處理的反應(yīng)液在10 000 r/min條件下離心30 min,取上清液。用孔徑為200 nm的陶瓷膜過(guò)濾,取過(guò)濾清液,然后用截留分子質(zhì)量為1 000 u的超濾膜超濾上清液,超濾過(guò)后的上清液進(jìn)行噴霧干燥,進(jìn)料溫度25 ℃,進(jìn)料速度14 mL/min,進(jìn)風(fēng)溫度135 ℃,進(jìn)風(fēng)壓力20 kPa,得到海洋魚(yú)骨膠原低聚肽干粉[6]。

1.2.2 體外模擬胃腸道消化實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 模擬胃液消化實(shí)驗(yàn)

精確稱(chēng)取50 g海洋魚(yú)骨膠原低聚肽干粉溶于1 L超純水中,配制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶液,取20 mL溶液于50 mL離心管中,用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為2,在37 ℃水浴鍋中加熱1 min,加入3%(酶底比)胃蛋白酶(≥250 units/mg),混勻,于37 ℃水浴鍋中繼續(xù)消化3 h,然后沸水浴滅酶活10 min,此為模擬胃液組。另做樣品消化前對(duì)照組(未消化組)。待樣品冷卻至室溫后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[5]。

1.2.2.2 模擬腸液消化實(shí)驗(yàn)

將樣品配制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶液,取20 mL溶液置于50 mL離心管中,調(diào)節(jié)pH值為6.8,37 ℃水浴加熱1 min,加入3%(酶底比)胰蛋白酶(≥250 units/mg),混勻,于37 ℃水浴鍋中繼續(xù)消化3 h,滅酶活10 min,此為模擬腸液組。冷卻至室溫后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[5]。

1.2.2.3 模擬先胃液后腸液消化實(shí)驗(yàn)

按照1.2.2.1的方法進(jìn)行胃蛋白酶消化后,調(diào)節(jié)pH值為6.8,37 ℃水浴加熱1 min,加入3%(酶底比)胰蛋白酶(≥250 units/mg),混勻,于37 ℃水浴鍋中繼續(xù)消化3 h,滅酶活10 min,此為先胃后腸組。冷卻至室溫后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[5]。

1.2.3 分子質(zhì)量分布測(cè)定

分子質(zhì)量分布采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定。色譜條件為：色譜柱：TSKgel G2000 SW XL 300 mm×7.8 mm；流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；柱溫：30 ℃,紫外檢測(cè)器檢測(cè)。使用1 mg/mL的樣品溶液進(jìn)行測(cè)定,樣品溶液經(jīng)流動(dòng)相配制,然后經(jīng)孔徑0.2 μm聚四氟乙烯過(guò)濾膜過(guò)濾后,用高效液相色譜儀進(jìn)行凝膠過(guò)濾,數(shù)據(jù)使用Empower GPC軟件處理。以乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子質(zhì)量189 u)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子質(zhì)量451 u)、桿菌酶(分子質(zhì)量1 450 u)、細(xì)胞色素C(分子質(zhì)量12 500 u)為肽標(biāo)準(zhǔn)品,配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%溶液,過(guò)膜后進(jìn)樣,制作相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線(xiàn)[4]。

1.2.4 紫外全波長(zhǎng)掃描

將質(zhì)量濃度2.0 mg/mL的樣品溶液置于石英比色皿中,利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描,掃描波長(zhǎng)245～325 nm,狹縫1.0 mm,采樣間隔0.5 nm,慢速掃描,用Origin Pro 8.5軟件分析處理數(shù)據(jù)。

1.2.5 圓二色光譜掃描

取質(zhì)量濃度1.0 mg/mL的樣品溶液置于石英比色皿中,于圓二色光譜儀上進(jìn)行檢測(cè),設(shè)定圓二色光譜條件：光源采用氙燈；氮?dú)廨敵鰤毫?.4 MPa；帶寬1.0 nm；光譜測(cè)量范圍180～260 nm；步進(jìn)0.5 nm；數(shù)據(jù)點(diǎn)采樣時(shí)間0.25 s。對(duì)蛋白樣品進(jìn)行圓二色光譜采集,每個(gè)樣品采集3次數(shù)據(jù),用Origin Pro 8.5軟件分析處理數(shù)據(jù),用CDNN 2.1-Simple Spectra軟件分析蛋白質(zhì)中二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成與含量。

1.2.6 DPPH自由基清除能力測(cè)定

配制質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 mg/mL的海洋魚(yú)骨膠原低聚肽溶液,分別加入100 μL于96孔板中,再加入100 μL 0.1 mol/L DPPH-無(wú)水乙醇溶液,混合均勻后,室溫避光反應(yīng)30 min,立即利用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)X；以無(wú)水乙醇代替DPPH-無(wú)水乙醇溶液作為空白組,測(cè)定吸光值A(chǔ)0；以蒸餾水代替樣品溶液作為對(duì)照組,測(cè)定吸光值A(chǔ)1。每個(gè)濃度的樣品做3組平行。DPPH自由基清除率計(jì)算如公式(1)所示[6-7]：

(1)

1.2.7 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定

使用超純水將ABTS稀釋至7 mmol/L制得ABTS儲(chǔ)備液。將2.45 mmol/L的K2S2O8與ABTS儲(chǔ)備液等體積混合,室溫避光過(guò)夜,使其充分反應(yīng)12～16 h。然后將反應(yīng)后的ABTS工作母液稀釋35倍得ABTS工作液。取96孔板,于96孔板中各加入200 μL的ABTS工作液,樣品孔每孔加入10 μL的質(zhì)量濃度1 mg/mL的待測(cè)樣品,空白孔加入10 μL,0.1 mol/L,pH 7.4的PBS,標(biāo)準(zhǔn)孔加入不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液,每組試驗(yàn)做3組平行。然后輕輕晃動(dòng)96孔板片刻,室溫避光反應(yīng)5 min,最后在734 nm處測(cè)定吸光度(optical density,OD)值。以標(biāo)準(zhǔn)品OD值為縱坐標(biāo),Trolox濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品的ABTS自由基清除能力,以mmol Trolox/L表示[8-9]。

1.2.8 FRAP的測(cè)定

將300 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH 3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液、和20 mmol/L FeCl3溶液按體積10∶1∶1的比例制備得FRAP工作液。將FRAP工作液加熱到37 ℃。取96孔板,每孔加入180 μL的FRAP工作液,空白對(duì)照孔加入5 μL的PBS,標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)孔中加入5 μL的不同濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液,樣品檢測(cè)孔內(nèi)加入5 μL的1 mg/mL待測(cè)樣品,輕輕晃動(dòng)96孔板,混勻。37 ℃孵育5 min,在593 nm處測(cè)定OD值,根據(jù)FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品的FRAP[10]。

1.2.9 ORAC值測(cè)定

預(yù)先配制好pH 7.4,75 mmol/L PBS,不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)品,0.8 μmol/L的Fluorescein；150 mmol/L AAPH。取96孔板,空白孔中加入25 μL的PBS(pH 7.4,75 mmol/L),對(duì)照孔中加入25 μL的PBS,標(biāo)準(zhǔn)溶液孔中加入不同濃度梯度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液各25 μL,樣品孔加入25 μL的1 mg/mL的樣品。在避光條件下各孔加入100 μL的0.8 μmol/L Fluorescein,混勻后于37 ℃避光反應(yīng)20 min。反應(yīng)完畢,空白孔中加入75 μL的PBS,其余各孔迅速加入75 μL的150 mmol/L AAPH,然后在熒光酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)485 nm,發(fā)射波長(zhǎng)530 nm條件下,每隔5 min測(cè)定1次,測(cè)定總時(shí)長(zhǎng)為180 min。以Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)和熒光衰減曲線(xiàn)保護(hù)面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),根據(jù)Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品的ORAC值,結(jié)果表示為μmol Trolox/g[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 消化前后海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的分子質(zhì)量分布

采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定海洋魚(yú)骨膠原低聚肽經(jīng)體外模擬胃腸道液化后的分子質(zhì)量分布,結(jié)果如表1所示,經(jīng)過(guò)不同的消化模式,海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的組分中分子質(zhì)量<1 000 u的組分所占比例均有所升高,重均分子量均有所降低,其中模擬先胃液后腸液消化后分子質(zhì)量<1 000 u的組分增加比例最大(約12.16%)和重均分子量降低最多(約23.95%)。這表明海洋魚(yú)骨膠原低聚肽能夠一定程度耐受胃腸道中胃蛋白酶和胰蛋白酶。與未消化組相比,經(jīng)過(guò)模擬腸液、模擬先胃液后腸液消化后,1 000～2 000 u、2 000～3 000 u、3 000～5 000 u的組分和重均分子量均有所下降,而<150 u的組分所占比例升高。這表明分子質(zhì)量相對(duì)較大的肽段經(jīng)過(guò)消化后分解成小分子質(zhì)量的肽段或氨基酸。此外,從表1可見(jiàn),胰蛋白酶對(duì)海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的消化作用要強(qiáng)于胃蛋白酶,這表明胰蛋白酶更易破壞鏈內(nèi)肽鍵,產(chǎn)生較小的肽段。杜枘宣[12]的研究同樣表明酪蛋白在體外模擬腸液消化中的水解度顯著高于胃液消化。在本研究的3種消化方式中,先經(jīng)模擬先胃液后腸液消化后,海洋魚(yú)骨膠原低聚肽中分子質(zhì)量<1 000 u的組分升高最多。ZHANG等[13]以全脂大豆片為原料,通過(guò)模擬胃腸液消化處理以后,也報(bào)道了同樣的多肽水解趨勢(shì),大豆蛋白水解物經(jīng)先胃后胰處理后,>10 000 u的肽相對(duì)含量降低,<1 000 u的肽相對(duì)含量同時(shí)增加。

表1 不同處理的海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的分子質(zhì)量分布

2.2 消化前后海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的紫外全波長(zhǎng)掃描

有研究表明,由于蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸殘基含有共軛雙鍵,因此蛋白質(zhì)溶液在275～280 nm處有1個(gè)紫外吸收峰,且其吸收峰值與酪氨酸、色氨酸含量成正比[14]。海洋魚(yú)骨膠原低聚肽在分別經(jīng)模擬胃液、模擬腸液及模擬先胃液后腸液消化之后,對(duì)其進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描,如圖1所示,海洋魚(yú)骨膠原低聚肽消化前后均在275～280 nm附近出現(xiàn)紫外吸收峰,表明在該波長(zhǎng)范圍內(nèi)產(chǎn)生了價(jià)電子躍遷,其中未消化組吸收峰最低(吸光值為0.311 0),模擬胃液組吸收峰最高(吸光值為0.415 8),模擬先胃液后腸液消化處理后,與單獨(dú)模擬胃液消化處理相比紫外吸收值差異不顯著,前后變化量小于5%。胃蛋白酶的特異識(shí)別位點(diǎn)與酪氨酸、色氨酸等相關(guān),表明了海洋魚(yú)骨膠原低聚肽經(jīng)模擬胃液消化以后部分肽鏈發(fā)生水解,使得溶液中游離酪氨酸或色氨酸含量增加。

圖1 不同處理的海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的紫外全波長(zhǎng)掃描

2.3 消化前后海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的圓二色光譜掃描

通過(guò)圓二色光譜檢測(cè)海洋魚(yú)骨膠原低聚肽經(jīng)不同消化酶處理后的二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖2所示,4組樣品在195 nm附近均有1個(gè)負(fù)峰,使用CDNN 2.1-Simple Spectra軟件對(duì)4組樣品的CD圖進(jìn)行分析得到相應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成,如表2所示。二級(jí)結(jié)構(gòu)中,不規(guī)則卷曲比例最高,其次是反平行式β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋、平行式β-折疊。與未消化組相比,其余3組反平行式β-折疊比例均減少,其中模擬先胃液后腸液消化后減少最多,為24.12%；同時(shí)β-轉(zhuǎn)角、不規(guī)則卷曲的比例增加,α-螺旋、平行式β-折疊消化前后變化不大,與未消化組相比,變化不超過(guò)8.33%。不同消化模式下,海洋魚(yú)骨膠原低聚肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異可能是胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用位點(diǎn)和機(jī)理不同。在不同酶的作用下,海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的分子間作用力發(fā)生改變及肽鏈構(gòu)象和結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[15]。

圖2 不同處理的海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的圓二色光譜圖

表2 不同處理的海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的二級(jí)結(jié)構(gòu) 單位：%

2.4 消化前后海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的DPPH自由基清除能力

海洋魚(yú)骨膠原低聚肽經(jīng)不同消化酶處理后的DPPH自由基清除能力如圖3所示。

圖3 不同處理的海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的DPPH自由基清除活性

海洋魚(yú)骨膠原低聚肽對(duì)DPPH自由基清除率呈劑量依賴(lài)關(guān)系,未消化、模擬胃液、模擬腸液及模擬先胃液后腸液消化消化后,海洋魚(yú)骨膠原低聚肽對(duì)DPPH自由基清除率均隨質(zhì)量濃度增加而增加,且未消化組與模擬胃液組整體DPPH自由基清除率明顯高于后2組,結(jié)合圓二色光譜分析結(jié)果,其原因可能是經(jīng)模擬腸液處理后,海洋魚(yú)骨膠原低聚肽具有抗氧化活性的肽段結(jié)構(gòu)和構(gòu)象部分發(fā)生變化,發(fā)生了二級(jí)結(jié)構(gòu)的相互轉(zhuǎn)換,導(dǎo)致了抗氧化活性的降低。或者可能是胰酶消化后使得三肽和二肽及氨基酸積累,產(chǎn)生的這些親水性的水解物幾乎不與脂溶性DPPH自由基反應(yīng)[16]。李茹等[17]以新鮮蘿卜苗為原料,利用胃蛋白酶、胰液素消化產(chǎn)生蘿卜苗中活性物質(zhì),探索模擬胃腸道消化對(duì)蘿卜苗中活性物質(zhì)抗氧化活性的影響,其DPPH自由基清除率結(jié)果與本研究基本一致。

2.5 消化前后海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力

以不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐標(biāo),相應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo),制得ABTS標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.670 22x+1.188 14(R2=0.998 73)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程可得各處理組的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率,結(jié)果如表5所示,與未消化組相比,其余3組ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力均有一定程度的增加,但均無(wú)顯著影響(P>0.05),這表明海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力具有一定的消化穩(wěn)定性。模擬胃腸液消化后,海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率稍有提高的原因可能是其經(jīng)模擬胃、腸液消化處理后,產(chǎn)生了較多的親水性的肽段和氨基酸,具有抗氧化活性的氨基酸殘基更加充分暴露,使得產(chǎn)生的ABTS陽(yáng)離子自由基更容易被抑制,因此與未消化組相比,經(jīng)蛋白酶消化后的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力有所提高[16]。顧敏[18]對(duì)青養(yǎng)蛋白抗氧化肽經(jīng)凝膠過(guò)濾色譜分離組分的胃腸道消化特性進(jìn)行了研究,結(jié)果與本研究一致,體外胃腸道消化體系均提高了其抗氧化活性。

表3 不同處理的海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的ABTS陽(yáng)離子自由基清能力

2.6 消化前后海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的FRAP值

通過(guò)計(jì)算可得FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)表達(dá)式：y=0.276 4x+0.011 4,R2=0.994 3。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)表達(dá)式及所測(cè)樣品OD值,可得相應(yīng)的FRAP值,如表4所示。經(jīng)過(guò)模擬胃腸液消化處理后,海洋魚(yú)骨膠原低聚肽均具有一定的鐵離子還原能力,這表明海洋魚(yú)骨膠原低聚肽能夠通過(guò)氫原子轉(zhuǎn)移阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程實(shí)現(xiàn)抗氧化作用[19]。與未消化組相比,不同方式處理后的FRAP值無(wú)顯著差異(P>0.05)。SILVA等[20]以亞麻籽粕為原料,通過(guò)不同蛋白酶酶解制備抗氧化活性肽,結(jié)果表明,分子質(zhì)量較低的亞麻籽粕肽的FRAP值較高,可能是由于其包含某些活性氨基酸序列,或者具有大量疏水區(qū)的肽段特定結(jié)構(gòu),從而提高抗氧化活性。模擬人體胃腸液消化模式下,能夠?qū)⒑Ｑ篝~(yú)骨膠原低聚肽酶解成更小分子質(zhì)量的肽段,使得一些疏水性基團(tuán)進(jìn)一步暴露出來(lái),導(dǎo)致表面疏水性提高,而高含量的疏水性氨基酸或肽通常與較高自由基清除活性有關(guān)。

表4 不同處理的海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的FRAP值

2.7 消化前后海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的ORAC

不同濃度Trolox標(biāo)準(zhǔn)液的動(dòng)態(tài)熒光衰減曲線(xiàn)如圖4所示,由此繪制Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y=0.019 5x+1.455 8(R2=0.997 6)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)表達(dá)式可得未消化組、模擬胃液組、模擬腸液組以及先胃后腸組,海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的ORAC值如圖5所示。體外模擬消化顯著提高海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的ORAC值(P>0.05)。

圖4 不同濃度Trolox的動(dòng)態(tài)熒光衰減曲線(xiàn)

圖5 不同處理的海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的ORAC值

推測(cè)原因可能是海洋魚(yú)骨膠低聚肽經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解后,暴露出更多活性基團(tuán),大大增加與自由基反應(yīng)的機(jī)會(huì),從而增強(qiáng)對(duì)自由基的清除能力,有利于進(jìn)一步提高海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的抗氧化活性[21]。已知分子質(zhì)量較小的肽段往往具有較高的抗氧化活性,吳明澤等[22]以中華圓田螺肉酶解產(chǎn)物為研究對(duì)象,證明了分子質(zhì)量<1 000 u組分的ORAC值顯著高于分子質(zhì)量較大的組分(P<0.05)。本研究中,海洋魚(yú)骨膠原低聚肽經(jīng)模擬胃、腸液消化處理后分子質(zhì)量分布范圍主要集中于<1 000 u的短肽,這可能與其具有較高的ORAC值有關(guān)。

3 結(jié)論

通過(guò)模擬胃、腸液處理海洋魚(yú)骨膠原低聚肽,分子質(zhì)量分布結(jié)果表明海洋魚(yú)骨膠原低聚肽能夠在一定程度上耐受胃腸道中胃蛋白酶和胰蛋白酶作用。紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果顯示4組樣品在275～280 nm處吸收峰有差異,表明海洋魚(yú)骨膠原低聚肽含有酶解特異序列。圓二色光譜結(jié)果顯示了4組樣品的反平行式β-折疊差異顯著,同時(shí)4組間β-轉(zhuǎn)角、不規(guī)則卷曲含量發(fā)生了相應(yīng)的變化,表明了酶解使得海洋魚(yú)骨膠原低聚肽分子間作用力發(fā)生改變及肽鏈構(gòu)象和結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。DPPH自由基清除能力經(jīng)模擬胰液消化后有一定程度的降低,ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力、FRAP值及ORAC值,三者經(jīng)模擬胃、腸液處理之后,抗氧化能力或有一定程度的提高或者保持穩(wěn)定,4個(gè)抗氧化指標(biāo)結(jié)果總體表明海洋魚(yú)骨膠原低聚肽的抗氧化活性具有抗消化穩(wěn)定性。后續(xù)將進(jìn)一步篩選出特定的具有消化穩(wěn)定性的抗氧化活性肽段,以期為海洋魚(yú)骨膠原低聚肽在新型抗氧化功能食品的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。