外泌體的生物學(xué)功能及牛乳源性外泌體資源開發(fā)進(jìn)展

杜春梅 權(quán)素玉 南雪梅 熊本海*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.天津農(nóng)學(xué)院，動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津300384)

所有的細(xì)胞，原核生物和真核生物在正?；虍惓５纳頎顟B(tài)均能釋放細(xì)胞外囊泡[1]。根據(jù)大小及釋放方式，可將細(xì)胞外囊泡分為外泌體、細(xì)胞微泡和凋亡小體[2]。表1總結(jié)了這3種細(xì)胞外囊泡的主要特征。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡在細(xì)胞間通訊[3]、免疫應(yīng)答[3-5]和傳遞外源性化合物到受體細(xì)胞均發(fā)揮重要的作用[6]。其中，外泌體是多囊泡體(multivesicular body，MVB)和質(zhì)膜融合，通過胞吐作用向細(xì)胞間隙中分泌的直徑最小(30～150 nm)的胞外囊泡[7]，且外泌體幾乎存在所有的體液中，包括人類和動(dòng)物的乳汁[8-11]。

表1 3種細(xì)胞外囊泡的特征

在哺乳動(dòng)物的飲食來源中，牛乳是消耗最多的飲品之一，且含有豐富的外泌體。外泌體可通過與質(zhì)膜融合或內(nèi)吞作用被細(xì)胞攝取[12]。根據(jù)不同的受體介導(dǎo)，內(nèi)吞方式可分為：網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、巨胞飲作用和吞噬作用。此外，外泌體的攝取還取決于細(xì)胞類型、生理狀態(tài)以及外泌體表面的配體是否可識(shí)別細(xì)胞表面的受體[13]。研究表明，牛乳外泌體在哺乳動(dòng)物出生后參與合成代謝，促進(jìn)生長(zhǎng)和完善免疫系統(tǒng)；同樣有報(bào)道指出，牛乳外泌體所攜帶的部分內(nèi)容物可引起一些慢性疾病的發(fā)展，如肥胖、2型糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、常見癌癥(前列腺癌、乳腺癌、肝癌)和帕金森病[14]。因此，本文綜述了外泌體的組成及分選機(jī)制，并比較了外泌體的分離方法、在體內(nèi)的分布和生物學(xué)功能，以期為國(guó)內(nèi)牛乳外泌體的研究與開發(fā)提供參考。

1 外泌體的主要成分及分選機(jī)制

1.1 蛋白質(zhì)

外泌體中的蛋白質(zhì)僅來源于細(xì)胞溶質(zhì)、內(nèi)吞小泡或細(xì)胞膜，沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和細(xì)胞核相關(guān)的蛋白質(zhì)[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，泛素化在蛋白質(zhì)翻譯后修飾中發(fā)揮重要作用，其主要調(diào)控Fas配體進(jìn)入MVB[21]，這一過程由轉(zhuǎn)運(yùn)必需核內(nèi)體復(fù)合物(endosomal complex required for transport，ESCRT)介導(dǎo)，對(duì)維持外泌體中蛋白質(zhì)的水平和功能具有重要意義。外泌體中的蛋白質(zhì)與外泌體的形成和功能密切相關(guān)，例如，ESCRT中含有凋亡轉(zhuǎn)接基因2互作蛋白X(Alix)、腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)；小GTP結(jié)合蛋白家族(Rab27a、Rab11b和ARF6)參與外泌體的形成和釋放；此外，外泌體中含有四跨膜蛋白(CD63、CD81和CD9)、參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白[表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)]、抗原呈遞[組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ和MHCⅡ)]和其他跨膜蛋白[溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白1(LAMP1)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(TFR)][13]。乳外泌體中的蛋白質(zhì)不僅可作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)方面發(fā)揮重要作用[22]。Samuel等[23]從初牛乳和成熟牛乳的外泌體中分別鑒定出8 124和4 443個(gè)蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)初牛乳外泌體中的蛋白質(zhì)與免疫反應(yīng)和細(xì)胞生長(zhǎng)息息相關(guān)。

1.2 脂質(zhì)

脂質(zhì)對(duì)外泌體發(fā)揮生理功能有重要作用，但其相關(guān)研究較少。目前為止，ExoCarta數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，1 116種脂類在外泌體中被發(fā)現(xiàn)。雖然不同細(xì)胞分泌的外泌體在脂質(zhì)組成上存在差異，但其雙分子層主要包含磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PIs)、磷脂酸(PA)、膽固醇、神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、鞘糖脂和其他低濃度的脂類[24-25]。外泌體中的神經(jīng)酰胺、膽固醇和鞘脂等構(gòu)成的脂質(zhì)筏在傳遞免疫信號(hào)過程中發(fā)揮較大作用[24]。除牛乳以外，其他來源的外泌體中的膽固醇和鞘磷脂組成不依賴于供體細(xì)胞，而飽和脂肪酸中的PC和PE的含量則與供體細(xì)胞有關(guān)[26]。薄層色譜(TLC)、液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)和質(zhì)譜(MS)是最常用的脂質(zhì)分析技術(shù)，對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行全面研究有助于闡明外泌體的生物學(xué)功能。

1.3 核酸

在外泌體中發(fā)現(xiàn)了多種遺傳物質(zhì)。在少數(shù)情況下，外泌體含有DNA，包括單鏈DNA、雙鏈DNA、基因組DNA、線粒體DNA，甚至是反轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)DNA[27-28]。但總體而言，外泌體中含有豐富的非編碼RNA，主要包括miRNAs、tRNAs、rRNAs、snRNAs、piRNAs、snoRNAs和RNA碎片[29-30]。外泌體中的RNA與細(xì)胞中的RNA具有相似的形態(tài)，但外泌體中的RNA種類更加固定[30]。其中，miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和免疫系統(tǒng)發(fā)育，是外泌體中含量豐富且重要的一種RNA[31-32]。Quan等[33]在牛乳外泌體中共鑒定出273種miRNAs，且大部分與免疫相關(guān)。然而，外泌體如何分選miRNAs尚無定論，目前存在4種假說：第一，神經(jīng)鞘磷脂酶2(neural sphingomyelinase 2,nSMase2)依賴途徑。nSMase2是第1個(gè)被報(bào)道與外泌體分選miRNAs有關(guān)的蛋白質(zhì)。Kosaka等[34]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)nSMase2可增加外泌體miRNAs的數(shù)量，而抑制nSMase2表達(dá)則減少了外泌體miRNAs的數(shù)量。第二，miRNA基序和核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins,hnRNPs)依賴途徑。Villarroya-Beltri等[35]發(fā)現(xiàn)，單糖基化的hnRNPA2B1可以識(shí)別miRNAs序列中3’端的特定的基序(GGAG)，并使其進(jìn)入外泌體。此外，hnRNPA1和hnRNPC也是hnRNPs家族蛋白，似乎也參與外泌體分選miRNAs，但具體機(jī)制尚不清楚[35]。第三，依賴于miRNA的3’端序列。Koppers-Lalic等[36]發(fā)現(xiàn)尿苷化的3’端有利于直接將miRNAs分揀到外泌體中，而3’端腺苷酸化miRNAs主要存在細(xì)胞中。第四，miRNAs誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(miRNA induced silencing complex,miRISC)相關(guān)途徑。成熟的miRNAs可結(jié)合真核翻譯起始因子2C2(AGO2)形成miRISC，從而調(diào)控miRNAs是否加載到外泌體中。Guduric-Fuchs等[37]發(fā)現(xiàn)，敲除AGO2可降低某些miRNAs的種類和豐度?？傊琺iRNAs中的特定序列，某些酶和蛋白質(zhì)都可能控制外泌體分選miRNAs。

2 外泌體的分離方法

外泌體的分離方法可在一定程度上決定外泌體的質(zhì)量。根據(jù)外泌體的特定特性，如密度、形狀、大小和表面蛋白質(zhì)，其分離方法可分為：差速超速離心、密度梯度離心、超濾、排阻色譜、聚合物沉淀、微流體分離和等電沉淀。表2呈現(xiàn)了每種分離技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)。

表2 外泌體分離技術(shù)及其優(yōu)缺點(diǎn)

3 外泌體在體內(nèi)的分布

了解外泌體在體內(nèi)的具體分布可更有針對(duì)性地去研究其生物學(xué)功能。Munagala等[45]用細(xì)胞膜近紅外熒光探針(DiR)標(biāo)記的牛乳外泌體灌胃裸鼠發(fā)現(xiàn)，外泌體主要分布在肝臟、脾臟、胰腺和腎臟中，少量存在結(jié)腸、肺和大腦中。Manca等[46]用不同濃度的外泌體灌胃小鼠發(fā)現(xiàn)，牛乳外泌體主要聚集在腸黏膜、肝臟和大腸中，而在其他組織中的濃度很低；與雌性小鼠相比，雄性小鼠器官中的外泌體濃度更低，表明性別會(huì)影響外泌體在體內(nèi)的分布。當(dāng)外泌體表面的蛋白質(zhì)被胰蛋白酶處理后，外泌體在肝臟中的含量較少；而用氯膦酸鈉清除小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞后，灌胃的外泌體幾乎只聚集在肝臟中；這表明牛乳中外泌體在機(jī)體內(nèi)的分布與外泌體表面的蛋白質(zhì)和機(jī)體中的巨噬細(xì)胞密切相關(guān)[46-47]。

外泌體中的RNA與外泌體的分布不同，其主要分布在脾臟和大腦中[46]。據(jù)推測(cè)，miRNAs可將外源乳外泌體轉(zhuǎn)移到內(nèi)源性外泌體并轉(zhuǎn)運(yùn)到大腦，但這一理論尚未被證實(shí)。miRNA-34a與空間認(rèn)知功能、海馬神經(jīng)發(fā)生和大腦衰老有關(guān)，將合成的miRNA-34a轉(zhuǎn)移到牛乳外泌體后發(fā)現(xiàn)其主要在大腦中積累[48-49]。此外，miRNAs的分布不僅取決于組織中互補(bǔ)mRNAs的豐富度[31]，還取決于miRNAs的序列，它可以結(jié)合核糖核酸蛋白，促進(jìn)miRNAs分選到外泌體中[50]。

4 外泌體在體內(nèi)的利用

4.1 腸道細(xì)胞

外泌體因其獨(dú)特而穩(wěn)定的脂質(zhì)雙層膜，可攜帶其內(nèi)容物躲避胃腸道的消化，直接被部分細(xì)胞吸收或進(jìn)入大腸。Izumi等[51]發(fā)現(xiàn)，乳中外泌體可被人巨噬細(xì)胞吸收，進(jìn)而將功能性RNA傳遞到人類機(jī)體中，但是其對(duì)巨噬細(xì)胞的影響還尚未可知。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳中外泌體可被人腸細(xì)胞、原代大鼠小腸細(xì)胞和人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞吸收，并促進(jìn)增殖[52-53]。此外，乳中外泌體還可促進(jìn)大腸桿菌和植物乳桿菌WCFS1等細(xì)菌的生長(zhǎng)并改變基因的表達(dá)，可能有助于維持腸道穩(wěn)態(tài)和改善胃腸道功能[54]。

4.2 腸道微生物

約75%的牛乳外泌體可逃避細(xì)胞的吸收直接進(jìn)入大腸，是腸道微生物和機(jī)體發(fā)生互作的介質(zhì)[46]。一方面，外泌體可直接影響腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響機(jī)體的健康。研究發(fā)現(xiàn)，在門水平上，牛乳外泌體對(duì)小鼠腸道中厚壁菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度無現(xiàn)在影響，在科水平上，增加了梭菌科、瘤胃球菌科和毛螺旋菌科的相對(duì)豐度，對(duì)其他菌群無顯著影響[55-56]。其中，瘤胃球菌科和毛螺旋菌科可維持腸道健康和改善小鼠營(yíng)養(yǎng)不良[57]；此外，瘤胃球菌科與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)[58]，而毛螺旋菌科可預(yù)防艱難梭菌感染和肥胖[59-60]。另一方面，外泌體可調(diào)控腸道菌群的代謝產(chǎn)物進(jìn)而發(fā)揮作用。腸道內(nèi)容物中的短鏈脂肪酸(SCFAs)是目前研究較多的代謝產(chǎn)物，可維持腸道黏膜的完整性，改善糖脂代謝，控制能量消耗，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)[61]。Tong等[55]發(fā)現(xiàn)口服牛乳中的外泌體可提高小鼠糞便中乙酸、丙酸和丁酸的濃度，但對(duì)總揮發(fā)性脂肪酸和其他短鏈脂肪酸的濃度沒有顯著影響；然而，外泌體是否會(huì)影響菌群的其他代謝產(chǎn)物仍有待評(píng)估。

5 乳中外泌體的生物學(xué)作用及資源開發(fā)

5.1 有益功能及資源開發(fā)

外泌體中含有豐富的miRNAs，可在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)動(dòng)物的生理過程[62]。此外，某些外泌體中的miRNAs與免疫應(yīng)答相關(guān)，尤其是let-7家族[63]。Tong等[55]報(bào)道，牛乳外泌體可增加小鼠腸道中的吸收細(xì)胞，增加腸絨毛高度和隱窩深度，促進(jìn)腸道中黏糖蛋白2、胰島再生源蛋白(RegⅢγ)、髓樣分化因子和轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)，提高腸中免疫球蛋白A(IgA)和分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的水平，進(jìn)而增強(qiáng)腸道免疫。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，牛乳外泌體中的miRNA-148a和miRNA-21可靶向Rho相關(guān)卷曲螺旋形成的蛋白激酶1和抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，從而改善腸道屏障功能和緩解潰瘍性結(jié)腸炎，這表明乳中外泌體可在炎癥性腸病患者的腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)配方中作為一種營(yíng)養(yǎng)素[64-65]。Yun等[66]發(fā)現(xiàn)牛乳中外泌體可提高骨質(zhì)疏松模型小鼠的骨密度和恢復(fù)腸道菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而用于預(yù)防骨質(zhì)疏松，改善骨骼的健康。Arntz等[67]報(bào)道乳中外泌體可通過直接或間接調(diào)節(jié)腸道中的T細(xì)胞的分化治療自身免疫性關(guān)節(jié)炎。Wang等[68]發(fā)現(xiàn)，牛乳外泌體可減輕腸隱窩上皮細(xì)胞在氧化應(yīng)激下的嘌呤核苷酸代謝，改善細(xì)胞能量狀態(tài)，對(duì)氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用。Gao等[69]發(fā)現(xiàn)，牛乳外泌體中的miRNAs可顯著提高大鼠腸上皮細(xì)胞(IEC-6)中脯氨酸羥化酶的表達(dá)，降低低氧誘導(dǎo)因子-α及其下游的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，進(jìn)而減輕缺氧對(duì)腸道的損傷。此外，牛乳外泌體中的ncRNAs可能在免疫調(diào)節(jié)、表觀遺傳調(diào)節(jié)、代謝疾病和靶向治療中發(fā)揮生物學(xué)作用，然而，關(guān)于牛奶外泌體中ncRNAs的來源、攝取和生理作用等的研究較少，還要很多問題亟待解決[70]。

牛乳源性外泌體的脂質(zhì)雙分子層不僅可提高藥物的溶解性，還可保護(hù)其化學(xué)成分不被降解。Munagala等[45]首次證明了牛乳源性外泌體可攜帶藥物并實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向性治療。Agrawal等[71]發(fā)現(xiàn)口服牛乳源性外泌體給藥與腹腔注射給藥具有相似的治療效果。因此，牛乳源性外泌體作為親水和親脂藥物(包括化療藥物)的載體具有巨大的潛力。

5.2 潛在風(fēng)險(xiǎn)

然而，目前對(duì)牛乳源性外泌體的生物學(xué)功能研究并不全面，仍存在很多爭(zhēng)議。流行病學(xué)家指出，牛乳源性外泌體可能會(huì)引入病原體從而引發(fā)一系列的疾病，還可能激活與衰老相關(guān)的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白1(mTORC1)的活性，降低人的壽命，增加死亡率[14,72]。首先，牛乳源性外泌體可增加巨大胎兒的發(fā)生率，有研究發(fā)現(xiàn)，懷孕期間牛奶攝入量與胎盤和出生體重變化呈正相關(guān)[73]。miRNA-21是牛乳中外泌體的標(biāo)志miRNAs[74-75]，可到達(dá)胎盤并促進(jìn)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKN1C、p57kip2)的缺失突變可導(dǎo)致5%～10%的嬰兒出現(xiàn)過度生長(zhǎng)綜合征、巨舌、腹壁缺損等現(xiàn)象[76-77]；而miRNA-21是直接靶向CDKN1C的因子之一[78]，進(jìn)一步提高巨大胎兒的發(fā)生率。其次，牛乳源性外泌體可誘發(fā)肥胖。外泌體中的miRNAs在間充質(zhì)干細(xì)胞形成的脂肪細(xì)胞中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用[79-80]。Wnt1和Wnt10b可抑制脂肪細(xì)胞形成，而外泌體中的miRNA-148a可抑制其表達(dá)，此外，miRNA-148a還可抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶家族(DNMT)的活性而促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化[81-83]。外泌體中的miRNA-21和miRNA-29b均可促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖分化[84-85]；miRNA-155可通過減弱棕色脂肪組織的分化和產(chǎn)熱，促進(jìn)白色脂肪組織的儲(chǔ)存，進(jìn)一步促進(jìn)肥胖[86]。此外，長(zhǎng)期暴露于miRNA-148a和miRNA-21可能會(huì)誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化，從而可能增加心血管發(fā)病率和死亡率[14]。外泌體中miRNA-155是侵入大腦的主要免疫調(diào)節(jié)miRNAs之一[46]，在α-突觸核蛋白(α-syn)相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮著核心作用[87]，可能是帕金森病發(fā)生的關(guān)鍵因子。最后，外泌體中的一些miRNAs在前列腺癌、乳腺癌和肝細(xì)胞癌等一系列疾病中也發(fā)揮作用[14]。

6 小 結(jié)

外泌體作為一種功能性的微型囊泡，不僅可介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，還在機(jī)體生理病理過程中發(fā)揮重要作用。已有研究表明，牛乳源性外泌體可調(diào)節(jié)腸道的菌群結(jié)構(gòu)，有利于免疫調(diào)控，以及緩解腸炎和骨質(zhì)疏松等疾病，表明牛乳源性外泌體可被機(jī)體有效利用，有望成為一種新型的功能性食品。此外，牛乳源性外泌體特殊的生物學(xué)結(jié)構(gòu)可使其成為實(shí)用的藥物載體，傳輸藥物作為疾病的靶向治療。但是，牛乳源性外泌體可能會(huì)傳遞某些有害的物質(zhì)，從而誘發(fā)疾病。因此，有必要全方位了解牛乳外泌體的生物學(xué)功能，從而為開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品提供理論依據(jù)。